Quá trình chuyển đổi tích cực của giai đoạn ký ức sợ hãi từ tái hợp nhất đến tuyệt chủng thông qua ngăn ngừa tái hợp nhất qua trung gian ERK

Liên hệ: Audrey Hu Whatsapp / hp: 0086 13880143964 Email:audrey.hu@wecistanche.com

Việc lấy lạinỗi sợkỉ niệmgây ra hai quá trình bộ nhớ đối lập, tức là, hợp nhất lại và tắt. Thu hồi ngắn hạn tạo ra sự hợp nhất để duy trì hoặc tăng cường nỗi sợ hãikỉ niệm, trong khi việc truy xuất kéo dài sẽ dập tắt ký ức này. Mặc dù các cơ chế của sự tái hợp nhất và sự tuyệt chủng đã được nghiên cứu, vẫn chưa rõ làm thế nào mà các giai đoạn ký ức sợ hãi được chuyển từ trạng thái hợp nhất sang tuyệt chủng trong quá trình truy xuất bộ nhớ. Ở đây, chúng tôi chỉ ra rằng quá trình chuyển đổi bộ nhớ phụ thuộc kinase (ERK) được điều chỉnh tín hiệu ngoại bào sau khi truy xuất sẽ điều chỉnh quá trình chuyển đổi các giai đoạn bộ nhớ từ tái hợp nhất sang tuyệt chủng bằng cách ngăn chặn cảm ứng tái hợp nhất trong nhiệm vụ tránh ức chế (IA) ở chuột đực. Đầu tiên, giai đoạn bộ nhớ chuyển tiếp, có thể hủy bỏ cảm ứng tái hợp nhất, nhưng không đủ để tiếp nhận sự tuyệt chủng, được xác định sau khi tái hợp nhất, nhưng trước giai đoạn tuyệt chủng. Thứ hai, các giai đoạn tái hợp nhất, chuyển tiếp và tuyệt chủng sautruy xuất bộ nhớcho thấy các dấu hiệu phân tử và tế bào khác biệt thông qua protein liên kết yếu tố đáp ứng cAMP (CREB) và sự phosphoryl hóa ERK trong hạch hạnh nhân, hồi hải mã và vỏ não trung gian trước trán (mPFC). Giai đoạn tái hợp nhất cho thấy quá trình phosphoryl hóa CREB tăng lên, trong khi giai đoạn tuyệt chủng cho thấy một số quần thể thần kinh với nhiều sự kết hợp khác nhau của sự phosphoryl hóa CREB và / hoặc ERK, trong các vùng não này. Điều thú vị là ba giai đoạn bộ nhớ, bao gồm cả giai đoạn chuyển tiếp, cho thấy sự kích hoạt ERK thoáng qua ngay sau khi truy xuất. Quan trọng nhất, việc phong tỏa ERK trong hạch hạnh nhân, hồi hải mã hoặc mPFC ở giai đoạn bộ nhớ chuyển tiếp đã ngăn cản sự tăng cường tái hợp nhất của bộ nhớ IA. Những quan sát này cho thấy rằng con đường tín hiệu ERK chủ động điều chỉnh sự chuyển đổi của giai đoạn ký ức từ tái hợp nhất sang tuyệt chủng và quá trình này hoạt động như một công tắc hủy bỏ sự tái hợp nhất của nỗi sợ hãi.kỉ niệm.

