Sự phân bố đặc biệt của yếu tố gây giảm oxy máu -1 trong tế bào ống thận được nuôi cấy có giảm tưới máu được mô phỏng bằng vị trí bọc ngoài
Mar 27, 2022
Liên hệ: Audrey Hu Whatsapp / hp: 0086 13880143964 Email:audrey.hu@wecistanche.com
Tomoko Honda1| Yosuke Hirakawa1 | Kiichi Mizukami2| Toshitada Yoshihara2| Tetsuhiro Tanaka1| Seiji Tobita2| Masaomi Nangaku
trừu tượng
Thiếu oxy mãn tính trong bể thận đóng một vai trò quan trọng trong sự tiến triển của mãn tínhquả thậndịch bệnh(Suy thận). Do đó, điều quan trọng là phải điều tra tình trạng thiếu oxy ở ống thận và hoạt động của yếu tố cảm ứng giảm oxy (HIF) -1 để đáp ứng với tình trạng thiếu oxy. Hiếm gặp mao mạch phúc mạc gây giảm tưới máu trong bệnh thận mạn; tuy nhiên, ảnh hưởng của giảm tưới máu đối với HIFs hiếm khi được nghiên cứu. Chúng tôi đã gây ra hiện tượng giảm tưới máu do đặt các tấm phủ ở ngườiquả thận-2 ô và quan sát thấy một gradient oxy dưới tấm phủ. Hóa tế bào miễn dịch của HIF -1 cho thấy sự hình thành hình bánh rán ở rìa của vùng dương tính với pimonidazole, chúng tôi đặt tên là "vòng HIF". Sức căng oxy của vòng HIF được ước tính nằm trong khoảng từ 4 mmHg đến 20 mmHg. Kết quả này không tương thích với kết quả của nghiên cứu trước đây cho thấy HIF -1 tích tụ trong vùng thiếu oxy với sức căng oxy đồng nhất. Chúng tôi đã quan sát thêm sự hiện diện của một gradient pH dưới một tấm bìa, cũng như sự thay đổi của vòng HIF do sự thay đổi độ pH của môi trường nuôi cấy, cho thấy rằng vòng HIF được hình thành do sự ức chế của HIF -1 liên quan đến pH thấp. Nghiên cứu này đã chứng minh rằng sự kích hoạt HIF -1 bắt chước trạng thái sinh lý trong các tế bào nuôi cấy bị giảm tưới máu.
TỪ KHÓAgiảm tưới máu, thiếu oxy, yếu tố gây giảm oxy, gradient oxy, pH
Cistanche herbangăn ngừa bệnh thận, bấm vào đây để lấy mẫu
1|GIỚI THIỆU
Tỷ lệ mắc bệnh mãn tínhquả thậndịch bệnh(Suy thận) đang gia tăng trên toàn thế giới khi xã hội già đi (Tonelli & Riella, 2014). Sự tiến triển của CKD là không thể phục hồi khi tổn thương thận đạt đến một mức độ nhất định và cuối cùng dẫn đến bệnh thận giai đoạn cuối (ESRD), bất kể bệnh cơ bản là gì. Sự xuất hiện này chỉ ra sự tồn tại của một "con đường chung cuối cùng." Theo các phân tích bệnh lý trước đây, sự suy giảm chức năng thận có tương quan chặt chẽ với tổn thương mô ống dẫn trứng hơn là tổn thương cầu thận. Đã có một số báo cáo chứng minh rằng xơ hóa thận gây ra tình trạng thiếu oxy mãn tính trong tubulointerstitium, và tình trạng thiếu oxy mô kẽ tubulointers này làm trầm trọng thêm CKD và dẫn đến ESRD. Bằng chứng này chỉ ra rằng tình trạng thiếu oxy mô kẽ đóng một phần trong con đường chung cuối cùng của CKD (Mimura & Nangaku, 2010; Nangaku, 2006). Cácquả thậnrất dễ bị thiếu oxy vì nhu cầu oxy cao, và sự tồn tại của một shunt oxy giữa các động mạch và tĩnh mạch nội thận (Nangaku, 2006; Welch et al., 2001; Zhang et al., 2014). Do đó, chúng tôi cho rằng điều cần thiết là phải khảo sát tình trạng thiếu oxy và đáp ứng với tình trạng thiếu oxy trong bể thận.
Phản ứng sinh học chính đối với tình trạng thiếu oxy trong cơ thể sống xảy ra thông qua con đường gây thiếu oxy (HIF) (Hypoxia, 2011; Semenza & Wang, 1992; Zhou và cộng sự, 2003). HIF bao gồm - và-đơn vị con. Mặc dù -subunit là thành phần hoạt động, nhưng -subunit bị phân huỷ khi có oxy. Trong điều kiện không độc hại, HIF- được hydroxyl hóa bởi miền prolyl hydroxylase (Ph.D.), làm cho nó có thể được nhận biết bởi chất ức chế khối u von Hippel-Lindau (VHL). Sự nhận biết này dẫn đến sự thay đổi và phân huỷ HIF- hydroxyl hoá trong proteasome ở khắp mọi nơi. Trong điều kiện thiếu oxy, HIF- tích tụ trong dịch bào, vì HIF- không hydroxyl hóa thoát ra khỏi sự thoái hóa. HIF- tích lũy được chuyển vị từ tế bào sang nhân, nơi nó dime hóa với HIF-, và hoạt động như một yếu tố phiên mã, thúc đẩy sự biểu hiện của các gen hạ lưu. Trong số ba dạng đồng dạng đã xác định của HIF- tiểu đơn vị — HIF -1, HIF -2 và HIF -3 —các tế bào biểu mô hình ống thượng thận được biết là biểu hiện HIF -1 (Tanaka et al ., 2016). Các nghiên cứu trước đây đã chỉ ra sự tích tụ HIF nhất thời hoặc theo khu vực trongquả thậnvới CKD (Goldfarb và cộng sự, 2006; Yu và cộng sự, 2012), và HIF này được kích hoạt khi giảm sức căng oxy trong mô hình CKD. Tình trạng rối loạn thiếu oxy trong bệnh thận mạn tính có thể do sự hiện diện của các yếu tố ức chế con đường HIF (Asai và cộng sự, 2016; Tanaka và cộng sự, 2013; Thangarajah và cộng sự, 2009). Tác dụng bảo vệ của sự hoạt hóa HIF đã được báo cáo trên một số mô hình động vật, bao gồm chuột mắc bệnh tiểu đường do streptozotocin gây ra và chuột cắt thận 5/6 (Deng và cộng sự, 2010; Nordquist và cộng sự, 2015). Bằng tiến sĩ. thuốc ức chế gần đây đã thu hút sự chú ý như các phương pháp điều trị mới cho bệnh thiếu máu thận ở bệnh nhân CKD (Akizawa và cộng sự, 2019; Chen và cộng sự, 2017, 2019; Coyne và cộng sự, 2017; Miyata và cộng sự, 2011; Pergola và cộng sự ., 2016; Provenzano và cộng sự, 2016). Tuy nhiên, các chi tiết về sự tiến triển của tình trạng thiếu oxy ở thận và cách thức tích tụ HIF xảy ra trongquả thậnvới CKD, vẫn còn mờ mịt. Quá trình hydroxyl hóa HIF- phụ thuộc vào oxy xảy ra trong tế bào, và do đó điều quan trọng là phải đo sức căng oxy trong và ngoài tế bào. Có một số phương pháp được sử dụng để đo độ căng oxy, bao gồm việc sử dụng vi điện cực hoặc chụp cộng hưởng từ phụ thuộc mức oxy trong máu (BOLD-MRI). Chúng tôi đã sử dụng kính hiển vi hình ảnh suốt đời phát quang (PLIM) để đo định lượng tình trạng oxy nội bào (Hirakawa và cộng sự, 2017; Yoshihara và cộng sự, 2015). BTPDM1 là thuốc nhuộm phát quang dựa trên phức hợp iridi (III) BTP, (bp) 2Ir (acc) (bp=benzoat-pyridin, aac=axetylaxeton) với nhóm đimetylamino cation, được thụ động hóa phân bố trong các lysosome nội bào. Nó được tổng hợp như một thăm dò gần đây để đo áp suất oxy nội bào (Yoshihara và cộng sự, 2015). PLIM với BTPDM1 cho phép thu thập hình ảnh có độ phân giải cao về áp suất riêng phần của oxy trong tế bào ống thận trên bề mặt thận của chuột bình thường, cung cấp dữ liệu cho thấy sự hiện diện của gradient oxy, ngay cả trong thận bình thường (Hirakawa và cộng sự, 2018 ).
