A Homozygous Dab1 - // Là một tiểu thuyết tiềm ẩn nguyên nhân gây ra các dị tật bẩm sinh bẩm sinh ở giai đoạn đầu của Autosomal về đường tiết niệu và thận của chuột

edmund.chen@wecistanche.com

Giới thiệu

Những con chuột đột biến Yotari, thu được bằng cách thu nhận một cách tự phát đột biến trong gen Dab1, biểu hiện những bất thường về mô học trong hệ thần kinh trung ương [1,2], rất giống với những con chuột cuộn (reelin //), cho thấy rằng reelin và DAB1 thuộc về cùng một con đường tín hiệu [1–4]. Các sai lệch trong con đường reelin / DAB1 đã được báo cáo là có liên quan đến các rối loạn tâm thần khác nhau [5–7]. Điều thú vị là bên cạnh hệ thần kinh trung ương, sự hiện diện của DAB1 và ​​protein reelin cũng đã được xác nhận trong hệ thần kinh ngoại vi và một số mô ngoài thần kinh. Sự hiện diện của DAB1 đã được tìm thấy trong tế bào vỏ chuột [8] và bào thai ngườithận[9] trong khi biểu hiện reelin đã được báo cáo trong quá trình phát triển bào thai của chuột và người, cũng như ở một số tế bào nội mô dọc theo mạch máu ở chuột trưởng thành [9-11]. Con đường reelin / DAB1 chuẩn có thể kích hoạt các protein xuôi dòng riêng biệt, bao gồm các thụ thể NOTCH2, đóng vai trò quan trọng trong các quyết định số phận tế bào và sự biệt hóa trong quá trìnhquả thậnphát triển [12–14]. Các thụ thể NOTCH2 được yêu cầu để hình thành các ống gần và tế bào podocytes [13], nhưng một khi đạt được sự trưởng thành của nephron, con đường này hầu như bị im lặng [15]. Trong điều kiện cấp tínhbệnh thận,tăng biểu hiện NOTCH2 có thể góp phần tái tạo, trong khi biểu hiện duy trì có liên quan nhân quả với xơ hóa mô kẽ và xơ cứng cầu thận [15]. Sự điều hòa tín hiệu NOTCH có thể làm giảm đáng kể quá trình autophagy và gây suy giảm khả năng biệt hóa của tế bào podocyte trong quá trình phát triển [16].

Do đó, các tế bào podocyte rối loạn chức năng đóng một vai trò quan trọng trong bệnh cầu thận, đặc biệt là trong hội chứng thận hư vô căn ở người [17,18] và trong hội chứng thận hư thay đổi tối thiểu (MCNS) [19]. Do đó, autophagy duy trì cân bằng nội môi của tế bào trong điều kiện sinh lý bình thường, trong khi trong điều kiện bệnh lý, nó có thể tiến triển thành autophagic chết [20]. Một dấu ấn sinh học autophagy được sử dụng rộng rãi là LC3B, một protein cấu trúc của màng thực quản [21]. Sự nhiễu xuyên âm phức tạp giữa quá trình tự động và quá trình tự chết cũng góp phần vào việc duy trì cân bằng nội môi như một phản ứng đối với môi trường vi mô của tế bào. Ai cũng biết rằng các sự kiện apoptotic tăng về số lượng trong thời gianquả thậnsự phát triển [22] và giảm đi đáng kể khi quá trình trưởng thành kết thúc, ngoại trừ trong các điều kiệnchấn thương thận[23]. Không thể phủ nhận, quá trình apoptosis là một cơ chế phức tạp được điều chỉnh thông qua sự tác động lẫn nhau của một số con đường nhưng chủ yếu hoàn thành với sự hoạt hóa của caspase3 (CASP3), sự hoạt hóa của nó là một trong những dấu hiệu thường được sử dụng nhất để phát hiện apoptosis [23].

Trong báo cáo này, chúng tôi nhằm mục đích phân tích cách gen Dab1 ngăn chặn chức năng của dòng chảyquả thậnhình thái học và sự biểu hiện và bản địa hóa của các protein reelin, NOTCH2, LC3B, và các protein CASP3 bị phân cắt ở chuột sau khi sinhthận. Chúng tôi giả định rằng những protein này được biểu hiện ở chuột sau khi sinhquả thận,và tác động qua lại chức năng của chúng góp phần duy trì cấu trúc và chức năng của chúng. Ngoài ra, vì sự hiện diện của DAB1 đã được xác nhận trong quá trình bào thai của con ngườiquả thậnphát triển [9], có thể cho rằng sự bất hoạt của nó có thể gây ra rối loạn trong một loạt các dị tật bẩm sinh củaquả thậnvà đường tiết niệu (CAKUT).

