Phần một Phân cực Microglia M1 bị kìm hãm Acteoside thông qua con đường truyền tín hiệu NF-κB bị ức chế và phục hồi chức năng ty thể qua trung gian AMPK
Mar 03, 2022
để biết thêm thông tin: ali.ma@wecistanche.com
PHẦN 1 Làm thế nào để Cistanche Acteosides tăng cường sức sống của tế bào não và làm giảm bệnh Alzheimer?
Ying-Qi Li Đại học Dược Trung Quốc
Đại học Dược Trung Quốc Yi Chen
Đại học Dược phẩm Trung Quốc Si-Qi Jiang
Yuan-Yuan Shi Đại học Dược Trung Quốc
Xiao-Li Jiang Đại học Dược Trung Quốc
Đại học Dược Shan-Shan Wu Trung Quốc
Đại học Dược phẩm Ping Zhou Trung Quốc
Hui-Ying Wang Đại học Dược Trung Quốc
Đại học Dược phẩm Ping Li Trung Quốc
Từ khóa nghiên cứu: acteoside, Tế bào -2 BV, sự trao đổi chất, RNA-seq, ti thể, tế bào thần kinh
trừu tượng
Cơ sở: Bệnh Alzheimer (AD) là loại bệnh mất trí nhớ thường gặp nhất. Trong khiacteoside(ACT), một hợp chấtbị cô lậptừCistanche tubulosa, sở hữuđặc tính bảo vệ thần kinh. Tuy nhiên, cơ chế cơ bản trong việc điều chỉnh sự phân cực của microglia vẫn chưa được làm rõ. Phương pháp: Trong đây, mô hình AD cảm ứng AlCl 3- ở ấu trùng ngựa vằn đã được áp dụng để khám phá hiệu quả điều trị của ACT. Tế bào BV -2 đã được sử dụng để chứng minh vai trò của ACT đối với sự phân cực microglia. RNA- Sequence, HPLC-Q-TOF-MS, western blot, và gắn kết phân tử đã được kết hợp để tạo ra cơ chế của nó.
Kết quả: ACT cải thiện đáng kể chứng rối loạn vận động thực nghiệm và rối loạn hệ thần kinh ở ngựa vằn. Sau đó, nó ngăn chặn sự phân cực M1 và thúc đẩy kiểu hình M2 trong các tế bào BV -2 do LPS gây ra. Trước tiên, chúng tôi đã chứng minh rằng ACT có tác động sâu sắc đến quá trình phiên mã, liên quan đến việc điều chỉnh các con đường tín hiệu quan trọng trong quá trình viêm, sinh tổng hợp arginine, cũng như sinh tổng hợp pantothenate và CoA, tương quan với chức năng của ty thể. Điều trị ACT làm giảm phân cực microglia M1 bằng cách ức chế con đường tín hiệu NF-κB. Và các con đường trao đổi chất đã được tiếp tục điều chỉnh bởi HPLC-Q-TOF-MS. Ngoài ra, ACT điều chỉnh lại ROS quá mức để khôi phục chức năng của ty thể thông qua điều hòa PGC -1 và UCP {11}} qua trung gian AMPK, phù hợp với những thay đổi về trao đổi chất. Điều thú vị là ACT có thể liên kết trực tiếp với cả NF-κB và AMPK, bằng chứng là gắn kết phân tử. Kết luận: Nghiên cứu đã cung cấp một cơ chế xâm nhập của ACT và minh họa một quan điểm mới dựa trên rối loạn chức năng ty thể để tiết lộ mối liên hệ giữa sự trao đổi chất và sự phân cực microglia.
Tiểu sử
Bệnh Alzheimer (AD) là một bệnh thoái hóa thần kinh phổ biến kèm theo suy giảm nhận thức và rối loạn vận động [1]. Nó được đặc trưng bởi mất tế bào thần kinh nghiêm trọng, các mảng lão hóa và rối loạn nhịp thần kinh [2]. Cơ chế bệnh sinh của AD là đa chiều và có liên quan đến chứng viêm thần kinh. Viêm thần kinh được thúc đẩy bởi sự hoạt hóa của các tế bào thần kinh đệm, liên quan chặt chẽ đến sự phát triển của AD [3, 4]. Trong quá trình tiến triển và làm trầm trọng thêm bệnh viêm thần kinh, microglia được coi là yếu tố chính. Microglia là các tế bào miễn dịch chính trong hệ thần kinh trung ương. Nó liên kết chặt chẽ với một loạt các quá trình, bao gồm sự phát triển của não, duy trì một môi trường trung tính, cũng như phản ứng với chấn thương và sửa chữa [1]. Hơn nữa, microglia có thể được kích thích thành kiểu hình M1 và sự biểu hiện của các cytokine tiền viêm tăng lên khi các bệnh liên quan đến viêm thần kinh như AD xảy ra [5]. Các nghiên cứu cũng chứng minh rằng sự phân cực đối với kiểu hình M1 thường đi kèm với rối loạn chuyển hóa [6], gây mất cân bằng chuyển hóa năng lượng và rối loạn chức năng ty thể [7]. Những thay đổi bất lợi này bắt nguồn từ sự thoái hóa thần kinh, thậm chí là AD.