Từ khóa: ERK; sự tuyệt chủng; ký ức sợ hãi; sự hợp nhất lại; chuyển tiếp

1 Phòng Khoa học Sinh học, Khoa Khoa học Đời sống, Đại học Nông nghiệp Tokyo, Tokyo 156-8502, Nhật Bản, và

2 Trường Cao học Nông nghiệp và Khoa học Đời sống, Đại học Tokyo, Tokyo 113-8657, Nhật Bản

Tuyên bố ý nghĩa

Lấy lại ký ức về nỗi sợ hãigây ra hai quá trình bộ nhớ trái ngược nhau; sự tái hợp nhất và sự tuyệt chủng. Tái hợp nhất duy trì / tăng cườngký ức sợ hãi, trong khi sự tuyệt chủng làm suy yếu trí nhớ sợ hãi. Vẫn chưa biết làm thế nào mà các giai đoạn bộ nhớ được chuyển từ hợp nhất lại thành tuyệt chủng trong quá trình truy xuất. Ở đây, chúng tôi đã xác định một quá trình chuyển đổi bộ nhớ đang hoạt động hoạt động như một công tắc ức chế sự tái hợp nhất. Giai đoạn chuyển tiếp ký ức này cho thấy sự gia tăng thoáng qua của quá trình phosphoryl hóa kinase điều hòa tín hiệu ngoại bào (ERK) trong hạch hạnh nhân, hồi hải mã và vỏ não trung gian trước trán (mPFC). Điều thú vị là, sự ức chế ERK ở những vùng này ở giai đoạn chuyển tiếp đã ngăn cản sự tăng cường tái hợp nhất của trí nhớ tránh ức chế (IA) qua trung gian tái hợp. Những phát hiện này cho thấy rằng quá trình chuyển đổi bộ nhớ chủ động điều chỉnh sự chuyển đổi các giai đoạn ký ức sợ hãi của ký ức sợ hãi bằng cách ngăn chặn cảm ứng tái hợp nhất thông qua việc kích hoạt con đường tín hiệu ERK.

Giới thiệu

Kỉ niệmtruy xuất không phải là một quá trình thụ động mà là một quá trình động cho phép duy trì, củng cố, làm suy yếu hoặc thay đổi / cập nhật một bộ nhớ gốc (Misanin và cộng sự, 1968; Schneider và Sherman, 1968; Lewis, 1979; Mactutus và cộng sự ., 1979; Gordon, 1981; Nader và cộng sự, 2000; Nader và Hardt, 2009; Dudai, 2012; Fukushima và cộng sự, 2014). Điều quan trọng là, ký ức sợ hãi có điều kiện được truy xuất bằng cách tiếp xúc ngắn với kích thích có điều kiện (CS) trở nên không ổn định và yêu cầu tái hợp nhất phụ thuộc vào biểu hiện gen để duy trì hoặc tăng cường nó (Nader et al., 2000; Dudai, 2002; Kida et al., 2002; Suzuki và cộng sự, 2004; Tronel và cộng sự, 2005; Fukushima và cộng sự, 2014). Ngược lại, tái tiếp xúc liên tục hoặc lặp đi lặp lại với CS gây ra sự suy giảm trí nhớ, làm suy yếu trí nhớ sợ hãi (Pavlov, 1927; Rescorla, 2001; Myers và Davis, 2002). Do đó, việc lấy lại ký ức sợ hãi tạo ra hai quá trình ký ức trái ngược nhau, tức là tái hợp nhất và tuyệt chủng, mặc dù cả hai quá trình này đều được tạo ra bằng cách tái tiếp xúc với một CS giống hệt nhau, nhưng khác nhau tùy theo thời gian tiếp xúc lại với CS.

Đặc điểm sinh hóa phổ biến và quan trọng của quá trình tái hợp nhất và tuyệt chủng là yêu cầu đối với sự biểu hiện gen qua trung gian protein liên kết với yếu tố đáp ứng cAMP (CREB) (Mamiya và cộng sự, 2009). Thật thú vị, chúng tôi đã chỉ ra các dấu hiệu phân tử, giải phẫu và hành vi tương phản giữa các giai đoạn tái hợp nhất và tuyệt chủng của trí nhớ sợ hãi theo ngữ cảnh (Suzuki và cộng sự, 2004; Mamiya và cộng sự, 2009). Việc ngăn chặn sự tổng hợp protein trong giai đoạn tái hợp làm phá vỡ nỗi sợ hãi ban đầukỉ niệm, trong khi việc ngăn chặn sự tổng hợp protein trong giai đoạn tuyệt chủng không thực hiện được điều này, mặc dù bộ nhớ sợ hãi theo ngữ cảnh đã được kích hoạt trở lại. Yêu cầu của các vùng não hiển thị sự kích hoạt biểu hiện gen qua trung gian CREB khác nhau giữa sự tái hợp nhất và sự tuyệt chủng; sự hợp nhất lại phụ thuộc vào hạch hạnh nhân và hồi hải mã, trong khi sự tuyệt chủng phụ thuộc vào hạch hạnh nhân và vỏ não trung gian trước trán (mPFC). Tuy nhiên, thời gian của quá trình kích hoạt amygdaloid CREB khác nhau giữa giai đoạn tái hợp nhất và kết thúc bộ nhớ. Những quan sát này cho thấy rằng các giai đoạn tái hợp nhất và giai đoạn tuyệt chủng không độc lập, mà là tương tác với nhau. Điều thú vị là các nghiên cứu gần đây đã xác định được một cửa sổ thời gian (giai đoạn chuyển tiếp) cho thấy không có sự kích hoạt kinase điều chỉnh tín hiệu ngoại bào (ERK) trong hạch hạnh nhân sau khi hợp nhất lại, nhưng trước giai đoạn tuyệt chủng sau khi lấy lại ký ức sợ hãi thính giác (Merlo và cộng sự, 2018 ). Tổng hợp lại, những phát hiện này cho thấy các cơ chế có thể có mà các giai đoạn ký ức được chuyển từ trạng thái hợp nhất sang trạng thái tuyệt chủng trong quá trình lấy lại ký ức sợ hãi. Nói cách khác, có thể quá trình chuyển đổi bộ nhớ chủ động điều chỉnh sự chuyển đổi này.