Từ khóa:yotari; chức năng thận; phát triển thận sau sinh; nhuộm huỳnh quang miễn dịch; kính hiển vi điện tử

CISTANCHE SẼ CẢI THIỆN CHỨC NĂNG KIDNEY / RENAL

Nguyên liệu và phương pháp

Bộ sưu tập mẫuLà những đột biến thông thường không có Dab1, chúng tôi đã sử dụng chuột yotari (Dab1 /) được Howell et al mô tả trước đây. [24]. Các mồi PCR được sử dụng để xác định kiểu gen của chuột là yotari: GCC CTTCAGCATCACCATGCT và CAGTGAGTACATATTGTGTGAGTTCC, kiểu dại của locus Dab1: GCCCTTCAGCATCACCATGCT và CCTTGTTTCTTTGCTTTAA-GGCTGT [5]. Chuột C57BL / 6 N được nuôi và nhốt chung trong lồng polycarbonate tiêu chuẩn (bao gồm ít nhất một trong mỗi kiểu gen) với khả năng tiếp cận thức ăn và nước uống trong phòng được kiểm soát nhiệt độ (23 ± 2 ◦C) với ánh sáng 12 giờ / chu kỳ tối. Vào các ngày sau sinh 4, 11 và 14 (P4, P11 và P14), chuột được gây mê sâu bằng pentobarbital và truyền dịch qua tim trong 1 0 phút với dung dịch muối đệm phosphat (PBS, pH 7,2) và 4% paraformaldehyde (PFA ) trong 0,1 M PBS.Thậnđã được loại bỏ và cố định với 4 phần trăm PFA trong 0. 1 M PBS qua đêm để phân tích mô học thông thường (hematoxylin-eosin (H&E), nhuộm hóa mô miễn dịch và miễn dịch huỳnh quang) và trong hỗn hợp 2 phần trăm PFA cộng với 2,5 phần trăm glutaraldehyde (GA) để kiểm tra kính hiển vi điện tử. Sau khi cố định, mô được chuẩn bị để kiểm tra mô học thêm, như chúng tôi đã mô tả trước đây [25,26].

Miễn dịch huỳnh quang và nhuộm ImmunoperoxidaseSau khi khử định dạng và bù nước, các phần được đun nóng trong 2 0 phút trong 0. Đệm xitrat 01 M (pH 6,0) trong nồi hấp cách thủy và sau đó, được làm nguội đến nhiệt độ phòng. Bộ đệm chặn (ab 64226, Abcam, Cambridge, Vương quốc Anh) đã được áp dụng trong 30 phút để loại trừ vết bẩn không xác định. Sau đó, các phần được ủ trong buồng độ ẩm qua đêm với các kháng thể chính (Bảng 1). Sau khi rửa trong PBS, các kháng thể thứ cấp (Bảng 1) được áp dụng trong một giờ và rửa lại trong PBS. Sau đó, các hạt nhân được nhuộm bằng 4060 - diamidino -2- phenylindole (DAPI) trong 2 phút, rửa sạch trong PBS và đậy nắp lại. Chúng tôi thực hiện thử nghiệm hấp phụ trước để mỗi kháng thể chính được sử dụng với peptit tương ứng và áp dụng sự kết hợp của chúng cho các phần. Kết quả cho thấy không có kháng thể nhuộm. Ngoài ra, các kiểm soát với việc bỏ qua kháng thể chính để xác định mức độ liên kết không đơn bào của các kháng thể thứ cấp đã được thực hiện.

Đối với phương pháp nhuộm immunoperoxidase, phản ứng kháng CASP3 đa dòng của thỏ (1: 1 0 0 độ pha loãng, ab13847, Abcam, Cambridge, Vương quốc Anh) được sử dụng như một kháng thể chính trong một giờ trong buồng ẩm sau khi xử lý phần bằng 0,1 phần trăm H2O2. Sau khi rửa trong PBS, phát hiện thứ cấp được thực hiện bằng cách sử dụng liên kết và streptavidin peroxidase, mỗi peroxidase trong vòng mười phút (DakoCytomation, CA 93013 USA, LOT 03477) và diaminobenzidine (Dako, CA 93013 USA, LOT 10051369), được kiểm soát cẩn thận để tránh hiện tượng nhiễm màu nền quá mức. Các hạt nhân được nhuộm bằng hematoxylin, rửa trong nước máy trong 10 phút, khử nước trong thời gian ngắn trong các loạt dung dịch etanol tăng dần, và đậy nắp lại.

Chuẩn bị mô cho kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM)Sau khi cố định bằng hỗn hợp 2 phần trăm PFA và 2,5 phần trăm GA trong 0. 1 M PBS trong 2 giờ, các mẫu được rửa bằng PBS và sau cố định trong dung dịch nước chứa 2 phần trăm osmium tetroxide trong 2 giờ. Tất cả các mẫu đều được rửa hai lần trong PBS, khử nước trong etanol tăng dần và nhúng trong Epon 812 (Thiết bị Phòng thí nghiệm TAAB, Reading, Vương quốc Anh). Các phần nối tiếp (độ dày 70 nm) được cắt trên máy siêu vi sinh Ultracut UCT (Leica Microsystems, Wetzlar, Đức) và nhuộm với 1% uranyl axetat và xitrat chì.