Acteoside(ACT), một glycoside phenylethanoid, chủ yếu có nguồn gốc từCistanchetubulosa. Ngày càng có nhiều bằng chứng cho thấy rằngHÀNH ĐỘNGsở hữu nhiều dược lýcác hoạt động, bao gồm tác dụng bảo vệ thần kinh [8], chống viêm [9] và chống oxy hóa [10]. Đặc biệt, ACT đã được báo cáo để cải thiện khả năng học tập và suy giảm trí nhớ cũng như điều chỉnh chuyển hóa năng lượng ở chuột gây ra bởi streptozotocin [11]. Nó cũng đã được đề xuất để ức chế sự chết của tế bào apoptotic thần kinh và tổn thương ty thể ở chuột bị viêm não tự miễn thực nghiệm [12]. Tuy nhiên, có ít nghiên cứu hơn tập trung vào ảnh hưởng của ACT đối với sự phân cực microglia M1 / M2. Đặc biệt, các cơ chế khác nhau, chẳng hạn như sửa chữa chức năng của ty thể và điều chỉnh sự trao đổi chất của tế bào, đã không được thực hiện. Ngoài ra, cơ chế củaHÀNH ĐỘNGgóp phần vào sự phân cực microglia M1 / M2 vẫn chưa được khám phá. Báo cáo này nhằm mục đích điều tra hiệu quả điều trị của ACT cũng như cơ chế phân tử cơ bản củaHÀNH ĐỘNGTrongQUẢNG CÁO. Đây,HÀNH ĐỘNGcho thấy tác dụng bảo vệ thần kinh đáng kể ở ấu trùng cá ngựa vằn AD gây ra AlCl 3-. Ngoài ra, ACT ức chế hiệu quả sự phân cực M1 và thúc đẩy kiểu hình M2 trong các tế bào BV -2 do LPS gây ra. Giải trình tự RNA (RNA-Seq) được tích hợp với phương pháp chuyển hóa để hiểu rõ hơn về cơ chế cơ bản của ACT trong việc điều chỉnh sự phân cực microglia. Đã nghiên cứu sự nhiễu xuyên âm giữa sự trao đổi chất và sự phân cực microglia về chức năng của ty thể. Nghiên cứu này sẽ cung cấp sự tôn trọng mới cho việc nghiên cứu thêm về ACT như một tác nhân điều trị tiềm năng để điều trị AD.
Phương pháp
Động vật và phân nhóm mô hình
Ngựa vằn hoang dã (dòng AB, 4 tháng tuổi) được chọn trong nghiên cứu này (Công ty TNHH Công nghệ sinh học Nam Kinh Qi Wu). Chúng được duy trì theo chu kỳ sáng / tối 14/1 0 giờ ở 28 độ, theo phương pháp trước đó [13]. Phân bón tự nhiên và phôi phát triển bình thường được tạo ra và nuôi cấy đến 3 ngày sau khi thụ tinh (pdf) trong tủ ấm chiếu sáng. Tất cả các thí nghiệm với cá ngựa vằn đều được thực hiện dưới sự giám sát của Ủy ban Đạo đức Động vật của Đại học Dược Trung Quốc. Ấu trùng cá ngựa vằn được chia thành sáu nhóm và được xử lý từ 3 pdf đến 7 pdf: nhóm đối chứng, nhóm mô hình, nhóm mô hình cộng với donepezil hydrochloride (DPZ), nhóm mô hình cộng với ACT. Nhóm đối chứng được duy trì trong môi trường với 0,2% DMSO và nhóm mô hình được xử lý với 150 μM AlCl3 (pH 5,8). Mô hình cộng với nhóm DPZ được đồng xử lý với AlCl3 và 8 μM DPZ. Mô hình cộng với các nhóm ACT được đồng xử lý với AlCl3 và các nồng độ khác nhau của ACT (200, 100, 50 μM). ACT (độ tinh khiết HPLC Lớn hơn hoặc bằng 98 phần trăm) được lấy từ Baoji Herbest Bio-Tech Co., Ltd. (Baoji, Trung Quốc). AlCl3 · 6H2O và DPZ được mua từ Công ty TNHH công nghệ sinh học Aladdin Thượng Hải. (Thượng Hải, Trung Quốc).