Có các gradient oxy trong các cơ quan sống, bao gồmthận, ngay cả trong điều kiện bình thường (Hirakawa và cộng sự, 2018; Kietzmann, 2017; Zhdanov và cộng sự, 2015), và do đó, các gradient như vậy cũng có thể được mong đợi ở CKD. Giảm tưới máu là do hiếm gặp vi mạch trong bệnh thận mạn, trong đó tổn thương cầu thận tiến triển dẫn đến giảm lưu lượng máu mao mạch phúc mạc, làm trầm trọng thêm tình trạng xơ hóa mô kẽ. Xơ hóa mô kẽ làm suy yếu sự khuếch tán và cung cấp oxy cho các tế bào ống, và dẫn đến sự hiếm hoi của vi mạch, làm trầm trọng thêm tình trạng thiếu oxy mô kẽ ống thận (Mimura & Nangaku, 2010; Nangaku, 2006). Tuy nhiên, các tác động sinh học của giảm tưới máu vẫn còn ít người biết đến, bởi vì hầu hết các nghiên cứu đã điều tra tác động của tình trạng thiếu oxy và HIF -1 lên các tế bào nuôi cấy trong điều kiện tưới máu đồng nhất và căng thẳng oxy (Rexius-Hall et al., 2017). Các nghiên cứu trước đây đã chứng minh rằng các tế bào được nuôi cấy một lớp được bao phủ bởi một lớp màng bọc cung cấp một mô hình giảm tưới máu tốt được tạo ra bởi một rào cản đối với sự khuếch tán trong môi trường nuôi cấy. Quá trình giảm tưới máu được mô hình hóa có liên quan đến một gradient oxy vì một tấm che ngăn cản sự khuếch tán oxy từ đỉnh của môi trường đến các tế bào (Pitts & Toombs, 2004; Takahashi & Sato, 2010; Yoshihara et al., 2015). Trong một lớp tế bào nuôi cấy được bao phủ bởi một lớp màng bọc, sức căng oxy nội bào giảm xuống theo khoảng cách từ mép của lớp màng bọc vì sự khuếch tán oxy vào tế bào nuôi cấy bị hạn chế. Kết quả là, một gradient oxy được hình thành từ rìa đến trung tâm của tấm phủ, và sức căng oxy nội bào có thể giảm xuống một phạm vi thiếu oxy ở trung tâm của tấm phủ (Takahashi & Sato, 2010; Yoshihara et al., 2015) . Trong nghiên cứu hiện tại, chúng tôi tập trung vào sự hoạt hóa HIF và điều tra xem có sự thay đổi biểu hiện HIF không phụ thuộc vào oxy khi có hiện tượng giảm tưới máu với một gradient oxy hay không. Vì giảm tưới máu với gradient oxy tồn tại trong ống thận in vivo, nên việc quan sát các tác động không phụ thuộc oxy lên sự biểu hiện HIF trong mô hình coverlip có thể cung cấp hiểu biết về cơ chế cơ bản của sự thiếu hụt HIF- tích tụ trong bệnh thận mạn.
chiết xuất cistanchecho thận
2|NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.1|Nuôi cấy tế bào
Tế bào nuôi cấy được ủ trong tủ ấm được làm ẩm với 5% CO2. Quá trình ủ khử khí được thực hiện trong tủ ấm CO2 / đa khí cá nhân APM -30 D (Astec). Anoxia được gây ra với túi anoxia, AnaeroPack và bộ canh tác kỵ khí #A -13 (Mitsubishi Gas Chemical).
HK -2 tế bào (Homo sapiens, con ngườiquả thận, đực, CRL - 2190, ATCC, RRID: CVCL _0302), một dòng tế bào biểu mô ống lượn gần bất tử từ thận người trưởng thành bình thường, được nuôi cấy trong hỗn hợp dinh dưỡng / môi trường Eagle's F {{2} đã được sửa đổi của Dulbecco. } Giăm bông (DMEM / F12) (D8062, Sigma Aldrich) chứa 10% huyết thanh bò thai (FBS) (F7524, Sigma Aldrich) và dung dịch penicillin-streptomycin (15070063, Thermo Fisher Scientific) trong đĩa nuôi cấy 10 cm. Để đi qua, tế bào HK -2 được phân ly bằng trypsin (204-16935, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) và được ly tâm ở 300 g trong 5 phút.
Tế bào ung thư cổ tử cung HeLa và phôi thai ngườiquả thậntế bào 293 (HEK293) được nuôi cấy trong DMEM với glucose thấp (1000 mg / L) (D6046, Sigma Aldrich) chứa 5% FBS trong đĩa nuôi cấy 10 cm. Các ô này được chuyển thành HK -2 ô.
Tế bào biểu mô ống gần thận (RPTECs) (CC - 2553, Cambrex) được duy trì bằng cách sử dụng bộ dụng cụ RenaLifeTM Comp (LRC-LL0025, Lonza Ltd.). Để đi qua, RPTEC được phân tách bằng trypsin, được trung hòa bằng Dung dịch trung hòa Trypsin (CC -5002, Lonza Ltd.), và được ly tâm ở 200 g trong 5 phút.
2.2|Thiết lập mô hình giảm tưới máu bằng cách đặt tấm bìa cứng
Các tấm bìa hình tròn có đường kính 15 mm (C015001, Matsunami) đã được làm sạch bằng sóng siêu âm và được bảo quản trong etanol 99,5% trước khi sử dụng. Hai phương pháp đã được sử dụng, dựa trên việc quan sát các tế bào bên ngoài tấm bìa.
Các tế bào nuôi cấy một lớp được kẹp giữa một miếng bìa và đáy đĩa (Hình S1a, b), hoặc một phương pháp thay thế (Hình S1c), như được mô tả bên dưới. Phương pháp truyền thống hoặc phương pháp thay thế đã được lựa chọn để thiết lập mô hình bìa cứng của chúng tôi cho hình ảnh trực tiếp, cho dù là hình ảnh oxy hay hình ảnh PH. Đối với phương pháp hóa tế bào miễn dịch (ICC), phương pháp thay thế đã được chọn, vì khi sử dụng phương pháp truyền thống, phần lớn các tế bào thường tách ra khỏi đáy đĩa trong quá trình loại bỏ vỏ bọc để cố định tế bào (Hình S2a).
2.2.1|Phương pháp truyền thống
Vào Ngày 1, các ô được đặt trên đáy của đĩa làm bằng thủy tinh 27 mm (3910-035, Iwaki) ở mức hợp lưu 1 0 0 phần trăm * (khoảng 5,0 × 105 / đĩa). Chúng được nuôi trong DMEM / F12 chứa 10% FBS mà không có dung dịch kháng sinh qua đêm. Vào ngày thứ 2, một tấm bìa được đặt trên các tế bào được nuôi cấy trong khoảng thời gian được chỉ định (Hình S1b).
2.2.2|Phương pháp thay thế
Tế bào được tạo hạt trên một tấm bìa trong đĩa nuôi cấy 35 mm ở điểm hợp lưu 1 0 0 phần trăm (khoảng 5,0 × 105 / đĩa) vào Ngày.
1. Chúng được nuôi trong DMEM / F12 có chứa 10% FBS mà không có dung dịch kháng sinh qua đêm. Vào Ngày thứ 2, nắp trượt đã được đảo ngược để gắn bề mặt của các ô của nó vào đáy của một đĩa thủy tinh mới 27 mm trong một khoảng thời gian xác định (Hình S1c).
Chúng tôi cũng tạo ra một mô hình bìa cứng bằng cách sử dụng các bìa hình tròn có đường kính 10 mm (CS01005, Matsunami) (Hình S2b).
2.3|Chụp oxy sống với BTPDM1
Tế bào nuôi cấy được chuẩn bị vào Ngày 1, như đã mô tả ở trên. Vào ngày thứ 2, các tế bào được rửa hai lần bằng dung dịch Muối cân bằng của Hanks (HBSS) (H8264, Sigma Aldrich) và được ủ với 500 nM BTPDM1, một loại thuốc nhuộm ưa mỡ cation dựa trên iridium được sử dụng như một đầu dò lân quang nội bào (Yoshihara et al., 2015), trong DMEM / F12 không có màu đỏ phenol (21041-025, Thermo Fisher Scientific) trong 30 phút. Sau khi các tế bào được rửa hai lần bằng HBSS, chúng được kẹp giữa một miếng bìa và đáy đĩa, như đã mô tả ở trên. Cường độ lân quang từ BTPDM1 trong các tế bào nuôi cấy được bao phủ bởi một tấm bìa được quan sát bằng cách sử dụng bộ lọc kích thích và phát xạ, và lân quang BTPDM1 (Hirakawa và cộng sự, 2015) được phát hiện bằng kính hiển vi huỳnh quang, BZ-X710 (Keyence Corporation). Hình ảnh thu được từ kính hiển vi huỳnh quang ngược được điều chỉnh độ sáng và độ tương phản bằng phần mềm phân tích BZ-X.
2,4|Hóa tế bào miễn dịch
Các tế bào trên một miếng bìa được nuôi cấy với 200 µM pimonidazole HCl (HP 3-100, Hypoxyprobe, Inc.) trong DMEM / F12 mà không có màu đỏ phenol trong 1 giờ, sau đó miếng phủ được lật và gắn vào một đĩa thủy tinh có nắp, như đã được miêu tả ở trên. Sau đó, các tế bào được nuôi cấy trong DMEM / F12 không có màu đỏ phenol trong một khoảng thời gian xác định. Khi không sử dụng chất cản quang pimonidazole, việc xử lý trước với pimonidazole đã bị bỏ qua.
Sau khi hoàn thành giai đoạn nuôi cấy, mỗi tấm bìa được thu thập và các tế bào ngay lập tức được cố định bằng metanol / axeton (1: 1) trên nước đá, ở đó chúng được giữ nguyên trong 30 phút. Sau khi rửa hai lần bằng nước muối đệm phosphat của Dulbecco (PBS) (D5652, Sigma Aldrich), màng tế bào được thấm trong 30 phút, được ủ với 5% albumin huyết thanh bò (BSA) (A3059, Sigma Aldrich) trong 30 phút, và sau đó với khối protein không có huyết thanh (X0909, DAKO) trong 10 phút. Các tế bào được nhuộm bằng kháng thể đầu tiên và sau đó bằng kháng thể huỳnh quang thứ hai. Danh sách các kháng thể đầu tiên được đưa ra trong Bảng S1. FITC-globulin miễn dịch kháng thỏ đa dòng FITC (F0205, pha loãng 1:20, DAKO) được sử dụng làm kháng thể đầu tiên nếu vật chủ là thỏ. Kháng thể huỳnh quang Alexa Fluor 594 streptavidin (S11227, độ pha loãng 1: 500, Thermo Fisher Scientific) được sử dụng làm kháng thể đầu tiên nếu vật chủ là chuột, tiếp theo là IgG chống chuột được đánh dấu biotin (H cộng với L) (BA {{23} }, Độ pha loãng 1: 1000, Phòng thí nghiệm Vector), làm kháng thể thứ hai. Nhuộm hạt nhân được thực hiện bằng cách sử dụng bisBenzimide H 33342 trihydrochloride (B2261, Sigma Aldrich) cho mỗi mẫu.