Thu thập và phân tích dữ liệuPhân tích được thực hiện bằng kính hiển vi huỳnh quang (Olympus BX51, Tokyo, Nhật Bản) được trang bị máy ảnh kỹ thuật số DP71 (Olympus), kính hiển vi điện tử truyền qua JEM 1400 (JEOL, Tokyo, Nhật Bản) hoạt động ở 80 kV và được chụp ảnh bằng điện tích JEOL- hệ thống camera thiết bị ghép nối (CCD) (Kỹ thuật kính hiển vi tiên tiến, Danvers, MA, Hoa Kỳ) và cuối cùng là kính hiển vi trường sáng (BX40, Olympus, Tokyo, Nhật Bản). Tất cả các hình ảnh phân tích được xử lý bằng phần mềm ImageJ và Adobe Photoshop (Adobe, San Jose, CA, USA). Mỗi nhóm được kiểm tra, chúng tôi sử dụng ba đến bốn con vật. Tất cả đã được thu thậpthậnđược cắt ở các phần dày 5 µm, và tối đaquả thận length determined by using these samples was reported. Mean proximal convoluted tubules (PCT), distal convoluted tubules (DCT) and glomeruli diameters were determined by averaging 100 structure diameters per analyzed sample. As nephron segments have irregular shapes, we took the largest diameter of every examined segment as representative. The staining intensity was semiquantitatively evaluated at four degrees: the absence of any reactivity (( ), mild reactivity (+), moderate reactivity (++), and strong reactivity (+++) (Table 2). The number of DAB1, reelin, NOTCH2, LC3B, and cleaved CASP3 immunoreactive cells was counted and expressed as a percentage of total cells. For each sample, we analyzed twenty PCT, DCT, and G at ×40 objective magnifification. We averaged the number of positive cells per group. Any level of nuclear, cytoplasmic, or membrane staining was regarded as positive. Three investigators analyzed the images independently. Interrater agreement was tested with interclass correlation analysis, which yielded a coeffificient >0. 75, cho thấy sự đồng ý tuyệt vời [27].

Phân tích thống kêMột phép thử t hai đuôi được thực hiện để phân tích sự khác biệt về đường kính trung bình giữa PCT, DCT và G của động vật hoang dã và yotari. Đường kính được trình bày dưới dạng trung bình ± độ lệch chuẩn (SD). Mức độ quan trọng được đặt ở p <0. 0="" 5.="" một="" bài="" kiểm="" tra="" anova="" hai="" ngày="" sau="" đó="" bằng="" bài="" kiểm="" tra="" so="" sánh="" nhiều="" lần="" của="" tukey="" được="" sử="" dụng="" để="" kiểm="" tra="" sự="" khác="" biệt="" về="" tỷ="" lệ="" phần="" trăm="" tế="" bào="" dương="" tính="" giữa="" pct,="" dct="" và="" cầu="" thận="" tại="" mọi="" thời="" điểm.="" phần="" trăm="" ô="" dương="" tính="" được="" biểu="" thị="" bằng="" sai="" số="" trung="" bình="" ±="" chuẩn="" của="" giá="" trị="" trung="" bình="" (sem).="" mức="" độ="" quan="" trọng="" được="" đặt="" ở="" p=""><0,05. phân="" tích="" được="" thực="" hiện="" trong="" phần="" mềm="" graphpad="" (graphpad="" software,="" la="" jolla,="" ca,="">

Kết quả

Nhuộm Hematoxylin-Eosin (H&E) và Đo đường kính thậnNhuộm H&E của các phần trung gian củathậnở tất cả các mốc thời gian đã kiểm tra làm nổi bậtquả thậnkiểu hình của chuột yotari so với kiểu hình hoang dã (Hình 1a). Ở mức 4P nghĩa làquả thậnđường kính của động vật yotari vào khoảng 55 µm so với khoảng 75 µm. Ngoài ra, sự khác biệt này là đáng chú ý vào các thời điểm sau đó do tốc độ tăng trưởng chậm hơn củathậnở yotari so với sự phát triển tiến bộ củathậnở động vật hoang dã. Để xác định xem mức giảm tổng thểquả thậnkích thước là do giảm kích thước đoạn nephron, chúng tôi tính trung bình đường kính của PCT, DCT và G cho mỗi nhóm. Thật vậy, đã có sự giảm đường kính trung bình G, PCT và DCT trong nhóm yotari so với kiểu hoang dã (Hình 1b, p <0. 05).="" ngoài="" ra,="" nhuộm="" h&e="" cho="" thấy="" vỏ="" não="" mỏng="" hơn="">thậngiãn xương chậu ở động vật yotari và giãn nở nhẹ DCT ở 14P. Cấu trúc cơ bản và mô hình trưởng thành của cầu thận là giống nhau ở cả hai nhóm động vật được kiểm tra.