Phân tích hành vi Trang 3/34 Các chuyển động của ấu trùng cá ngựa được ghi lại bằng máy phân tích hành vi ViewPoint (Zebralab 2018, ViewPoint Life Sciences Co., Ltd.) ở 28 độ. Tóm lại, các tham số hành vi và xử lý kết quả phù hợp với phương pháp mà chúng tôi đã thiết lập trước đó [13]. Ở đây, tốc độ trung bình (AS), tốc độ thay đổi (ΔS), tốc độ phục hồi rối loạn vận động (DRR) và hiệu quả phản ứng (RE, phần trăm) được chọn để đánh giá khả năng phục hồi rối loạn vận động ở cá ngựa vằn.
Xác định hoạt tính của acetylcholinesterase (AChE) và choline acetyltransferase (ChAT)
Sau khi xử lý từ 3 pdf đến 7 pdf, ấu trùng cá ngựa vằn được thu thập để đo hoạt động AChE và ChAT.
Dựa trên quy trình của nhà sản xuất, hoạt tính được phát hiện bằng bộ dụng cụ xét nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết với enzym (ELISA) (Công ty TNHH công nghệ sinh học MLBIO, Thượng Hải, Trung Quốc). Và nồng độ protein của các mẫu khác nhau được xác định bằng phương pháp BCA
Nuôi cấy tế bào và phương pháp điều trị
Dòng tế bào BV -2 (dòng tế bào vi mô chuột bất tử) được mua từ American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA). Chúng được nuôi ở DMEM (KeyGen Biotech Co., Ltd, Nam Kinh, Trung Quốc). Môi trường được bổ sung 10% FBS (Gibco, Grand Island, NY, USA), 100 U / mL penicillin, cũng như 100 mg / mL streptomycin, với 95% không khí / 5% CO2 ở 37 độ. Tế bào BV -2 được ủ với ACT (50, 25, 12,5 μM) hoặc được kích thích bằng Lipopolysaccharide (LPS, 1 ug / mL; Sigma-Aldrich, St Louis, MO, Hoa Kỳ) trong 24 giờ. Cuối cùng, tất cả các tế bào hoặc chất nổi phía trên được thu thập cho các phân tích khác nhau.
Thử nghiệm khả năng tồn tại của tế bào
Thử nghiệm Bộ đếm Tế bào -8 (CCK -8) (Viện Kỹ thuật Sinh học JianCheng, Nam Kinh, Trung Quốc) được sử dụng để đánh giá khả năng sống sót của các tế bào BV -2. Các tế bào được gieo hạt trong 96- đĩa giếng (1 × 104 tế bào / giếng, Wuxi NEST Biotechnology Co., Ltd.). Một cách ngắn gọn, môi trường đã được loại bỏ khi kết thúc xử lý và 100 μL môi trường không chứa huyết thanh chứa dung dịch CCK -8 được thêm vào mỗi giếng trong 2 giờ ở 37 độ. Độ hấp thụ được đo ở bước sóng 450 nm bằng đầu đọc vi tấm (Bio-Tek Instrument, Winooski, VT, USA). Khả năng sống sót của tế bào được biểu thị bằng phần trăm của nhóm đối chứng. Thí nghiệm được lặp lại ba lần.
Thử nghiệm sản xuất oxit nitric (NO)
NO được xác định bằng cách đo mức nitrit trong bề mặt nuôi cấy BV -2 sử dụng thuốc thử Griess. Brie§y, khi kết thúc quá trình xử lý, môi trường (100 μL) được chuyển sang một đĩa giếng 96- mới. Cùng một thể tích Trang 4/34 thuốc thử Griess được thêm vào mỗi giếng và phản ứng trong 15 phút trong bóng tối. Sự hấp thụ ở bước sóng 540 nm được xác định bằng Microplate Reader.
Mức độ cytokine gây viêm trong phần nổi
Nồng độ TNF-, IL -1 và IL -10 trong phần nổi của tế bào BV -2 được xác định bằng bộ dụng cụ ELISA theo hướng dẫn của nhà sản xuất (MLBIO biotechnology Co. Ltd., Thượng Hải, Trung Quốc ).
Quan sát hình thái tế bào
Để xác định ảnh hưởng của ACT đối với sự phân cực M1 / M2 của tế bào BV -2, tế bào được mạ trong đĩa 6- giếng và quan sát dưới kính hiển vi đảo ngược (Nikon ECLIPSE Ti2, Nhật Bản).