Các tín hiệu huỳnh quang được quan sát bằng kính hiển vi huỳnh quang ngược, BZ-X710 (Keyence Corporation) với các bộ lọc sau: Texas Red với bước sóng kích thích (Ví dụ) là 560/40 nm, bước sóng phát xạ (Em) là 630/75 nm, GFP ( Ví dụ: 470/40 nm, Em: 525/50 nm) và DAPI (Ví dụ: 360/40 nm, Em: 460/50 nm). Hình ảnh được điều chỉnh độ sáng và độ tương phản bằng phần mềm phân tích BZ-X.
2,5|ICC của HIF của HK -2 tế bào được xử lý bằng clorua coban
Phương pháp thay thế đã được sửa đổi để tạo ra mô hình bìa của tế bào HK -2 được xử lý bằng clorua coban. Tế bào HK -2 được gieo ở mật độ nửa hợp lưu (2,5 × 105 / đĩa) trên một tấm bìa vào Ngày 1 và được xử lý bằng 300 µM coban clorua hexahydrat (C 8661, Sigma Aldrich) trong 16 giờ Ngày thứ 2. Vào ngày thứ 3, tấm phủ đã được lật ngược để gắn các bề mặt tế bào vào đáy của đĩa thủy tinh 27 mm mới trong 3 giờ, và ICC của HIF đã được thực hiện.
2,6|Thấm phương tây
Để khảo sát sự tích tụ HIF {{0}} dưới các áp suất oxy khác nhau và ở các mức pH khác nhau, 1. 0 × 1 0 6 HK -2 tế bào trên đĩa nuôi cấy 10 cm được ủ trong môi trường normoxia, 2% oxy, 1% oxy, hoặc thiếu oxy, trong 5 giờ, hoặc trong DMEM / F12 ở pH 7,4, pH 6,0, hoặc pH 5,0 trong 5 giờ.
Các tế bào này được ly giải trong bộ đệm RIPA có chứa 5 0 mM Tris-đệm (pH 8. 0), 15 0 mM NaCl, 0. 5 w / v phần trăm natri deoxy- cholate, 0,1 w / v phần trăm SDS và 1,0 w / v phần trăm NP40.
Đối với thấm phương tây, dung dịch đệm mẫu SDS chứa {{0}}. 35 M Tris-HCl (pH 6,8), 1 0 phần trăm SDS, 36 phần trăm glycerol, 0,012 phần trăm bromophenol blue và 0,1 M dithiothreitol (DTT) đã được thêm vào các protein. Protein có chứa đệm mẫu SDS được rửa giải bằng cách đun sôi ở 95 độ trong 5 phút.
Các protein được phân tách bằng điện di trên gel polyacrylamide 1 0 phần trăm SDS. Sau đó, các protein được chuyển vào màng AmershamTM HybondTM PVDF (10600023, GE Healthcare) trong đệm chuyển (48 mM Tris-base buffer, 39 mM glycine, 0,04% SDS và 20 v / v% methanol) bằng cách sử dụng Trans-Blot® Hệ thống truyền TurboTM (Bio-Rad). Màng được ủ ở nhiệt độ phòng với kháng thể chính, kháng thể kháng HIF1 (NB 100-134, độ pha loãng 1: 500, Sinh học Novus, RRID: AB _350071) và kháng thể kháng actin (A2066 , Độ pha loãng 1: 2000, Sigma Aldrich, RRID: AB _476693), và sau đó trong kháng thể thứ cấp, globulin miễn dịch chống thỏ đa dòng của dê / HRP (P0448, độ pha loãng 1: 10000, DAKO, RRID: AB {{26 }}). PierceTM ECL Plus Western Blotting Substrate (32132, ThermoFisher Scientific) được sử dụng để phát hiện. Hóa chất phát quang được quan sát bằng cách sử dụng Máy phân tích quang ảnh ImageQuantLAS4000mini (GE Healthcare). Tính tái lập được xác nhận bằng cách thực hiện ít nhất ba thí nghiệm độc lập. Cường độ của các dải được định lượng bằng phần mềm ImageJ của Viện Y tế Quốc gia (Schneider et al., 2012).
2,7|Thử nghiệm phóng viên Luciferase
Một thử nghiệm báo cáo luciferase đã được thực hiện để đo sự tích tụ HIF1 trong quá trình ủ nuôi cấy thiếu oxy đồng nhất. Trước đây, chúng tôi đã xây dựng một gen luciferase được gắn thẻ được điều khiển bởi yếu tố đáp ứng với tình trạng thiếu oxy (HRE) và phát triển Vectơ phóng viên đáp ứng với tình trạng thiếu oxy (Cấu tạo gen chuyển). Điều này được xây dựng từ các bản sao song song của HRE từ gen yếu tố tăng trưởng nội mô mạch máu chuột được nhân bản phụ vào vùng 5 'của đơn vị phiên mã am CMV-promoter-luciferase (tiền Luc) (Chiang và cộng sự, 2011; Tanaka và cộng sự al., 2004).
Tế bào HK {{0}} ở nồng độ 1,0 × 105 mỗi giếng được chuẩn bị trong 12- đĩa nuôi cấy giếng (150628, Thermo Fisher Scientific). Các tế bào được đồng chuyển nạp với 500 ng vectơ pGL 3- HRE-luciferase cơ bản và 30 ng vectơ điều khiển pRL-SV40 Renilla luciferase (Promega), sử dụng 2 µl Thuốc thử truyền nhiễm HD FuGENE® (E2311, Promega) mỗi Tốt. Tế bào HK -2 đồng truyền nhiễm với 500 ng vectơ luciferase đom đóm cơ bản và 30 ng vectơ điều khiển luciferase ofpRL-SV40 (Promega) được sử dụng làm đối chứng âm tính.
Các tế bào được truyền bệnh được ủ trong điều kiện thiếu oxy, 2% thiếu oxy, 1% thiếu oxy, hoặc một túi thiếu oxy, trong 5 giờ. Sau đó, các tế bào được thu hoạch bằng cách sử dụng 100 µl đệm phân giải protein thụ động, cho xét nghiệm luciferase kép. Một máy đo độ sáng LB9507 (EG và Berthold) đã được sử dụng cho các phép đo. Để điều chỉnh hiệu quả chuyển nạp, giá trị tương đối của đơn vị ánh sáng luciferase đom đóm được chia cho giá trị của Renilla luciferase.
cistanche cho ed
2,8|Phân tích quá trình apoptosis
Tế bào nuôi cấy được bao phủ bằng một tấm bìa trong 0 phút, 15 phút, 30 phút, 1 giờ, 3 giờ, 6 giờ và 24 giờ, sau đó được thu thập bằng trypsin. Các tế bào được xử lý bằng 3% hydrogen peroxide (081- 04215, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) trong 30 phút được điều chế như một phương pháp kiểm soát apoptotic. Phân tích định lượng quá trình apoptosis được thực hiện bằng cách sử dụng Muse Annexin V và Bộ dụng cụ tế bào chết (MCH100105, Millipore) trong Máy phân tích tế bào Muse ™ (Millipore), theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
2,9|Định lượng PCR thời gian thực (qRT-PCR)
Tách chiết RNA tổng số và tổng hợp cDNA được thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất cho RNAiso Plus (9109, Takara) và PrimeScript ™ RT Master Mix (RR036B, Perfect Real Time) (Takara) tương ứng. PCR thời gian thực được thực hiện bằng THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix (QPS - 201, Toyobo) trong Hệ thống phát hiện PCR thời gian thực CFX Connect (Bio-Rad). Mức độ phiên mã được bình thường hóa thành mức độ biểu hiện -actin mRNA. qRT-PCR được thực hiện ba lần bằng cách sử dụng cặp mồi dành riêng cho gen. HIF -1 được khuếch đại bằng cách sử dụng mồi thuận, 5′-CCATTAGAAAGCAGTTCCGC -3 ′ và ngược, 5′-TGGGTAGGAGATGGAGATGC -3 ′. -actin được khuếch đại bằng cách sử dụng mồi 5′-TCCCCCAACTTGA GATGTATGAAG -3 ′ và ngược 5′-AACTGGTCTCAAG TCAGTGTACAGG -3 ′.
2,10|Chuyển nạp với siRNA
Để khảo sát sự hạ gục HIF -1 do RNAi gây ra trong các ô HK -2, 5. 0 × 104 HK -2 tế bào trên mỗi giếng đã được chuẩn bị trong các đĩa sáu giếng. Hai loại RNAi — HIF -1 siRNA (siHIF -1 # 1 [HSS104774, Thermo Fisher Scientific] và siHIF -1 # 2 [HSS104775, ThermoFisher Scientific]) - được sử dụng với Lipofectamine RNAiMAX Thuốc thử truyền nhiễm (Thermo Fisher Scientific). Để kiểm soát âm tính, Kiểm soát âm tính Stealth RNAi ™ siRNA Med GC Duplex # 3 (12935-113) đã được sử dụng; 1,5 µl mỗi siRNA và 5 µl RNAiMAX được trộn lẫn. Tế bào được truyền siRNA được ủ trong điều kiện không ôxy hoặc thiếu ôxy (1 phần trăm O2) trong 48 giờ và RNA được chiết xuất. Hiệu quả của việc hạ gục-HIF -1 đã được kiểm tra bằng cách sử dụng qRT-PCR.