Phân tích mô học mô tả dựa trên máy vi ảnh TEMTrên máy ảnh vi thu được bằng TEM, các cầu thận của chuột hoang dã cho thấy sự xuất hiện điển hình của tất cả các bộ phận của hàng rào ngũ mạch, chúng phát triển bình thường và có thể nhận biết được (Hình 2a). Dễ dàng phân biệt được các tế bào nang, quá trình chân và cuống của tế bào podocyte, các khe xuyên thấu, màng đáy cầu thận, và lòng mao mạch với nội mô được nung chảy (Hình 2a). Mặt khác, ở cầu thận của chuột yotari, tổn thương tế bào podocyte tiến triển với quá trình chân và thiếu các khe lọc có thể được quan sát thấy (Hình 2b – d). Những thay đổi siêu cấu trúc này đã được quan sát thấy trong tất cảthậnđã khám và tham gia hầu hết các cầu thận đã khám. Không có bất thường nào được nhận thấy trong PCT hoặc DCT của chuột yotari so với động vật hoang dã (Hình 2e – h). Trong PCT, các giao diện tế bào được xác định kém vì sự bất thường của màng tế bào và sự xen kẽ tế bào với các tế bào lân cận của chúng. Tế bào chất rất phong phú, chứa các nhân phân biệt rõ ràng, các ti thể kéo dài, các mầm cơ bản, và nhiều lỗ hình ống giữa các vi nhung mao, tạo thành một đường viền bàn chải ở màng đỉnh. Độ phóng đại cao hơn cho thấy bề mặt đỉnh của các tế bào biểu mô PCT có chứa các vi nhung mao dài để tạo thành đường viền bàn chải và các điểm nối chặt chẽ giữa các đường viền tế bào quang của các tế bào biểu mô hình ống lân cận (Hình 2e, f). Mặt khác, bề mặt đỉnh của tế bào biểu mô DCT chứa ít vi nhung mao ngắn và nhiều mụn nước (Hình 2g, h).

Hình 2. Các ảnh vi chụp của kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM) kiểu hoang dã và yotarithậnCác tiểu cầu của động vật hoang dã (a) cho thấy một hàng rào thâm nhiễm phát triển bình thường với nội mô được nung chảy (E) của mao mạch (C), màng đáy (BM), tế bào vỏ (P) có cuống (PE) và các khe thủng (FS) ). bên trongthậncủa động vật yotari, có thể nhận thấy sự căng phồng của các cuống và thiếu các khe lọc (dấu hoa thị, b – d). Không có bất thường nào được nhận thấy ở các ống lượn gần (PCT) hoặc ống xoắn xa (DCT) của chuột yotari so với động vật hoang dã (e-h). Trong PCT, tế bào chất rất phong phú, chứa các hạt nhân phân biệt rõ ràng (N), ti thể kéo dài (M), các mầm cơ bản (BI), và nhiều lỗ hình ống (TP) giữa các vi nhung mao, tạo thành một đường viền bàn chải (BB) ở màng đỉnh (e, f). Độ phóng đại cao hơn cho thấy bề mặt đỉnh của các tế bào biểu mô PCT có chứa các vi nhung mao dài để tạo thành đường viền bàn chải và các điểm nối chặt chẽ (TJ) giữa các đường viền tế bào quang của các tế bào biểu mô hình ống lân cận (e, f). Mặt khác, bề mặt đỉnh của tế bào biểu mô DCT có chứa ít vi nhung mao ngắn và nhiều mụn nước (g, h). Thang chia độ trong ảnh (a – d) và trong (e – h) là 1 µm; vạch chia độ trong ảnh (e – h) là 2 µm.

Bản địa hóa và tọa lạc của Reelin và DAB1Reelin được biểu hiện yếu với phản ứng nhẹ đến trung bình (Bảng 2) trong cầu thận và DCT của tất cả các động vật được kiểm tra tại tất cả các thời điểm quan sát (p <0. 0="" 5,="" hình="" 3a).="" chỉ="" trong="" pct="" của="" chuột="" yotari="" là="" tỷ="" lệ="" tế="" bào="" dương="" tính="" cao="" hơn="" đáng="" kể="" so="" với="" động="" vật="" hoang="" dã="" (p=""><0,05, hình="" 3a).="" trong="" tế="" bào="" cầu="" thận,="" khu="" trú="" của="" sự="" bắt="" màu="" là="" ngoại="" nhân,="" trong="" khi="" ở="" pct="" và="" dct,="" nó="" nằm="" rải="" rác="" khắp="" tế="" bào="" chất="" (hình="" a,="">

igure 4. Nhuộm huỳnh quang miễn dịch của yotari sau sinhthậnvới dấu hiệu reelin (a) và nhuộm huỳnh quang kép của kiểu hoang dã sau khi sinhthậnvới DAB1 và ​​các điểm đánh dấu cuộn (b). (a, b) Nhuộm DAPI DNA hạt nhân kết hợp với DAB1, và sợi miễn dịch huỳnh quang reelin được hiển thị song song (hợp nhất). Các mốc thời gian quan sát được là P4, P11, P14. Biểu hiện của các dấu hiệu được kiểm tra trong cầu thận (G), ống lượn gần (PCT) và ống xoắn xa (DCT) được đánh dấu bằng các mũi tên, trong khi dấu hoa thị cho biết biểu hiện của cuộn trong chất nền ngoại bào (a). Phụ trang hiển thị biểu hiện nổi bật nhất trong hình ảnh. Nhuộm hạt nhân DAPI cho thấy DAB1 và ​​reelin hóa màu kém, chủ yếu ở DCT (đầu mũi tên). Thanh tỷ lệ là 20 µm và đề cập đến tất cả các hình ảnh.