Xác định chuyển hóa tế bào bằng phân tích HPLC-Q-TOF-MS
Tế bào BV {{0}} đã được gieo hạt trong một 6- đĩa riêng biệt (n =6 / nhóm). Sau khi xử lý, môi trường được loại bỏ, và các tế bào được rửa ba lần bằng PBS lạnh. Sau đó ngay lập tức tiếp xúc với nitơ lỏng để ngăn chặn sự trao đổi chất của tế bào. Tế bào được thu hoạch bằng metanol 8 0 phần trăm lạnh (1 mL / giếng) và huyền phù được chuyển vào ống Eppendorf 2 mL. Để tạo điều kiện kết tủa protein, xoáy mạnh trong 1 phút và ly tâm ở tốc độ 13, 000 vòng / phút trong 15 phút ở 4 độ. Huyền phù tế bào được chuyển sang ống Eppendorf 2 mL mới và được làm khô dưới dòng nitơ và được bảo quản ở -80 độ cho đến khi phân tích. Phần cặn đã làm khô được hoàn nguyên trong 15 {{4 0}} μL axetonitril 25% đã làm lạnh trước. Để đảm bảo tính ổn định và độ chính xác của phân tích trình tự, các thể tích bằng nhau (1 0 μL) của mỗi mẫu tế bào được kết hợp làm mẫu kiểm soát chất lượng (QC). Trong quá trình phát hiện chất chuyển hóa, những mẫu này được tiêm sau mỗi sáu mẫu tế bào để đảm bảo độ ổn định của chúng. Một lượng nhỏ 1 μL đã được tiêm cho HPLC-Q-TOF-MS. Phân tích HPLC-Q-TOF-MS được thực hiện trên hệ thống Agilent 1290 HPLC được kết nối với khối phổ kế thời gian bay tứ cực Agilent 6530 (Q-TOF) (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA). Việc phân tách được thực hiện trên cột ACQUITY UPLC BEH C18 (2,1 × 1 00 mm, 1,7 μm). Pha động bao gồm 0,1% axit fomic (v / v; A) và axetonitril (B). Tốc độ §ow được đặt ở 0,4 mL / phút với điều kiện rửa giải gradient tối ưu sau: 0 đến 2 phút, 5 phần trăm B; 2 đến 20 phút, 5 phần trăm đến 95 phần trăm B (chế độ ion dương); 0 đến 2 phút, 5 phần trăm B; 2 đến 20 phút, 5 phần trăm đến 95 phần trăm B (chế độ ion âm). Các thông số hoạt động của khối phổ kế được thiết lập như sau: nhiệt độ khí, 320 độ; khí làm khô, 10 L / phút; máy phun sương, 35 psi; VCap, 4000 V; mảnh, 120 V. Dữ liệu thô được vận hành theo phần mềm MassHunter Workstation phiên bản B.07.00 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA). Dữ liệu thô đã được xử lý trước bởi nền tảng XCMS. Phân tích thành phần chính (PCA) và phân tích phân biệt bình phương nhỏ nhất một phần (PLS-DA) của dữ liệu chuẩn hóa được thực hiện với MetaboAnalyst (https://www.metaboanalyst.ca). Kết hợp với tài liệu, các chất chuyển hóa khác biệt (VIP> 1, T-test P <0,05) được="" xác="" định="" trên="" hmdb="" (https://hmdb.ca).="" cuối="" cùng,="" phân="" tích="" lộ="" trình="" đã="" được="" thực="" hiện="" với="">
Đo điện thế màng ty thể (MMP)
MMP được phát hiện bằng cách sử dụng đầu dò §uorescent JC -1 (Beyotime, Trung Quốc) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Tóm lại, các tế bào từ các nhóm khác nhau được rửa bằng PBS và ủ với dung dịch nhuộm JC -1 trong 20 phút ở 37 độ. Sau khi nhuộm, tế bào được rửa hai lần bằng cách sử dụng đệm nhuộm. Sau đó, tín hiệu huỳnh quang được phát hiện bằng phương pháp đo tế bào dòng chảy (BD Accuri C6).
Đo lượng adenosine 5'-triphosphate (ATP) của ty thể
Nồng độ ATP trong ty thể được phát hiện bằng Bộ xét nghiệm ATP (Beyotime, Trung Quốc) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Tóm lại, môi trường nuôi cấy các tế bào BV -2 từ các nhóm khác nhau đã bị loại bỏ và các tế bào được đồng nhất với dung dịch đệm ly giải trên đá. Phần nổi phía trên thu được sau khi ly tâm (12, 000 g, 5 phút) được sử dụng để xác định nồng độ ATP. Sự phát quang (phản ứng §uorescein xúc tác luciferase) được phát hiện bởi EnVision Multimode Microplate Reader (PerkinElmer).