2,11|Hình ảnh trực tiếp các hiệu ứng của độ dốc PH
Chúng tôi hình dung gradient pH nội bào của các tế bào sống dưới một tấm bìa. Tế bào được xử lý bằng Chỉ thị pH nội bào pHrodo Green AM (p35373, ThermoFisher Scientific) theo hướng dẫn của nhà sản xuất, trước khi thực hiện mô hình coverlip. Kính hiển vi huỳnh quang ngược, BZ-X710 (Keyence Corporation) với bộ lọc GFP được sử dụng để quan sát sự chuyển đổi thời gian của gradient cường độ huỳnh quang dưới một tấm phủ.
2,12|Phân tích định lượng vòng HIF
2.12.1|Vị trí của vòng HIF
Chúng tôi đo khoảng cách của các vòng HIF và các khu vực dương tính với pimonidazole từ các cạnh của tấm phủ bằng ImageJ, như sau. Diện tích của các vòng tròn bên ngoài và bên trong của vòng HIF và vòng tròn dương tính pimonidazole đã được xác định, và bán kính của mỗi vòng tròn được tính toán. Mỗi giá trị được trừ đi 7,5 mm, là bán kính của một tấm bìa 15 mm, để tính khoảng cách của nó từ một cạnh của tấm bìa. Ba thí nghiệm độc lập về ICC của HIF trong mỗi điều kiện đã được thực hiện.
2.12.2|Định nghĩa vòng HIF
Chúng tôi sử dụng hình ảnh huỳnh quang thu được từ mô hình coverlip được ủ trong môi trường không oxy và pH trung tính. Chúng tôi đã xác định vị trí của vòng HIF và bên ngoài và bên trong của nó là 2,5–3. 0 tỷ lệ (0. 22 - 0. 45 mm), 0. 5 –1. 0 tỷ lệ (1,12– 1,35 mm) và 5. 0 - 5,5 tỷ lệ (2,24–2,47 mm) từ cạnh bìa, tương ứng, sử dụng ImageJ. Chúng tôi đã đo năm trang web có -1 tín hiệu HIF trên mỗi mẫu và tính giá trị trung bình. Ba thí nghiệm độc lập về ICC của HIF đã được thực hiện.
bột chiết xuất cistanche
2,13|Đo phân áp oxy bằng hình ảnh PLIM
2.13.1|Xây dựng đường chuẩn để đo áp suất oxy
Đường chuẩn của ô HK -2 đã được tạo, dựa trên phương pháp được mô tả trong báo cáo trước của chúng tôi (Yoshihara và cộng sự, 2015). Tế bào HK -2 được nạp 500 nM BTPDM1 trong 30 phút được nuôi cấy trong tủ ấm đa khí có thể thay đổi nồng độ oxy được trang bị kính hiển vi huỳnh quang ngược được kết nối với hệ thống đo tuổi thọ. Một đường chuẩn dựa trên phân tích Stern-Volmer được xây dựng bằng cách sử dụng thời gian tồn tại lân quang (PL) của tế bào HK -2 dưới một số áp suất oxy khác nhau bằng cách sử dụng
Phương trình (1)
trong đó τp đại diện cho PL theo pO2, τ 0 đại diện cho PL trong quá trình khử oxy, kq đại diện cho hằng số tốc độ dập tắt và pO2 đại diện cho áp suất riêng phần của oxy. Sử dụng đường chuẩn này, áp suất oxy có thể được tính toán từ PL.
2.13.2|Hình ảnh PLIM của một mô hình bìa cứng
HK -2 ô được tải với 500 nM BTPDM1 trong 30 phút đã được chuẩn bị. Một mô hình coverlip được xây dựng và nuôi cấy trong tủ ấm đa khí có thể thay đổi nồng độ O2 được trang bị kính hiển vi huỳnh quang đảo ngược, được kết nối với hệ thống đo tuổi thọ.
Hình ảnh hiển vi hình ảnh có thời gian tồn tại của photpho (PLIM) được ghi lại bằng cách sử dụng một ống vi huỳnh quang ngược được trang bị hệ thống quét đồng tiêu (Hirakawa và cộng sự, 2018). Hình ảnh PLIM thu được sau 30 phút ủ trong 21 phần trăm O2 hoặc 4 phần trăm O2. Bốn hình ảnh PLIM cho mỗi mẫu, từ các vùng trên, dưới, trái và phải gần mép bìa kẹp, đã được thực hiện, để xác định PL trung bình, có tính đến sự thay đổi của PL trong một tờ bìa.
2.13.3|Nhận dạng vòng HIF trong hình ảnh PLIM
Pimonidazole dương tính dưới 10 mmHg phân áp oxy. Theo đường chuẩn, tương đương PL của 10 mmHg phân áp oxy là 4034,6 ns, vì vậy có thể xác định được đường bên ngoài của vòng tròn pimonidazole trong hình ảnh PLIM. Sau đó, các vị trí của vòng HIF bên ngoài và bên trong trong ảnh PLIM có thể được tìm thấy bằng cách sử dụng phân tích định lượng khoảng cách. Chúng tôi đo phạm vi PL trung bình tương đương với vòng HIF trong 21 phần trăm O2 và 4 phần trăm O2.
2.13.4|Đo áp suất oxy của vòng HIF
Chúng tôi đã tính toán phạm vi áp suất oxy của vòng HIF từ PL, sử dụng đường chuẩn. Hình ảnh PLIM được phân tích bằng SPCImage 5. 0 (Becker & Hickl GmbH).
2,14|Phân tích thống kê
Thử nghiệm của Dunnett được sử dụng để so sánh các nhóm thực nghiệm và nhóm đối chứng, và các giá trị <0,05 được="" coi="" là="" chỉ="" ra="" sự="" khác="" biệt="" có="" ý="" nghĩa="" thống="" kê.="" bài="" kiểm="" tra="" t="" của="" học="" sinh="" được="" sử="" dụng="" để="" so="" sánh="" ba="" nhóm="" trở="" lên="" và="" giá="" trị="" p="" điều="" chỉnh="" bonferroni="" đã="" được="" áp="" dụng.="" tất="" cả="" các="" phân="" tích="" thống="" kê="" được="" thực="" hiện="" bằng="" jmp="" pro="" ver13.2.1="" (sas).="" các="" giá="" trị="" được="" giả="" định="" là="" bắt="" nguồn="" từ="" một="" tổng="" thể="" phân="" bố="" chuẩn="" và="" được="" thể="" hiện="" dưới="" dạng="" giá="" trị="" trung="" bình="" ±="" độ="" lệch="" chuẩn="">
cistanche là gì
3|KẾT QUẢ
3.1|Sự hình thành gradient oxy trong mô hình giảm tưới máu
Chúng tôi đã xác nhận sự tồn tại của một gradient oxy trong mô hình giảm tưới máu được tạo ra bởi vị trí các lớp phủ bằng cách đánh giá trực tiếp sức căng oxy, sử dụng hiện tượng lân quang. Phép đo cường độ lân quang có thể dự đoán xu hướng gần đúng của áp suất oxy (Hirakawa và cộng sự, 2015; Yoshihara và cộng sự, 2015). Chúng tôi đã quan sát cường độ phát quang của mô hình bao phủ của các tế bào HK -2 được xử lý bằng BTPDM1. Hình ảnh về cường độ phát quang cho thấy tình trạng thiếu oxy ở hầu hết khu vực bên trong tấm bìa, nhưng không có tình trạng thiếu oxy ở gần mép, một quan sát cho thấy sự tồn tại của một gradient oxy xung quanh mép của tấm phủ trong các tế bào HK -2 được bao phủ bởi một bìa kẹp (Hình 1a). Vì cường độ lân quang phụ thuộc vào nồng độ của đầu dò và vào thời gian phát quang, phép đo thời gian phát lân quang (PL) rất hữu ích để phân tích định lượng áp suất oxy (Yoshihara và cộng sự, 2015). Do đó, để đo định lượng sức căng oxy của các tế bào được nuôi cấy xung quanh mép của một tấm bìa, chúng tôi thu được hình ảnh PLIM của các tế bào HK -2 được bao phủ bởi một tấm bìa trong 30 phút (Hình 1b). PL mở rộng khi khoảng cách từ mép của tấm bìa tăng lên. Chúng tôi xác nhận rằng lực căng oxy, được tính toán bằng đường chuẩn (Hình S3), giảm khi khoảng cách từ mép của tấm phủ tăng lên, cung cấp bằng chứng cho sự tồn tại của một gradient oxy xung quanh mép của tấm phủ (Hình 1c). Kiểm tra đặc điểm thời gian của cường độ lân quang chỉ ra rằng gradient oxy bắt đầu hình thành 10 phút sau khi đặt tấm phủ
(Hình 1d).
3.2|Phân phối HIF -1 duy nhất trong mô hình giảm tưới máu, "vòng HIF"
Chúng tôi đã kiểm tra sự phân bố HIF -1 trong mô hình giảm tưới máu với một gradient oxy. ICC của các ô HIF -1 trong HK -2 cho thấy sự tăng cường hình bánh rán ở rìa của vùng dương tính với pimonidazole, mà chúng tôi gọi là "vòng HIF" (Hình 2a). Cường độ của tín hiệu HIF -1 trên vòng HIF cao hơn đáng kể so với các khu vực bên trong hoặc bên ngoài của nó (Hình 2b). Hiện tượng này đã được xác nhận bằng cách sử dụng ICC với một kháng thể HIF -1 khác (Hình S4a) hoặc các dòng tế bào hình ống khác (Hình S4b, c). Chúng tôi cũng thực hiện phân tích ICC về HIF -1 trong các loại tế bào nuôi cấy khác, chẳng hạn như tế bào ung thư cổ tử cung HeLa. Mặc dù độ bám dính yếu của các tế bào này với một tấm bìa làm cho việc đánh giá chi tiết sự phân bố HIF -1 trở nên khó khăn, chúng tôi đã quan sát thấy sự tăng cường hình bánh rán của HIF -1 trong các ô HeLa (Hình S4d).