Hầu như không có phản ứng miễn dịch của DAB1 trong cầu thận và PCT của động vật hoang dã ở P4, trong khi tỷ lệ tế bào dương tính với phản ứng nhẹ (Bảng 2) tăng đáng kể ở P11 và P14 (p <0. 05,="" hình="" 3b).="" trong="" dct,="" dab1="" được="" biểu="" hiện="" chủ="" yếu="" ở="" phần="" đỉnh="" và="" phần="" bên="" của="" màng="" tế="" bào="" (hình="" 4b)="" với="" khả="" năng="" phản="" ứng="" mạnh="" (bảng="" 2).="" tỷ="" lệ="" tế="" bào="" dương="" tính="" cao="" hơn="" đáng="" kể="" so="" với="" các="" cấu="" trúc="" trước="" đó,="" khoảng="" 60="" phần="" trăm="" (hình="" 3b),="" đặc="" biệt="" là="" ở="" điểm="" vàng="" (hình="" 4b).="" hầu="" như="" không="" có="" sự="" tạo="" màu="" của="" dab1="" và="" ​​reelin="" ngoại="" trừ="" trong="" dct="" của="" động="" vật="" kiểu="" hoang="" dã="" ở="" p14="" (đầu="" mũi="" tên,="" hình="" 4b).="" các="" phân="" tử="" sinh="" học="" 2021,="" 11,="" 609="" 8="" trên="" 14="" hình="" 4.="" nhuộm="" huỳnh="" quang="" miễn="" dịch="" của="" yotari="" sau="">thậnvới dấu hiệu reelin (a) và nhuộm huỳnh quang kép miễn dịch của loại hoang dã sau khi sinhthậnvới DAB1 và ​​các điểm đánh dấu cuộn (b). (a, b) Nhuộm DAPI DNA hạt nhân kết hợp với DAB1, và reelin miễn dịch huỳnh quang được hiển thị song song (hợp nhất). Các mốc thời gian quan sát được là P4, P11, P14. Biểu hiện của các dấu hiệu được kiểm tra trong cầu thận (G), ống lượn gần (PCT) và ống xoắn xa (DCT) được đánh dấu bằng các mũi tên, trong khi dấu hoa thị cho biết biểu hiện của cuộn trong chất nền ngoại bào (a). Phụ trang hiển thị biểu hiện nổi bật nhất trong hình ảnh. Nhuộm hạt nhân DAPI cho thấy DAB1 và ​​reelin hóa màu kém, chủ yếu ở DCT (đầu mũi tên). Thanh tỷ lệ là 2 0 µm và tham chiếu đến tất cả các hình ảnh. Hầu như không có phản ứng miễn dịch của DAB1 trong cầu thận và PCT của động vật hoang dã ở P4, trong khi tỷ lệ tế bào dương tính với phản ứng nhẹ (Bảng 2) tăng đáng kể ở P11 và P14 (p <0,05, hình="" 3b).="" trong="" dct,="" dab1="" được="" biểu="" hiện="" chủ="" yếu="" ở="" phần="" đỉnh="" và="" phần="" bên="" của="" màng="" tế="" bào="" (hình="" 4b)="" với="" khả="" năng="" phản="" ứng="" mạnh="" (bảng="" 2).="" tỷ="" lệ="" tế="" bào="" dương="" tính="" cao="" hơn="" đáng="" kể="" so="" với="" các="" cấu="" trúc="" trước="" đó,="" khoảng="" 60%="" (hình="" 3b),="" đặc="" biệt="" là="" ở="" điểm="" vàng="" (hình="" 4b).="" hầu="" như="" không="" có="" sự="" tạo="" màu="" của="" dab1="" và="" ​​cuộn="" dây="" ngoại="" trừ="" trong="" dct="" của="" động="" vật="" hoang="" dã="" ở="" p14="" (đầu="" mũi="" tên,="" hình="">