Đo mức oxy phản ứng nội bào (ROS)
Bộ thử nghiệm ROS (Beyotime, Trung Quốc) được sử dụng để đo mức ROS. Các tế bào từ các nhóm khác nhau được ủ với DCFH-DA (10 μM) trong 20 phút ở 37 độ. Sau khi nạp đầu dò, các tế bào được rửa ba lần bằng DMEM. Sau đó, tín hiệu huỳnh quang § được phát hiện bằng phương pháp đo tế bào dòng chảy (BD Accuri C6)
Kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM)
BV -2 tế bào đã được gieo vào đĩa 6- tốt. Môi trường được loại bỏ và 1 mL 2,5% glutaraldehyde nhanh chóng được thêm vào mỗi giếng. Sau đó, các tế bào được chuyển vào ống Eppendorf 1,5 ml và ly tâm ở tốc độ 1000 vòng / phút trong 3 phút. Các tế bào được cố định qua đêm với 2,5% glutaraldehyde mới ở 4 độ. Sau khi xúc tác, khử nước và nhúng, các tế bào được quan sát bằng kính hiển vi điện tử truyền qua HT7800 (Hitachi, Tokyo, Nhật Bản).
Phân tích dữ liệu RNA-seq và thông tin sinh học
RNA tổng số từ BV -2 tế bào (n=3 / group) được chiết xuất bằng thuốc thử Trizol (Vazyme Biotech, Trung Quốc) theo hướng dẫn của nhà sản xuất thuốc thử. Tất cả các mẫu phân tích đã được gửi đến Majorbio (Công ty TNHH Công nghệ sinh học Majorbio Thượng Hải) để thực hiện xét nghiệm trình tự RNA. Dữ liệu được phân tích trên nền tảng trực tuyến miễn phí của Nền tảng đám mây Majorbio. Các tham số cho phép phân tích biểu thức vi phân làP-adjust <0. 05 và|log2FC |Lớn hơn hoặc bằng1. Dữ liệu trình tự gốc đã được gửi vào cơ sở dữ liệu của Kho lưu trữ đọc trình tự NCBI (SRA).
Định lượng phản ứng chuỗi polymerase thời gian thực (qRT-PCR)
Tổng số RNA của các tế bào BV -2 trong mỗi nhóm được thu hoạch bằng cách sử dụng Thuốc thử phân lập RNA-easyTM 500 μL (Vazyme Biotech, Trung Quốc) và phản ứng phiên mã ngược được thực hiện với FastKing-RT SuperMix (TIANGEN Biotech, Trung Quốc) . Các phản ứng được thực hiện theo quy trình của nhà sản xuất. cDNA đã được thử nghiệm qRT-PCR với mồi đặc biệt và TransStart TOP Green qPCR SuperMix (TransGen Biotech, Trung Quốc). Các mồi được liệt kê trong Bảng S1 (xem Tệp bổ sung 1) và -actin được sử dụng làm kiểm soát nội bộ. Phương pháp 2- ΔΔCT được sử dụng để phân tích định lượng.
Phân tích Western blot
Tế bào BV -2 được ly giải bằng đệm ly giải RIPA (KeyGen Biotech Co., Ltd, Nam Kinh, Trung Quốc) có chứa 1 phần trăm Protease In inhibitor Cocktail (Thermo Fisher) để thu được tổng số protein. 10% SDS-PAGE được thực hiện để tách các protein, được chuyển vào màng NC. Sau khi ngăn bằng sữa tách béo 5% / BSA trong 2 giờ, các màng được ủ với AMPK (Proteintech), p-AMPK (A¨nity Biosciences), PGC -1 (Proteintech), NF-κB (Proteintech), kháng thể p-NF-κB (ABclonal), hoặc GAPDH (ABclonal) trong 5% TBST ở 4 độ qua đêm. Các màng này được ủ với kháng thể liên hợp peroxidase từ cải ngựa thứ cấp (ABclonal) trong 1 giờ ở nhiệt độ phòng. Chất nền thấm nước phía tây ECL có độ phân giải cao (Tanon, Trung Quốc), hệ thống hình ảnh Gel (Tanon, Trung Quốc) và phần mềm ImageJ đã được sử dụng để hiển thị và định lượng.
Gắn kết phân tử
Phân tích gắn kết phân tử được thực hiện bằng phần mềm Autodock (Phiên bản 4.2). Ái lực giữa ACT và protein được quan sát bằng phần mềm AutodockTools. Các cấu trúc protein ba chiều (3D) của AMPK (PDB ID: 5g5j) và NF-κB (PDB ID: 4q3j) được truy xuất từ Ngân hàng dữ liệu protein
Phân tích thống kê
Tất cả dữ liệu được biểu thị dưới dạng giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn (SD). Sự khác biệt giữa các nhóm khác nhau được phân tích bằng phân tích phương sai một chiều (ANOVA), sau đó là bội số của Tukey.