Vòng HIF và vùng dương tính với pimonidazole bắt đầu hình thành vài giờ sau khi đặt tấm phủ và vòng HIF xuất hiện tĩnh sau 3 giờ (Hình 2c). Việc đánh sập HIF -1 dẫn đến sự biến mất của tín hiệu HIF -1, bao gồm cả vòng HIF (Hình 2d, Hình S4e), cho biết rằng vòng HIF phụ thuộc vào HIF -1.
Để nghiên cứu khả năng sự hình thành vòng HIF phụ thuộc vào oxy, chúng tôi đã điều tra sự phân bố của HIF -1 trong mô hình coverlip trong quá trình ủ với các lực căng oxy khác nhau. Chúng tôi đặt một đĩa vào các khoang thiếu oxy với các độ căng oxy khác nhau ngay sau khi tạo mô hình nắp đậy. Trong quá trình ủ thiếu oxy, chúng tôi quan sát thấy rằng cả vòng HIF và vùng dương tính với pimonidazole dường như mở rộng ra bên ngoài (Hình 3a). Chúng tôi đo khoảng cách của mỗi vòng HIF và khu vực dương tính với pimonidazole tính từ mép của một tấm bìa dưới normoxia, 4 phần trăm O2 và 1 phần trăm O2 ủ. Cả vòng HIF và vùng dương tính với pimonidazole đều mở rộng ra ngoài khi sức căng oxy xung quanh giảm (Hình 3b). Những kết quả này chỉ ra rằng vòng HIF phụ thuộc vào HIF -1 và sức căng oxy.
Để xác nhận rằng sự tích tụ hình bánh rán là một hiện tượng cụ thể của HIF, chúng tôi đã thực hiện ICC với các gen quản lý trong mô hình coverlip. Các tín hiệu GAPDH và actin được duy trì trên toàn bộ khu vực của một tấm bìa và có thể so sánh được giữa vùng của vòng HIF và các vùng khác (Hình S5a, b).
3.3|Đo phạm vi áp suất oxy của vòng HIF
Chúng tôi đã xác nhận sự tăng cường hình vòng tròn của sự tích tụ HIF -1 trong các tế bào được nuôi cấy được bao phủ bởi một lớp vỏ bọc, một hiện tượng phụ thuộc vào sức căng oxy. Để xác định phạm vi của lực căng oxy liên quan, chúng tôi phân tích áp suất oxy của vòng HIF bằng kỹ thuật thời gian tồn tại lân quang. Chúng tôi thu được hình ảnh PLIM của mô hình bìa cứng sau 3 0 phút ủ trong 21 phần trăm O2 hoặc 4 phần trăm O2 (Hình 4a). Vòng HIF hình thành trên cạnh của vòng tròn pimonidazole trong ICC của HIF (Hình 3b). Chúng tôi đã xác định vị trí trong hình ảnh PLIM tương đương với vùng dương tính với pimonidazole trong ICC của HIF và sau đó xác định vị trí tương ứng với vòng HIF (Hình 4b), sử dụng phân tích định lượng dữ liệu khoảng cách từ vòng HIF và vùng dương tính với pimonidazole (Hình 3b). Chúng tôi cũng đo phạm vi PL của vòng HIF và sau đó sử dụng đường chuẩn (Hình S3) để tính áp suất oxy của vòng HIF trong 21 phần trăm O2 (4,20 [3,46–4,97] ~ 35,9 [28,5–44,9] mmHg) , và 4 phần trăm O2 (2,19 [0,21–4,32] ~ 20,4 [17,1–24,1] mmHg) (Hình 4c).
3,4|HIF -1 tích tụ dưới lực căng oxy đồng nhất
Mặc dù các tín hiệu yếu của HIF -1 bên ngoài vòng HIF trong mô hình khăn phủ có thể được cho là do thiếu oxy đủ, nhưng các tín hiệu bên trong vòng, nơi HIF -1 lẽ ra phải được kích hoạt mạnh hơn bởi sức căng oxy thấp hơn, phải được kiểm soát bởi một hiện tượng không phụ thuộc vào oxy. Để kiểm tra các hiện tượng gây ra sự thiếu tích tụ tối đa của HIF -1 trong vùng thiếu khí chỉ xảy ra trong mô hình giảm tưới máu, chúng tôi đã kiểm tra xem liệu có mối quan hệ nghịch đảo nào giữa sức căng oxy và sự tích tụ HIF -1 trong quá trình ủ không với lực căng oxy đồng nhất. Phân tích Western blot của các chất ly giải tế bào dưới các căng thẳng oxy đồng nhất khác nhau cho thấy sự gia tăng tích tụ HIF -1 trong quá trình ủ thiếu oxy (Hình 5a). Thử nghiệm báo cáo HRE-luciferase cũng chỉ ra rằng sự tích tụ HIF -1 được tăng lên khi sức căng oxy thấp hơn trong điều kiện sức căng oxy đồng nhất (Hình 5b). Những kết quả này chỉ ra rằng sự tích tụ của HIF -1 phụ thuộc vào sức căng oxy, với sự tích tụ tối đa quan sát được trong khoảng thiếu khí. Các đặc tính của HIF -1 phải khác nhau giữa mô hình giảm tưới máu và mô hình có sức căng oxy đồng nhất. Chúng tôi suy đoán rằng hiện tượng tích tụ HIF -1 duy nhất trong mô hình giảm tưới máu này có thể được xác định bởi một yếu tố khác với sức căng oxy.
3,5|Sự hình thành vòng HIF độc lập với Tiến sĩ
Chúng tôi đã kiểm tra xem liệu sự suy giảm HIF -1, một cơ chế có thể hình thành vòng HIF, có được điều chỉnh bên trong vòng HIF hay không. Ý tưởng này dường như không hợp lệ, bởi vì quá trình hydroxyl hóa của Tiến sĩ, một quá trình giới hạn tốc độ phân hủy HIF, cần oxy làm chất nền. Coban clorua được sử dụng rộng rãi như một chất ổn định HIF hóa học. Chúng tôi đã xây dựng mô hình bìa của các tế bào HK -2 được xử lý bằng clorua coban và thực hiện phân tích ICC của HIF. Tín hiệu HIF -1 không tăng bên trong vòng HIF, điều này trở nên không rõ ràng do tín hiệu HIF -1 bên ngoài vòng tăng lên (Hình 6c). ICC của tế bào HK -2 với PHD2, được cho là HIF prolyl hydroxylase chính trong các thí nghiệm nuôi cấy tế bào (Strowitzki và cộng sự, 2019), cho kết quả tương tự (Hình S6). Những kết quả này chỉ ra rằng trục PHD-VHL của sự suy giảm HIF không liên quan đến sự hình thành vòng HIF.
3,6|Tác động của pH đối với sự tích tụ HIF -1
Một báo cáo trước đây đã mô tả việc sử dụng một mô hình tấm bìa của các tế bào cơ tim có độ pH bên trong tấm bìa giảm xuống (Pitts & Toombs, 2 0 0 4). Chúng tôi đã nghiên cứu độ pH dưới một lớp phủ và tác động của nó đối với sự hình thành vòng HIF. Chúng tôi đã xử lý tế bào HK -2 bằng chất chỉ thị pH nội bào, cường độ huỳnh quang cho phép đánh giá độ pH trong tế bào. Hình ảnh trực tiếp cho thấy độ pH giảm ở hầu hết khu vực bên trong, nhưng không gần mép của tấm bìa, cho thấy sự tồn tại của một gradient pH xung quanh mép trong mô hình tấm phủ (Hình 6a). Phân tích định lượng về mối tương quan giữa cường độ huỳnh quang và khoảng cách từ mép của tấm phủ cho thấy rằng mức độ huỳnh quang trước đây được nâng lên khi khoảng cách tăng lên, một quan sát ủng hộ sự tồn tại của các gradient pH và oxy xung quanh mép tấm phủ (Hình 6b). Phân tích Western blot đối với dịch phân ly tế bào trong điều kiện nồng độ oxy đồng nhất cho thấy rằng ủ với môi trường pH 5,0 ngăn chặn sự tích tụ HIF -1 trong điều kiện thiếu oxy (Hình S7a – d). Chúng tôi cũng xác nhận rằng HIF -1 tích tụ trong điều kiện thiếu oxy trong các điều kiện pH khác nhau giảm xuống dưới pH 6,0 (Hình S8a – c).