Các mẫu biểu hiện không gian và thời gian của NOTCH2 và LC3BTỷ lệ tế bào NOTCH {{0}} dương tính nhỏ hơn 2 0 phần trăm trong cầu thận của cả hai kiểu gen động vật tại tất cả các thời điểm được quan sát. Chỉ ở P14, tỷ lệ tế bào dương tính trong tiểu cầu thận của động vật yotari cao hơn đáng kể so với động vật hoang dã (p <0,05, hình="" 3c).="" cường="" độ="" nhuộm="" từ="" nhẹ="" đến="" trung="" bình="" (bảng="" 2),="" chủ="" yếu="" nằm="" ở="" ngoại="" nhân="" (hình="" 5a-f).="" trong="" pct="" và="" dct="" của="" cả="" hai="" kiểu="" gen="" động="" vật,="" tỷ="" lệ="" số="" tế="" bào="" dương="" tính="" đều="" tăng="" theo="" thời="" gian.="" ở="" p14,="" tỷ="" lệ="" tế="" bào="" dương="" tính="" trong="" pct="" và="" dct="" của="" động="" vật="" yotari="" cao="" hơn="" đáng="" kể="" so="" với="" pct="" và="" dct="" của="" động="" vật="" hoang="" dã="" (p=""><0,05, hình="" 3c).="" cường="" độ="" tín="" hiệu="" tại="" tất="" cả="" các="" thời="" điểm="" quan="" sát="" được="" từ="" nhẹ="" đến="" trung="" bình="" (bảng="" 2)="" và="" rải="" rác="" khắp="" tế="" bào="" chất="" (hình="" 5a-f).="" hình="" 5.="" phương="" pháp="" nhuộm="" miễn="" dịch="" huỳnh="" quang="" của="" loài="" hoang="" dại="" và="" yotari="" sau="" khi="">thậnvới các đánh dấu NOTCH2 và LC3B và nhuộm immunoperoxidase với đánh dấu caspase3 (CASP3) đã phân cắt. (a – f) Nhuộm DAPI DNA hạt nhân được hợp nhất với NOTCH2 và LC3B. Các mốc thời gian quan sát được là P4, P11, P14. Sự biểu hiện của các dấu hiệu NOTCH2 và LC3B trong cầu thận (G), ống lượn gần (PCT) và ống lượn xa (DCT) được đánh dấu bằng các mũi tên. Đặc biệt có thể quan sát thấy phản ứng LC3B mạnh mẽ trong nang Bowman của các cầu thận đang phân hủy (dấu hoa thị, e). Phụ trang hiển thị biểu hiện nổi bật nhất trong hình ảnh. CASP3 được thể hiện kém trong tất cả các mốc thời gian được quan sát. Biểu hiện quan trọng duy nhất là ở cầu thận của chuột yotari trên P14 (mũi tên). Thanh tỷ lệ là 2 0 µm và tham chiếu đến tất cả các hình ảnh. Phân tử sinh học 2 0 21, 11, 609 9 trong tổng số 14 3. 4. Các kiểu biểu hiện theo thời gian và không gian của NOTCH2 và LC3B Tỷ lệ tế bào NOTCH 2- dương tính ít hơn 20% trong cầu thận của cả hai kiểu gen động vật tại tất cả các thời điểm quan sát được. Chỉ ở P14, tỷ lệ tế bào dương tính trong tiểu cầu thận của động vật yotari cao hơn đáng kể so với động vật hoang dã (p <0,05, hình="" 3c).="" cường="" độ="" nhuộm="" từ="" nhẹ="" đến="" trung="" bình="" (bảng="" 2),="" chủ="" yếu="" nằm="" ở="" ngoại="" nhân="" (hình="" 5a-f).="" trong="" pct="" và="" dct="" của="" cả="" hai="" kiểu="" gen="" động="" vật,="" tỷ="" lệ="" số="" tế="" bào="" dương="" tính="" đều="" tăng="" theo="" thời="" gian.="" ở="" p14,="" tỷ="" lệ="" tế="" bào="" dương="" tính="" có="" pct="" và="" dct="" của="" động="" vật="" yotari="" cao="" hơn="" đáng="" kể="" so="" với="" pct="" và="" dct="" của="" động="" vật="" hoang="" dã="" (p=""><0,05, hình="" 3c).="" cường="" độ="" tín="" hiệu="" tại="" tất="" cả="" các="" thời="" điểm="" quan="" sát="" được="" từ="" nhẹ="" đến="" trung="" bình="" (bảng="" 2)="" và="" rải="" rác="" khắp="" tế="" bào="" chất="" (hình="">

Hình 5. Nhuộm huỳnh quang miễn dịch đối với loài hoang dại và yotari sau khi sinhthậnvới các đánh dấu NOTCH2 và LC3B và nhuộm immunoperoxidase với đánh dấu caspase3 (CASP3) đã phân cắt. (a – f) Nhuộm DAPI DNA hạt nhân được hợp nhất với NOTCH2 và LC3B. Các mốc thời gian quan sát được là P4, P11, P14. Sự biểu hiện của các dấu hiệu NOTCH2 và LC3B trong cầu thận (G), ống lượn gần (PCT) và ống lượn xa (DCT) được đánh dấu bằng các mũi tên. Đặc biệt có thể quan sát thấy phản ứng LC3B mạnh mẽ trong nang Bowman của các cầu thận đang phân hủy (dấu hoa thị, e). Phụ trang hiển thị biểu hiện nổi bật nhất trong hình ảnh. CASP3 được thể hiện kém trong tất cả các mốc thời gian được quan sát. Biểu hiện quan trọng duy nhất là ở cầu thận của chuột yotari trên P14 (mũi tên). Thanh tỷ lệ là 20 µm và đề cập đến tất cả các hình ảnh.

Trong cầu thận và DCT của cả hai kiểu gen động vật, tỷ lệ tế bào dương tính với LC3B tăng lên theo thời gian (p <0. 0="" 5,="" hình="" 3d).="" ở="" p11="" và="" p14,="" tỷ="" lệ="" tế="" bào="" dương="" tính="" trong="" cầu="" thận="" của="" động="" vật="" yotari="" cao="" hơn="" đáng="" kể="" so="" với="" cầu="" thận="" của="" động="" vật="" hoang="" dã="" (p=""><0. 05,="" hình="" 3d).="" ở="" cầu="" thận="" của="" động="" vật="" yotari="" cường="" độ="" nhuộm="" chủ="" yếu="" từ="" trung="" bình="" đến="" mạnh="" (bảng="" 2)="" nằm="" trong="" không="" gian="" cận="" nhân="" và="" hạt="" nhân="" (hình="" 5a-f),="" tại="" tất="" cả="" các="" điểm="" thời="" gian="" quan="" sát="" được,="" trong="" khi="" ở="" cầu="" thận="" của="" chuột="" hoang="" dã,="" cường="" độ="" là="" chủ="" yếu="" là="" trung="" bình="" (bảng="" 2).="" pct="" của="" yotari="" và="" động="" vật="" hoang="" dã="" chứa="" khoảng="" 20%="" ​​tế="" bào="" dương="" tính="" tại="" tất="" cả="" các="" thời="" điểm="" quan="" sát="" được="" (p=""><0,05, hình="">

Biểu thức CASP -3 đã xóaHầu như không có biểu hiện của CASP đã kích hoạt -3 trongthậnđộng vật hoang dã tại tất cả các thời điểm quan sát được. Trong PCT và DCT của chuột yotari, một số tế bào riêng lẻ đã dương tính với CASP -3- (Hình 3e). Chỉ trong cầu thận của thận yotari ở P14 (Hình 5e), tỷ lệ tế bào dương tính tăng lên đáng kể so vớithậncủa chuột kiểu hoang dã (p <0. 05, Hình 3e).