Kết quả
ACT làm giảm chứng rối loạn vận động và cải thiện chức năng hệ thống cholinergic ở ấu trùng cá ngựa vằn
Mô hình AD cảm ứng AlCl 3- ở ấu trùng cá ngựa vằn đã được sử dụng để chứng minh ảnh hưởng của ACT trên AD. Đầu tiên, sự di chuyển của ấu trùng cá ngựa vằn trong chu kỳ sáng / tối đã được quan sát và các đường bơi của chúng được ghi lại (Hình 1a, 1b). AS và ΔS của chuyển động cá ngựa vằn do AlCl3 gây ra trong thời gian tương ứng sau khi dùng thuốc đã được tính toán. Kết quả cho thấy các liều ACT khác nhau đã làm tăng AS và ΔS của cá ngựa vằn một cách hiệu quả (Hình 1c). DRR và RE đã khám phá ra một so sánh trực quan hơn giữa ACT và DPZ (Hình 1d). Theo đó, ACT làm dịu chứng rối loạn vận động, cho thấy những tác dụng tương tự như DPZ. Người ta thường đồng ý rằng hệ thống cholinergic đóng một vai trò quan trọng trong quá trình học tập và ghi nhớ. Do đó, các hoạt động của AChE và ChAT đã được sử dụng để tiết lộ tác dụng của ACT. Tiếp xúc với AlCl3 ở cá ngựa vằn gây ra sự thay đổi hệ cholinergic trong não (Hình 1e). Điều nổi bật là điều trị ACT đã ngăn chặn hoạt động của AChE. Ngoài ra, hoạt động của ChAT giảm sau khi điều trị ACT. Tóm lại, ACT cho thấy tác động sâu sắc đến chức năng hệ thống cholinergic ở ấu trùng cá ngựa vằn AD gây ra AlCl 3-.
ACT triệt tiêu sự phân cực M1 và thúc đẩy sự phân cực M2 trong các tế bào BV -2 do LPS gây ra
Tác động của ACT đối với sự phân cực microglia đã được nghiên cứutrong ống nghiệmsử dụng tế bào vi mô BV -2. LPS làm giảm đáng kể khả năng tồn tại của tế bào BV -2 sau khi được điều trị 24 giờ. May mắn thay, ACT đã làm tăng khả năng tồn tại tế bào của các tế bào BV -2 do LPS gây ra (Hình 2a). Ngoài ra, hình thái của tế bào BV -2 đã được quan sát. Sau 24 giờ kích thích LPS, nó cho thấy rằng các tế bào BV -2 trải qua trạng thái phân cực M1. Và những thay đổi về hình thái đã được ngăn chặn bằng đồng điều trị ACT (Hình 2b). Hơn nữa, kết quả chỉ ra rằng không giống như các tế bào BV -2 được kích thích bởi LPS, các tế bào BV -2 được đồng xử lý với ACT hiển thị TNF bị ức chế đáng kể (Hình 2c), IL -1 ( Biểu thức hình 2d) và NO (Hình 2f) trong phần nổi của tế bào. Đây là các cytokine tiền viêm cổ điển như là chất chỉ điểm của sự phân cực vi mô M1. Tương tự như kết quả của ELISA, kết quả của qPCR phát hiện ra rằng TNF-, nitric oxide synthase (iNOS), IL -1 và CD 86 biểu thức mRNA là signifikhông thể bị ức chế bởi điều trị ACT so với nhóm LPS (Hình 3a). Hơn nữa, chúng tôi đo mức độ phân cực microglia M2 bằng ELISA (Hình 2e) và qPCR (Hình 3b), kết quả chỉ ra rằng ACT làm tăng đáng kể mức độ biểu hiện dấu hiệu liên quan đến microglia M2 (IL -10, CD206 , TGF- và Arg -1). Tổng hợp lại, những kết quả này cho thấy ACT ức chế sự phân cực của microglia M1 và thúc đẩy kiểu hình M2.
Sự phân cực M1 / M2 được điều chỉnh bởi ACT thông qua sự ức chế con đường tín hiệu NF-κB trong các tế bào BV -2 do LPS gây ra
Phân tích phiên mã được thực hiện bởi RNA-seq để hiểu cơ chế của ACT trong tế bào BV -2 ở mức độ tổng thể. PCA đã minh họa rằng các nhóm kiểm soát, LPS và ACT có thể được phân biệt rõ ràng (Hình 4a). Nó cho thấy 899 gen biểu hiện khác biệt (DEG) giữa nhóm chứng và nhóm LPS, trong khi 49 DEG là giữa nhóm LPS và nhóm ACT (Hình 4b). Nhất quán, phân tích làm giàu Gene Ontology (GO) (Hình 4c) và phân tích làm giàu Genes và Genome trong Bách khoa toàn thư Kyoto (KEGG) (Hình 4d) đã phát hiện ra rằng ảnh hưởng của ACT có liên quan đến lộ trình tín hiệu NF-κB. Bộ gen liên quan đến con đường tín hiệu NF-κB đã được xác nhận thêm và cân bằng nội môi của chúng chắc chắn bị ảnh hưởng bởi LPS. Đúng như dự đoán, ACT ảnh hưởng đáng kể đến các biểu hiện của chúng (Hình 4e). Một con đường tín hiệu NF-κB là một con đường cổ điển để điều chỉnh sự tiến triển của quá trình viêm, cuối cùng dẫn đến việc giải phóng các yếu tố gây viêm. Để có được sự hỗ trợ về mặt cơ học, một protein quan trọng của lộ trình tín hiệu NF-κB đã được đánh giá bằng phân tích Western blot. Kích thích LPS dẫn đến kích hoạt NF- κB, liên quan đến việc thúc đẩy phân cực M1. Phù hợp với phân tích RNA-seq, ACT ức chế sự phosphoryl hóa NF-κB do LPS kích thích (Hình 4f). Do đó, ACT làm giảm sự phân cực M1 do LPS gây ra thông qua con đường tín hiệu NF-κB trong các tế bào BV -2.