Một báo cáo đã nhấn mạnh tầm quan trọng của các điều kiện có tính axit nhẹ, ở độ pH khoảng 6. 0. Theo nghiên cứu này, quá trình tái oxy hóa sau khi thiếu oxy đã axit hóa môi trường, gây ra sự cô lập nucleolar của VHL. Đổi lại, sự phân hủy HIF được ngăn chặn trong ống tủy C2C12, tế bào thần kinh PC12 và 786-0 tế bào ung thư thận (Mekhail và cộng sự, 2 0 0 4). Trong nghiên cứu của chúng tôi, không có sự thay đổi nào về sự phân bố VHL trong các tế bào hình ống giữa các vùng tích tụ HIF -1 và vùng mà nó bị triệt tiêu, trong một mô hình coverlip với các giá trị pH từ 5. 0 đến 7,4 (Hình S9a – c). Tế bào hình ống được tạo ra với nhiều điều kiện pH (Burke và cộng sự, 1999; Pavuluri và cộng sự, 2019; Raghunand và cộng sự, 2003), vì vậy chúng tôi đã nghiên cứu sự biến đổi của vòng HIF trong môi trường có độ pH khác nhau giá trị từ 5,0 đến 8,5. Vòng HIF được quan sát rõ ràng trong môi trường có pH 8,5 và 7,4 (Hình 6c). Vòng HIF cũng tồn tại ở pH 6,5 nhưng bị che khuất (Hình 6c). Tín hiệu HIF -1 bị suy yếu trong toàn bộ khu vực của một tấm bìa ở pH 5,0. (Hình 6c). Chúng tôi thực hiện phân tích định lượng thêm về mối quan hệ vị trí giữa vòng HIF và cạnh của vùng dương tính với pimonidazole (Hình 7a) và phát hiện ra rằng vị trí của vòng thay đổi tùy thuộc vào độ pH. Vòng trong có xu hướng mở rộng ra ngoài ở pH 6,5, so với pH 7,4, trong khi vòng ngoài co lại đáng kể vào trong ở pH 8,5, dựa trên cạnh của vùng dương tính với pimonidazole (Hình 7b, c). Chúng tôi cũng xác nhận rằng các hoạt động của gen giữ nhà được duy trì trong một mô hình che phủ trong điều kiện ủ axit (Hình S10). Do đó, pH dường như đóng một vai trò quan trọng trong cơ chế hình thành vòng HIF cơ bản.
4|THẢO LUẬN
Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã xác định được sự phân bố duy nhất của HIF -1 trong các tế bào ống thận, sử dụng mô hình giảm tưới máu gây ra bởi vị trí các tấm phủ. Chúng tôi nhận thấy rằng sự hình thành và duy trì của vòng HIF được điều chỉnh bởi áp suất oxy và độ pH, cả hai đều tồn tại trong một gradient ở cạnh bìa của mô hình coverlip. Dựa trên những kết quả này, chúng tôi đưa ra một cơ chế khả thi cho sự hình thành vòng HIF, liên quan đến việc HIF -1 tích tụ khi sức căng oxy giảm và sự tích tụ bị triệt tiêu do pH thấp trong một khoảng cách nhất định tính từ mép của tấm phủ (Hình 8 ).
Giảm tưới máu gây ra bởi sự hiếm gặp của vi mạch ở bệnh thận mạn (Mimura & Nangaku, 2 {{2 0}} 10; Nangaku, 2006). Trong nghiên cứu trước đây, chúng tôi đã sử dụng hình ảnh in vivo để chứng minh sự hiện diện của gradient oxy trong tế bào ống thận của thận chuột bình thường (Hirakawa et al., 2018). Sự căng thẳng oxy cũng được cho là không đồng nhất trong các tế bào hình ống trong bệnh thận mạn. Tuy nhiên, vẫn chưa rõ liệu sự tồn tại của giảm tưới máu với độ dốc oxy có ảnh hưởng đến hệ thống phòng thủ chống lại tình trạng thiếu oxy, HIF hay không. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã khảo sát sự phân bố HIF trong các tế bào ống lượn gần được nuôi cấy theo mô hình giảm tưới máu và phát hiện ra rằng gradient oxy trong các tế bào ống thận được nuôi cấy đã được mô hình hóa thành công bằng cách sử dụng một tấm phủ thủy tinh tròn. Bằng chứng từ các thí nghiệm sử dụng lực căng oxy đồng nhất chỉ ra rằng HIF -1, mà quá trình hydroxyl hóa và sự phân hủy sau đó chủ yếu phụ thuộc vào oxy, được tích lũy. Đó là lượng HIF -1 tăng khi sức căng oxy giảm. Tuy nhiên, trong mô hình bao phủ của chúng tôi, HIF -1 đã bị triệt tiêu trong vùng thiếu khí và có mức tích tụ cao nhất ở một khoảng cách nhất định so với một cạnh của vỏ bọc. Sự tích lũy HIF hình bánh rán này chưa từng được hiển thị trước đây. Chúng tôi chỉ ra rằng chuyển động của vòng HIF có thể được quan sát bất kể sức căng oxy của môi trường ấp, nhưng vị trí của nó phụ thuộc vào sức căng oxy. Phạm vi của sức căng oxy trên vòng HIF được đo khoảng 4–20 mmHg bằng cách sử dụng PLIM với BTPDM1. Hầu hết các nghiên cứu trước đây, tập trung vào các tế bào được nuôi cấy trong môi trường có sức căng oxy đồng nhất, nhận thấy rằng lượng protein HIF -1 tăng lên trong phạm vi thiếu oxy hoặc thiếu oxy (Ameri và cộng sự, 2002; Carrera và cộng sự. , 2014). Do đó, trong mô hình của chúng tôi, sự hình thành vòng HIF phải bị ảnh hưởng bởi một yếu tố khác ngoài lực căng oxy; nó độc lập với Ph.D., một quá trình giới hạn tốc độ của sự suy thoái HIF. Một bước đột phá trong việc làm sáng tỏ cơ chế hình thành vòng HIF là chúng tôi đã khám phá ra vai trò của gradient pH, cũng như gradient oxy, trong mô hình bao môi, hạn chế dòng chảy của môi trường tương tự như sự giảm tưới máu in vivo người mẫu. Trong mô hình giảm tưới máu này, pH nội bào giảm khi khoảng cách từ mép trượt của lớp phủ tăng lên, và một gradient pH được quan sát thấy xung quanh mép của lớp phủ. Chúng tôi đã chỉ ra rằng sự tích tụ HIF -1 bị ngăn chặn ở pH thấp, khoảng pH 5,0, so với ủ ở xung quanh pH trung tính trong điều kiện căng oxy đồng nhất. Mép ngoài của vòng HIF mở rộng ra bên ngoài ở pH 6,5 và mép trong của vòng HIF co vào trong ở pH 8,5, dựa trên mép của vùng dương tính với pimonidazole. Vòng HIF bị che khuất trong điều kiện axit và tín hiệu HIF -1 biến mất ở pH 5,0. Do đó, chúng tôi đã làm sáng tỏ tầm quan trọng của pH đối với sự hình thành vòng HIF trong một mô hình coverlip. Chúng tôi đã chứng minh khả năng rằng vòng HIF được hình thành do sự ngăn chặn sự tích tụ HIF -1 bởi độ pH thấp bên trong vòng.
Một số nghiên cứu trước đây sử dụng phương pháp coverlip đã sử dụng các tế bào ung thư. Theo một báo cáo sử dụng dòng tế bào ung thư gan người Hep3B, thể hiện sự dịch chuyển đỏ phụ thuộc vào oxy của protein huỳnh quang màu xanh lá cây (AcGFP1), hình ảnh trực tiếp của các tế bào được bao phủ bởi một tấm bìa hình chữ nhật cho thấy sự dịch chuyển đỏ khi khoảng cách từ một cạnh của tấm phủ tăng lên (Takahashi & Sato, 2 0 1 0). Phổ phát xạ của tế bào u gan chuyển từ bước sóng huỳnh quang của protein huỳnh quang màu xanh lục (GFP) sang màu đỏ khi sức căng oxy giảm. Trong một nghiên cứu khác, sức căng oxy của các tế bào SCC -7 với một tấm bìa tròn 15- mm được đo bằng kỹ thuật tồn tại lân quang. Sức căng oxy là 6,9 mmHg và 166 mmHg, được tính toán từ PL, tương ứng là 3,89 µs và 893 µs, 0–2 mm bên trong và 0–1 mm bên ngoài của mép bìa, tương ứng (Yoshihara và cộng sự, 2015). Phương pháp coverlip cũng đã được sử dụng với các tế bào cơ tim, một hệ thống đã thu hút sự chú ý như một mô hình tái tưới máu thiếu máu cục bộ in vivo đầy hứa hẹn. Kelly và cộng sự đã chỉ ra rằng các tế bào được bao phủ bởi một lớp vỏ trải qua những thay đổi hình thái rõ rệt theo thời gian, kèm theo những thay đổi về điện thế màng ty thể và động lực của màng sinh chất, cuối cùng dẫn đến cái chết của tế bào bào. Họ cũng chứng minh rằng độ pH nội bào của tế bào cơ được bao phủ bởi một tấm bìa giảm xuống nhanh chóng đến khoảng pH 4 ở trung tâm của một tấm bìa (Pitts & Toombs, 2004). Mô hình trượt bìa, ức chế sự khuếch tán oxy hoặc dinh dưỡng đến các tế bào được nuôi cấy dưới nắp đậy, có thể bắt chước mô hình in vivo của các vùng thiếu máu cục bộ, vùng bình thường và vùng biên tương ứng ở trung tâm, bên ngoài và rìa của một tấm bìa. Một số nghiên cứu đã sử dụng mô hình này như một mô hình tái tưới máu do thiếu máu cục bộ của các tế bào cơ trong ống nghiệm (Chun và cộng sự, 2015; Pitts và cộng sự, 2008; Solhjoo & O'Rourke, 2015; Wang và cộng sự, 2012). Theo hiểu biết tốt nhất của chúng tôi, nghiên cứu của chúng tôi là nghiên cứu đầu tiên áp dụng phương pháp bao phủ cho các tế bào hình ống. Trong hệ thống của chúng tôi, khoảng cách từ mép của tấm phủ đến vùng tương đương với 10 mmHg của lực căng oxy, nơi pimonidazole sẽ chuyển thành dương, là 1,22 mm và sức căng oxy giảm xuống mức thấp bằng 0 trong khoảng cách 2 mm tính từ mép của tấm phủ. . Kết quả này có thể tương thích với các báo cáo trước đây sử dụng tấm che khoảng 15 mm, chứng minh sự tồn tại của gradient oxy cách mép ít nhất trong vòng 2 mm (Akiyama và cộng sự, 2018; Yoshihara và cộng sự, 2015). Chúng tôi đã kiểm tra tốc độ tự chết của các tế bào dưới khăn phủ (Hình S11) và phát hiện ra rằng GAPDH và actin được duy trì ngay cả bên trong vòng HIF, cho thấy rằng vòng HIF không chỉ do tế bào chết hoặc chết bên trong vòng HIF.