Thảo luận

Quả thậnhình thành và phát triển là những quá trình phức tạp được phối hợp một cách chính xác thông qua sự tác động lẫn nhau của một số lượng lớn các gen. Dị tật bẩm sinh củaquả thậnvà đường tiết niệu (CAKUT) là dị tật bẩm sinh phổ biến nhất, chiếm 23% tổng số các dị tật như vậy và là nguyên nhân hàng đầu của giai đoạn cuốibệnh thậnở trẻ em [28,29]. Các rối loạn gen đơn lẻ có thể là nguồn gốc chính của CAKUT, và cho đến nay, một đột biến ở hơn 20 gen đã được xác định là nguyên nhân gây ra CAKUT [30]. Như nghiên cứu trước đây của chúng tôi cho thấy sự biểu hiện tuyệt vời của DAB1 trong thời kỳ bào thai bình thường của con ngườiquả thận[9], chúng tôi giả định rằng DAB1 có thể đóng một vai trò quan trọng trong quá trìnhquả thậnsự phát triển. Để chứng minh giả thuyết của mình, chúng tôi đã điều traquả thậnhình thái và các kiểu biểu hiện của các protein reelin, NOTCH2, LC3B, và các protein CASP3 đã hoạt hóa ở chuột loại trực tiếp Dab1.

CISTANCHE SẼ CẢI THIỆN ĐAU KIDNEY / RENAL

Phân loại chuột yotarithậntiết lộ một vỏ não mỏng hơn và một trung bình nhỏ hơn đáng kểquả thậnvà đường kính PCT, DCT và G so với động vật hoang dã. Sự sụt giảm trongquả thậnkích thước do nguồn nephron không đặc hiệu gây ra được gọi làthậnhypoplasia, một trong những rối loạn CAKUT phổ biến nhất, có khuynh hướng tăng huyết áp khi trưởng thành và bệnh thận mãn tính [31]. Ngoài ra, các hình ảnh vi mô được chụp bằng TEM cho thấy chuột yotari có biểu hiện tổn thương tế bào podocyte nổi bật với quá trình hoạt động ở chân và thiếu các khe lọc. Sau khi bị thương, các tế bào podocytes trải qua quá trình tràn dịch trong đó chúng bị mất cấu trúc, dẫn đến việc giảm chức năng rào cản của chúng [32]. Tất cả các dạng hội chứng thận hư, cũng như bệnh xơ cứng cầu thận phân đoạn khu trú (FSGS), đều được đặc trưng bởi các khiếm khuyết trong cấu trúc hoặc chức năng của tế bào podocyte [33].

Nghiên cứu hiện tại của chúng tôi cho thấy sự biểu hiện cao nhất của DAB1 ở phần đỉnh và phần bên của màng tế bào của DCT, trong khi REELIN chủ yếu nằm rải rác khắp tế bào chất của PCT. Tại các thời điểm được khảo sát, không có thay đổi hình thái nào được quan sát thấy trong tubuli của chuột yotari, nhưng cần phải điều tra thêm để làm sáng tỏ vai trò của DAB1 trong các khoang của tubulointerstitial. Đôi khi có sự phân màu của các protein DAB1 và ​​REELIN, chủ yếu là trong DCT. Những kết quả tìm kiếm này tiếp nối công trình nghiên cứu trước đây của chúng tôi liên quan đến sự biểu hiện của hai loại protein này trong thời kỳ bào thai của con ngườiquả thậnphát triển [9]. Điều này có thể gợi ý rằng DAB1 và ​​reelin có vai trò tương tự đối với người và chuộtthậnbằng cách kích hoạt một số con đường xuôi dòng, chẳng hạn như các tầng tín hiệu Crk, MAPK và PI3K / Akt / mTOR [34–36]. Dữ liệu của chúng tôi cũng cho thấy biểu hiện reelin tăng lên trong cầu thận của chuột yotari. Điều thú vị là, một nghiên cứu trước đây đã chỉ ra rằng sự phosphoryl hóa DAB1 và ​​tăng biểu hiện reelin ở cầu thận đi kèm với tăng huyết áp, protein niệu và tổn thương tế bào podocyte ở chuột được truyền Ang II [10].