ACT suy giảm sinh tổng hợp arginine cũng như sinh tổng hợp pantothenate và CoA trong các tế bào BV -2 do LPS gây ra
RNA-seq đã chứng minh rằng các con đường bị ảnh hưởng bởi ACT cũng bao gồm sinh tổng hợp arginine (Arg) cũng như sinh tổng hợp pantothenate và CoA (Hình 4d). Và có ý kiến cho rằng kích thích LPS gây ra rối loạn chuyển hóa tế bào BV -2 liên quan đến phân cực M1 [14]. Do đó, một bộ chuyển hóa tế bào không được nhắm mục tiêu bởi HPLC-Q-TOF-MS đã được sử dụng để xác định ảnh hưởng của ACT đối với sự trao đổi chất của tế bào. PCA (Hình 5a) và PLS-DA (Hình 5b) đã minh họa rằng các nhóm chứng, LPS và ACT có thể được phân biệt rõ ràng dựa trên các chất chuyển hóa nội bào. Mức độ của các chất chuyển hóa khác nhau trong tế bào BV -2 do LPS gây ra đã thay đổi sau khi điều trị ACT (Hình 5c). So với nhóm chứng, có 11 chất chuyển hóa thay đổi đáng kể trong nhóm LPS (Bảng S2, xem Phần bổ sung 2). Trong khi đó 14 chất chuyển hóa bị thay đổi rõ rệt sau khi điều trị ACT (Bảng S3, xem Phần bổ sung le 3), liên quan đến 11 con đường chuyển hóa (Hình 5d). Tác dụng của ACT chủ yếu bao gồm điều hòa chuyển hóa axit amin (sinh tổng hợp phenylalanin, tyrosine, và tryptophan, chuyển hóa D-Glutamine và D-glutamate, sinh tổng hợp Arg, chuyển hóa phenylalanin), chuyển hóa nucleotide (chuyển hóa purin, chuyển hóa pyrimidine), chuyển hóa năng lượng (nitơ sự trao đổi chất), cũng như sự trao đổi chất của các chất đồng yếu tố và vitamin (sinh tổng hợp pantothenate và CoA). Điều thú vị là các con đường trao đổi chất thu được bởi bộ chuyển hóa phù hợp với RNA-seq, bao gồm sinh tổng hợp Arg cũng như sinh tổng hợp pantothenate và CoA. Những điều trên cho thấy ACT có thể điều chỉnh sinh tổng hợp Arg cũng như sinh tổng hợp pantothenate và CoA trong các tế bào BV -2 được LPS kích thích.
Hành động Giảm nhẹ Bv do Lps gây ra -2 Rối loạn chức năng ty thể
Ti thể là cốt lõi của các con đường trao đổi chất. Bằng chứng đang phát triển rằng ty thể đóng vai trò quan trọng trong sự phân cực M1 / M2 của tế bào vi mô. Nghiên cứu trước đây đã chứng minh rằng LPS có thể gây ra rối loạn chức năng ti thể. Tổng quan về tình trạng ty thể về hình thái và sự phân bố tế bào được đánh giá bởi TEM. Sau khi kích thích LPS, các tế bào BV -2 cho thấy sự ngưng tụ chất nhiễm sắc ở nhân, giảm tế bào chất, cũng như ít ti thể hơn (Hình 6a). Ngoài ra, các khuyết tật ty thể của nhóm LPS bị phân tán hoặc thậm chí biến mất, biểu hiện sự tê liệt một phần, giảm kích thước và hình thái hình tròn. Điều thú vị là điều trị ACT có thể làm giảm bớt những thay đổi hình thái do LPS gây ra trong ty thể. Lần lượt, chúng tôi đã kiểm tra chức năng ty thể của các tế bào BV -2 được điều trị bằng LPS, bao gồm MMP và sản xuất ATP của ty thể. Sản xuất MMP (Hình 6b, 6c) và ATP trong ti thể (Hình 6d) đã được cải thiện đáng kể trong các tế bào được điều trị bằng ACT so với những tế bào trong nhóm LPS. Rối loạn chức năng ti thể có thể liên quan đến mức độ tăng ROS trong tế bào. Phân tích lưu lượng tế bào cho thấy rằng nội dung của ROS đã quá tải trong nhóm LPS (Hình 6e, 6f). May mắn thay, ACT đã loại bỏ ROS quá mức. Nó gợi ý rằng ACT có thể khôi phục chức năng của ty thể bằng cách xóa ROS.