Một số nghiên cứu đã đo sức căng oxy trong thận bằng các phương pháp khác nhau. Một vài ví dụ về phép đo sức căng oxy của thận bình thường như sau: 50 mmHg và 30 mmHg trong vỏ và tủy bằng vi điện cực; và 49 mmHg và 41 mmHg trong các phân đoạn S1 và S2 của các tế bào hình ống của vỏ não sử dụng PLIM (Hirakawa và cộng sự, 2017, 2018; Zhang và cộng sự, 2014). Sức căng oxy của thận bị bệnh sẽ thấp hơn. Theo một báo cáo trước đây sử dụng vi điện cực oxy, chuột mắc bệnh tiểu đường có sức căng oxy nhu mô thận thấp hơn: 36 mmHg và 11 mmHg ở vỏ và tủy tương ứng (Heyman và cộng sự, 2013; Palm và cộng sự, 2003). Vì các vi điện cực oxy đo sức căng oxy trung bình của nhu mô, nên một phạm vi rộng hơn được mong đợi ở những người thận bị bệnh. Sức căng oxy nội bào giảm xuống không mmHg trong một mô hình thận thiếu máu cục bộ có động mạch thận bên và tĩnh mạch bị kẹp (Hirakawa và cộng sự, 2015). Xem xét những phát hiện này, phạm vi của sức căng oxy trên vòng HIF, khoảng 4–20 mmHg, dường như là hợp lý trong cơ thể sống.
Chúng tôi còn phát hiện ra rằng pH ảnh hưởng đến sự hình thành vòng HIF cũng như sức căng oxy. Vì các tế bào biểu mô hình ống trong thận liên tục tiếp xúc với chất lỏng trong nước tiểu, nên độ pH của tế bào ống sẽ bị ảnh hưởng bởi độ pH của nước tiểu. Xem xét phạm vi rộng của pH trong nước tiểu, chúng tôi quyết định nghiên cứu các tế bào được ủ ở khoảng pH là 5. 0 - 8,5. Đã có những nghiên cứu về phạm vi pH trong thận bình thường. Một nghiên cứu cho thấy độ pH của vỏ não là 7,39 ± 0. {{1 0}} 8 và độ pH của tủy là 7,2 0 ± {{2 {{39} }}}. 0 9, được đo bằng vi điện cực (Burke và cộng sự, 1999). Một nghiên cứu khác, sử dụng hình ảnh pH dựa trên MRI, cho thấy các giá trị pH lần lượt là 7,3 ± 0. 13 và 7. 0 ± 0,29 (Raghunand và cộng sự, 2003). Theo báo cáo, pH thận giảm từ 6,5 xuống 6,32, và thấp tới 5,83 trong một trường hợp nghiêm trọng, ở mô hình chuột mắc bệnh thận mạn bị nhiễm toan (Pavuluri và cộng sự, 2019). Những quan sát này đã cung cấp bằng chứng về sự giảm pH và sự thay đổi trong CKD. Tuy nhiên, tác động của pH đối với HIF -1 gây ra bởi tình trạng thiếu oxy mãn tính ở bệnh thận mạn tính chưa được kiểm tra đầy đủ. Trong nghiên cứu này, một sự thay đổi của vòng HIF đã được quan sát thấy giữa pH 6,5 và pH 7,4, một phạm vi pH hợp lý trong bệnh thận mạn. Kết quả này ủng hộ giả thuyết rằng sự giảm nhẹ độ pH ảnh hưởng đến sự tích tụ HIF -1 trong bệnh thận mạn. Dựa trên bằng chứng về độ pH giảm xuống dưới 6,0 trong các trường hợp suy thận nặng, cũng cần đánh giá trạng thái sinh lý HIF -1 ở pH thấp hơn. Mặc dù đã có báo cáo rằng môi trường axit, ngay cả ở Na Uy, ổn định HIF -1, hầu hết các báo cáo này đã điều tra các điều kiện có tính axit nhẹ, trên pH 6,0 (Filatova và cộng sự, 2016; Mekhail và cộng sự, 2004) . Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã chỉ ra sự ngăn chặn sự tích tụ HIF -1 trong tế bào hình ống ở pH 5,0 và sự suy giảm tín hiệu HIF -1 trong một mô hình coverlip được ủ ở pH 5,0. Do đó, pH thận giảm trong CKD in vivo có thể tương quan với việc kích hoạt HIF không đủ, cũng như với độc tố urê trong thận thiếu oxy, làm trầm trọng thêm sự tiến triển của CKD (Tanaka và cộng sự, 2013).
Ngành học của chúng tôi có một vài hạn chế. Đầu tiên, trong khu vực giảm tưới máu, môi trường nuôi cấy phải thiếu chất dinh dưỡng, ngoài ra còn có hiện tượng thiếu oxy và giảm pH. Tuy nhiên, rất khó để mô tả các tác động của pH, sức căng oxy và các yếu tố khác gây ra bởi giảm tưới máu. Trong cơ thể, thiếu máu cục bộ, bệnh lý giảm tưới máu do sự kết hợp của oxy thấp và chất dinh dưỡng thấp, xảy ra ở các cơ quan và tế bào. Điều quan trọng là phải hiểu sự khác biệt giữa cảm giác thiếu oxy và cảm nhận thiếu máu cục bộ. Mặc dù gặp khó khăn trong việc làm sáng tỏ tác động sinh học của từng yếu tố, nhưng mô hình giảm tưới máu của chúng tôi là hợp lý về mặt sinh lý, bắt chước tình trạng bệnh lý trong cơ thể sống. Thứ hai, việc tạo ra một mô hình bìa cứng đòi hỏi kỹ năng và thực hành, vì phần lớn các ô đôi khi bị tách ra trong quá trình loại bỏ một tờ bìa, đặc biệt là khi sử dụng phương pháp truyền thống (Hình S2a). Vấn đề này phụ thuộc vào dòng ô được sử dụng. Ví dụ, chúng tôi gặp khó khăn khi áp dụng mô hình kẹp phủ cho các ô HEK 293 vì độ bám dính của chúng với kẹp phủ tương đối yếu. Thứ ba, mong muốn giảm thiểu thiệt hại cho các tế bào được nuôi cấy dưới một tấm bìa. Số lượng tế bào bị hư hại tăng lên khi thời gian chúng được bao phủ tăng lên, thể hiện qua phân tích quá trình chết rụng. Chúng tôi xác định rằng 3 h là thích hợp để ước tính vòng HIF khi nó có vẻ như ở trạng thái tĩnh và khoảng 10% số tế bào trở thành apoptotic (Hình S11). Hạn chế thứ tư là khó gắn các tế bào nuôi cấy vào một tấm bìa một cách đồng nhất trong mọi mẫu (Hình S2b, c). Sự khác biệt về sự gắn kết giữa phương pháp truyền thống và phương pháp thay thế để tạo mô hình che môi cũng có thể ảnh hưởng đến nghiên cứu. Chúng tôi đo phạm vi của sức căng oxy tương đương với vòng HIF bằng kỹ thuật tồn tại lân quang, trong đó chúng tôi tạo ra một mô hình coverlip bằng phương pháp truyền thống. Vì vòng HIF trong quá trình hóa tế bào miễn dịch được hình dung bằng một phương pháp thay thế, nên sức căng oxy thực sự có thể khác. Chúng tôi đã giảm thiểu những sai số này bằng cách sử dụng bằng chứng cho thấy pimonidazole dương tính ở nồng độ oxy 10 mmHg trở xuống. Hạn chế thứ năm là pH nội bào không nhất thiết phải giống với pH của môi trường nuôi cấy. Một số báo cáo trước đây đã chỉ ra rằng pH nội bào phù hợp với pH trung bình ở một mức độ nhất định trong các tế bào nuôi cấy (Michl và cộng sự, 2019), chúng tôi chỉ có thể đánh giá xu hướng của pH nội bào bằng cách thay đổi pH môi trường. Trong cơ thể sống, mối quan hệ giữa độ pH của các vùng nội bào và ngoại bào, chẳng hạn như nước tiểu hoặc dịch cơ thể, phức tạp hơn so với trong tế bào nuôi cấy. Do đó, các nghiên cứu sâu hơn về cách mà sự thay đổi độ pH điều chỉnh sự tích tụ của protein HIF -1 trong cơ thể sống sẽ cần thiết cho tương lai.