Ngoài ra, phương pháp nhuộm miễn dịch huỳnh quang cho thấy có sự gia tăng biểu hiện của các thụ thể NOTCH2 trong cầu thận của chuột P14 yotari. Rõ ràng là biểu thức NOTCH2 được điều chỉnh giảm khi đạt được sự trưởng thành của nephron, ngoại trừ trong các điều kiện củachấn thương thận,chẳng hạn như bệnh thận do đái tháo đường và FSGS [15,37]. Những con chuột mắc hội chứng thận hư do Adriamycin cũng cho thấy sự gia tăng biểu hiện của NOTCH2 được hoạt hóa, giúp cải thiện quá trình xơ hóa [38]. Tại các thời điểm điều tra, chúng tôi không nhận thấy sự gia tăng xơ hóa, nhưng nó vẫn làm sáng tỏ vai trò chính xác của NOTCH2 được biểu hiện trong yotari sau khi sinhthận.Cần quan sát thêm xem liệu các thay đổi sợi xơ có xảy ra trong các giai đoạn sau hay không. Tuy nhiên, đã có một số kết quả cho thấy tác dụng ngắn hạn của việc tăng hoạt hóa NOTCH2 có liên quan đến lợi ích sống sót mạnh mẽ cho các tế bào podocytes bị thương, vốn bị mất trong các mô hình dài hạn, chẳng hạn như bệnh thận do tiểu đường [39].

Biểu hiện LC3B cao hơn trong cầu thận của chuột yotari P11 và P14 có lẽ phản ánh sự tích tụ của các thể thực quản trong tế bào vỏ. Để hiển thị rõ ràng rằng autophagy đã được tăng tốc. Cần phân tích tỉ lệ biểu thức protein LC 3- II và LC 3- I. Trong điều kiện bình thường, autophagy là cần thiết để bình thườngchức năng thận[40], đặc biệt là ở tế bào vỏ. Do khả năng phân chia và thay thế tế bào bị hạn chế, chúng biểu hiện mức độ tự thực hiện cơ bản cao [41]. Bất chấp những kết quả này, sự gia tăng biểu hiện LC3B đã được báo cáo trong một số bệnh cầu thận [42-44], chủ yếu liên quan đến chứng căng thẳng ở chân và phát triển hội chứng thận hư, như đã thấy ở chuột loại trực tiếp có điều kiện thụ thể prorenin [45,46]. Tất cả những nghiên cứu này cho thấy vai trò bảo vệ của quá trình tự hấp thụ tăng cường trong các tình trạng bệnh lý, được hỗ trợ thêm bởi các kết quả của bệnh thận do Adriamycin gây ra, nơi tự động hấp thụ được kích hoạt để bảo vệ chống lại tổn thương tế bào nang [43], cũng như trong bệnh cầu thận phụ thuộc vào tuổi, nơi nó chậm phát triển. sự suy giảm chức năng tiến triển củachức năng thận[40]. Phân tích con ngườiquả thậnsinh thiết cũng cho thấy bằng chứng về sự gia tăng autophagy liên quan đến quá trình vận động ở chân trong một số bệnh cầu thận, bao gồm hội chứng thận hư thay đổi tối thiểu (MCNS), là một trong những nguyên nhân phổ biến nhất của hội chứng thận hư vô căn [19]. Trong điều kiện bệnh thận do tiểu đường và cấp tính do lipopolysaccharide gây rachấn thương thận,tăng cường autophagy với một số liệu pháp điều trị thông qua ức chế con đường PI3K / AKT / mTOR cải thiện chức năng thận [47,48]. Tất cả những kết quả này ám chỉ rằng autophagy có một vai trò bảo vệ tế bào không thể thiếu để thích ứng với căng thẳng trongchấn thương thận, và điều chế của nó có thể là một chiến lược điều trị đầy hứa hẹn, mặc dù, trong một số trường hợp, autophagy cũng có thể gây hại và tiến triển thành tế bào chết.

CISTANCHE SẼ CẢI THIỆN KIDNEY / RENAL THẤT BẠI

Ngoại trừ sự gia tăng trong chế độ autophagy, mức độ apoptosis tăng lên cũng có thể được quan sát thấy ở cầu thận của chuột P14 yotari. Autophagy thường ngăn chặn quá trình chết rụng, nhưng trong các trường hợp bệnh lý cụ thể, nó cũng có thể có tác động ngược lại đối với sự tồn tại của tế bào bằng cách tăng cường và thúc đẩy quá trình chết theo chương trình [42]. Sau khi sinh, apoptosis ởthậnbị giảm đi đáng kể, ngoại trừ trong các điều kiện củachấn thương thận,chẳng hạn như hội chứng thận hư vô căn, nơi góp phần phát triển bệnh [23]. nguyên nhân mới tiềm ẩn của các dị tật bẩm sinh lặn trên autosomal củaquả thậnvà đường tiết niệu. Tuy nhiên, vai trò chính của DAB1 trongquả thậnsự phát triển vẫn chưa rõ ràng. Ngoài ra, những con chuột này có biểu hiện bất thường về quá trình bàn chân và mức độ gia tăng của reelin, NOTCH2, LC3B và protein CASP3 bị phân cắt trong cầu thận có thể dẫn đến chấn thương cầu thận, như hội chứng thận hư, tương quan với chứng giảm sản, có thể là nguyên nhân tử vong. của những động vật này trong thời kỳ cai sữa. Để khẳng định giả thuyết này, cần cung cấp thêm thông tin liên quan đến huyết áp và các thông số phòng khám-xét nghiệm khác, chẳng hạn như mức độ creatinine huyết thanh, albumin và protein.