ACT đã khôi phục chức năng ti thể thông qua việc điều chỉnh PGC -1 và UCP -2
Chất đồng hoạt hóa thụ thể kích hoạt tăng sinh peroxisome -1 (PGC -1) đóng một vai trò quan trọng trong quá trình sinh học ty thể[15]. Sự kích thích của LPS làm giảm biểu hiện của PGC -1, biểu hiện rối loạn chức năng ti thể. Đáng chú ý, sự biểu hiện protein và mRNA của gen PGC -1 đã bị đảo ngược đáng kể khi điều trị ACT trong các tế bào BV -2 được điều trị bằng LPS (Hình 7a). Protein tách rời ty thể -2 (UCP -2) cũng được biết là điều chỉnh các chức năng của ty thể. Là một protein hạ lưu của PGC -1, nó có thể kiểm soát quá trình khử cực MMP do LPS gây ra và sản xuất ROS. Các báo cáo gần đây chỉ ra rằng nó là trung tâm của quá trình kích hoạt tế bào vi mô, với quy định ngược lại của phân cực M1 và M2[16]. Kết quả Western blot cho thấy mức protein UCP -2 đã giảm sau khi kích thích LPS. Việc đồng xử lý LPS và ACT có thể điều chỉnh sự biểu hiện của UCP -2 so với việc xử lý LPS. Mức độ biểu hiện mRNA của UCP -2 cũng cho thấy những thay đổi tương tự (Hình 7b). Kết hợp với nhau, ACT đã khôi phục chức năng của ty thể thông qua việc điều chỉnh PGC -1 và UCP -2.
ACT kìm hãm sự phân cực microglia M1 thông qua phục hồi chức năng ti thể thông qua kích hoạt AMPK
Protein kinase kích hoạt AMP (AMPK), là cảm biến năng lượng chính của tế bào, đóng một vai trò quan trọng trong việc duy trì sự cân bằng trao đổi chất của tế bào. Đồng thời, PGC -1 là một protein hạ lưu của AMPK. Kết quả phát hiện ra rằng LPS ức chế sự hoạt hóa của AMPK, dẫn đến rối loạn chuyển hóa tế bào và rối loạn chức năng ti thể. Đáng chú ý là ACT có thể làm tăng biểu hiện protein của p-AMPK một cách phụ thuộc vào liều lượng (Hình 8a). Người ta cho rằng ACT có thể làm tăng sự biểu hiện của PGC -1 và khôi phục chức năng của ty thể bằng cách kích hoạt con đường tín hiệu AMPK. Trong nghiên cứu này, để điều tra xem sự hoạt hóa của AMPK có góp phần vào tác động điều chỉnh của ACT trên phân cực M1 / M2 hay không, hợp chất C (CC) đã được sử dụng để ức chế tác dụng của AMPK. Ngược lại với mức NO được điều chỉnh thấp hơn trong nhóm điều trị ACT, CC đã ngăn chặn một phần ảnh hưởng của ACT đến mức NO (Hình 8d). Dựa trên những kết quả này, ACT có thể điều chỉnh sự phân cực M1 / M2 của tế bào BV -2 bằng cách kích hoạt AMPK.
ACT liên kết và ức chế NF-κB cũng như AMPK hoạt hóa
Việc gắn kết phân tử đã được áp dụng để xác nhận liệu ACT có liên kết với protein NF-κB và AMPK hay không. Kết quả chứng minh rằng năng lượng liên kết của ACT và NF-κB là - 8,4 kcal / mol, của ACT và AMPK là - 10,8 kcal / mol. Các cộng đồng quan trọng đã xác minh rằng ACT liên kết trực tiếp với NF-κB và AMPK (Hình 9). Sau đó, các chế độ liên kết và tương tác có thể có trong túi axit amin được khám phá thêm, bao gồm Phe A146, Pro A147, Asn A240, Leu A236, Arg A232, His A183, Arg A239, Glu A179, Cys A149 và Tyr A227 của NF -κB (Hình 9c) cũng như Phe A213, Gly A481, Ala A370, Leu A482, Arg A212, Ile A369, Arg A106, Phe A215, Phe A108, Thr A309, Ser A119 và Thr A224 của AMPK (Hình . 9f). Những kết quả này chỉ ra rằng ACT có thể ảnh hưởng trực tiếp đến NF-κB và AMPK để làm giảm sự phân cực của BV -2 microglia M1 và thúc đẩy kiểu hình M2.