Lợi ích của Cistanche: cải thiện quả thậnhàm số
Một hạn chế khác là pH sẽ ảnh hưởng đến chất đánh dấu tình trạng thiếu oxy, pimonidazole. Chúng tôi đã so sánh khoảng cách của rìa của vùng dương tính với pimonidazole từ tâm của một tấm bìa trong các điều kiện pH khác nhau trong mô hình coverlip của chúng tôi. Rìa của vùng dương tính với pimonidazole có thể so sánh giữa pH 6,5, 7,4 và 8,5 (Hình S12a, b). Một nghiên cứu trước đây cũng đã chứng minh sự duy trì liên kết pimonidazole ở các giá trị pH khác nhau (Kleiter và cộng sự, 2 0 06). Dựa trên bằng chứng này, chúng tôi kết luận rằng pimonidazole là một chất đánh dấu tình trạng thiếu oxy thích hợp cho các thí nghiệm che phủ của chúng tôi. Hạn chế cuối cùng là với một phạm vi căng thẳng oxy giữa khoảng 4 mmHg và 20 mmHg (0,52 phần trăm O2 đến 2,6 phần trăm O2) của vòng HIF, Pt (II) - và Pd (II) -porphyrins, được sử dụng rộng rãi như sinh học. Các đầu dò oxy, có lợi thế để đo nồng độ oxy rất thấp vì thời gian phát lân quang dài hơn đáng kể so với các đầu dò sử dụng phức Ir (III) (Yoshihara et al., 2017). Tuy nhiên, nói chung, phép đo oxy định lượng dựa trên sự phát quang, được tính toán bằng phương trình Stern – Volmer, có hiệu suất tốt hơn ở phạm vi O2 thấp (Papkovsky & Zhdanov, 2016). Một số nghiên cứu trước đây đã chứng minh phép đo độ căng oxy dựa trên phức Ir (III) ở mức thấp khoảng 10 mmHg (Akiyama và cộng sự, 2018; Yoshihara và cộng sự, 2015). Do đó, chúng tôi tin rằng phạm vi độ căng oxy của vòng HIF phải là một kết quả chính xác.
5|KẾT LUẬN
Tóm lại, chúng tôi nhận thấy rằng việc hiểu vai trò của cả oxy và pH là điều cần thiết để hiểu trạng thái sinh lý HIF -1 trong bệnh thận mạn và có thể đạt được bằng cách điều tra các tế bào ống bị giảm tưới máu. Mô hình bao phủ, với những hạn chế của dòng phương tiện truyền thông, là một mô hình tốt về giảm tưới máu trong cơ thể sống, đặc biệt là ở các ống trong bệnh thận mạn tính, vì sự hiếm gặp của các mao mạch phúc mạc là một dấu hiệu chính của bệnh thận mạn (Mimura & Nangaku, 2010; Nangaku, Năm 2006). Mô hình giảm tưới máu này cũng có thể bắt chước các gradient oxy và pH trong cơ thể sống, chẳng hạn như các khối u và tổn thương do thiếu máu cục bộ. Mô hình cung cấp một cách tiếp cận đầy hứa hẹn để làm sáng tỏ các cơ chế sinh học này.
XUNG ĐỘT LỢI ÍCH
Tất cả các tác giả không có xung đột lợi ích để tuyên bố.
TÁC GIẢ ĐÓNG GÓP
Tất cả các tác giả đã góp phần hình thành khái niệm tổng thể. TH thực hiện các thí nghiệm tổng thể. TH và YH phân tích kết quả và đưa ra số liệu. TH đã viết bản thảo gốc. KM, TY và ST đã thực hiện thí nghiệm bằng kỹ thuật tồn tại lân quang và chỉnh sửa một phần của bản thảo. YH, TT, và MN đã chỉnh sửa bản thảo tổng thể. Tất cả các tác giả đã đọc và duyệt bản thảo cuối cùng.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Akiyama, H., Takahashi, I., Shimoda, Y., Mukai, R., Yoshihara, T., & Tobita, S. (2018). Ir (iii) hình ảnh oxy dựa trên phức hợp của các tế bào sống và quỹ đạo mắt bằng máy ảnh ICCD có giám sát. Khoa học Quang hóa và Quang sinh, 17 (6), 846–853.
Akizawa, T., Nangaku, M., Yamaguchi, T., Arai, M., Koretomo, R., Maeda, K., Miyazawa, Y., & Hirakata, H. (2019). Enarodustat, chuyển đổi và điều trị duy trì cho bệnh thiếu máu ở bệnh nhân chạy thận nhân tạo: Một thử nghiệm ngẫu nhiên, có đối chứng giả dược giai đoạn 2b, sau đó là thử nghiệm dài hạn. Nephron, 143 (2), 77–85.
Ameri, K., Burke, B., Lewis, CE, & Harris, AL (2002). Quy định yếu tố VL30 của chuột trong tế bào ung thư vú ở người trong tình trạng thiếu oxy và thiếu oxy: Vai trò của HIF -1. Tạp chí Ung thư của Anh, 87 (10), 1173–1181.
Asai, H., Hirata, J., Hirano, A., Hirai, K., Seki, S., & Watanabe- Akanuma, M. (2016). Sự kích hoạt thụ thể hydrocacbon aryl làm trung gian ức chế sự biểu hiện erythropoietin phụ thuộc vào yếu tố gây thiếu oxy bằng indoxyl sulfat. Tạp chí Sinh lý học Hoa Kỳ. Sinh lý tế bào, 310 (2), C142 – C150.
Burke, TJ, Malhotra, D., & Shapiro, JI (1999). Các yếu tố duy trì độ dốc pH trong thận: vai trò của cấu trúc hệ mạch. Kidney International, 56 (5), 1826–1837.
Carrera, S., Senra, J., Acosta, MI, Althubiti, M., Hammond, EM, de Verdier, PJ, & Macip, S. (2014). Vai trò của yếu tố phiên mã HIF -1 alpha trong việc tăng quá trình phân chia tế bào ở các căng thẳng oxy sinh lý. PLoS One, 9 (5), e97938.
Chen, N., Hao, C., Peng, X., Lin, H., Yin, A., Hao, L., Tao, Y., Liang, X., Liu, Z., Xing, C., Chen, J., Luo, L., Zuo, L., Liao, Y., Liu, BC, Leong, R., Wang, C., Liu, C., Neff, T.,… Yu, KHP (2019 ).
Roxadustat dùng để thiếu máu ở bệnh nhân bị bệnh thận không được lọc máu. Tạp chí Y học New England, 381 (11), 1001– 1010.
Chen, N., Qian, J., Chen, J., Yu, X., Mei, C., Hao, C., Jiang, G., Lin, H., Zhang, X., Zuo, L., Anh ấy, Q., Fu, P., Li, X., Ni, D., Hemmerich, S., Liu, C., Szczech, L., Besarab, A., Neff, TB,… Valone, F.
H. (2017). Nghiên cứu giai đoạn 2 về chất ức chế prolyl hydroxylase gây thiếu oxy qua đường uống FG -4592 để điều trị bệnh thiếu máu ở Trung Quốc. Thận học, Lọc máu, Cấy ghép, 32 (8), 1373–1386.
Chiang, CK, Tanaka, T., Inagi, R., Fujita, T., & Nangaku, M. (2011). Indoxyl sulfate, một độc tố urê huyết đại diện, ngăn chặn sản xuất erythropoietin theo cách phụ thuộc vào HIF. Điều tra trong phòng thí nghiệm, 91 (11), 1564–1571.
Chun, WJ, Nah, DY, Bae, JH, Chung, JW, Lee, H., & Moon, IS (2015). Dung dịch glucoza-insulin-kali bảo vệ tế bào tế bào não thất của chuột sơ sinh trong mô hình thiếu máu cục bộ / tái tưới máu trong ống nghiệm. Tạp chí Lưu hành Hàn Quốc, 45 (3), 234–241.
Coyne, DW, Goldsmith, D., & Macdougall, IC (2017). Lựa chọn mới cho tình trạng thiếu máu của bệnh thận mãn tính. Kidney International Supplement, 7 (3), 157–163. nụ hôn.2017.09.002
Deng, A., Arndt, MA, Satriano, J., Singh, P., Rieg, T., Thomson, S. và cộng sự (2010). Bảo vệ thận trong bệnh thận mãn tính: kích hoạt yếu tố gây giảm oxy máu so với phong tỏa angiotensin II. Tạp chí Sinh lý học Hoa Kỳ. Sinh lý thận, 299 (6), F1365 – F1373.
Filatova, A., Seidel, S., Bogurcu, N., Graf, S., Garvalov, BK, & Acker, T. (2016). Nhiễm toan hoạt động thông qua HSP90 một cách độc lập với Ph.D./VHL- để thúc đẩy chức năng HIF và duy trì tế bào gốc trong u thần kinh đệm. Nghiên cứu Ung thư, 76 (19), 5845–5856. CÓ THỂ -15-2630
Goldfarb, M., Rosenberger, C., Abassi, Z., Shina, A., Zilbersat, F., Eckardt, KU, Rosen, S., & Heyman, SN (2006). Suy thận cấp-trên-mãn tính ở chuột: bù chức năng và dung nạp thiếu oxy. Tạp chí Thận học Hoa Kỳ, 26 (1), 22–33.
Heyman, SN, Rosenberger, C., Rosen, S., & Khamaisi, M. (2013). Tại sao đái tháo đường là một yếu tố nguy cơ của bệnh thận do thuốc cản quang? BioMed Research International, 2013, 123589.
Hirakawa, Y., Mizukami, K., Yoshihara, T., Takahashi, I., Khulan, P., Honda, T., Mimura, I., Tanaka, T., Tobita, S., & Nangaku, M. (2018). Hình ảnh thời gian tồn tại lân quang trong lòng thận của vỏ thận đo chính xác tình trạng thiếu oxy ở thận. Kidney International, 93 (6), 1483–1489.
Hirakawa, Y., Tanaka, T., & Nangaku, M. (2017). Thận thiếu oxy trong CKD; Sinh lý bệnh và phương pháp phát hiện. Biên giới trong Sinh lý học, 8, 99.