Trong một nhiệm vụ tránh ức chế (IA), chuột nhận được một cú sốc điện sau khi chúng đi vào ngăn tối từ ngăn sáng và hình thànhkỉ niệmđể tránh ngăn tối. Trước đây, bằng cách sử dụng tác vụ này, chúng tôi đã chỉ ra rằng các giai đoạn tái hợp nhất và tuyệt chủng có thể được phân biệt tại thời điểm khi một con chuột đi vào ngăn tối từ ngăn sáng trong một lần tái tiếp xúc (Fukushima và cộng sự, 2014). Do đó, nhiệm vụ này cho phép chúng ta mô tả các dấu hiệu phân tử phối cảnh của giai đoạn tái hợp nhất và giai đoạn tuyệt chủng, trái ngược với mô hình điều hòa sợ hãi theo ngữ cảnh cổ điển trong đó việc kích hoạt lại ký ức sợ hãi có điều kiện bằng cách tái tiếp xúc với CS bắt đầu cả tái hợp nhất và tuyệt chủng; tái tiếp xúc ngắn (3 phút) với bối cảnh điều kiện dẫn đến tái hợp nhất, trong khi tiếp xúc lại lâu (30 phút) hoặc lặp lại với bối cảnh này dẫn đến tuyệt chủng (Eisenberg và cộng sự, 2003; Pedreira và Maldonado, 2003; Suzuki và cộng sự, 2004; Lee và cộng sự, 2008; Mamiya và cộng sự, 2009). Hơn nữa, chúng tôi nhận thấy rằng bộ nhớ IA đã truy xuất được tăng cường thông qua việc tái hợp nhất bộ nhớ trong nhiệm vụ này (Fukushima và cộng sự, 2014).

Để hiểu cơ chế chuyển đổi từ tái hợp thành tuyệt chủng trong quá trình hồi phục nỗi sợ hãikỉ niệm, chúng tôi nhằm mục đích xác định và mô tả các dấu hiệu phân tử, tế bào và hành vi của các giai đoạn tái hợp nhất, chuyển tiếp và kết thúc của bộ nhớ IA. Chúng tôi đã phân tích sự kích hoạt của CREB và ERK trong hạch hạnh nhân, hồi hải mã và mPFC trong các giai đoạn tái hợp nhất, chuyển tiếp và tuyệt chủng và xem xét vai trò của kích hoạt ERK trong các quá trình ghi nhớ này.

Nguyên liệu và phương pháp

Chuột Tất cả các thí nghiệm được thực hiện theo Hướng dẫn Chăm sóc và Sử dụng Động vật Phòng thí nghiệm (Hiệp hội Khoa học Thần kinh Nhật Bản và Đại học Nông nghiệp Tokyo). Tất cả các thí nghiệm trên động vật được thực hiện trong nghiên cứu này đã được Ủy ban Chăm sóc và Sử dụng Động vật của Đại học Nông nghiệp Tokyo (ủy quyền số 280037) phê duyệt. Tất cả các thủ tục phẫu thuật được thực hiện dưới sự gây mê của Nembutal và mọi nỗ lực đã được thực hiện để giảm thiểu đau khổ. Chuột đực C57BL / 6N được lấy từ sông Charles. Những con chuột được nhốt trong lồng 5 hoặc 6 con, được duy trì theo chu kỳ sáng / tối 12/12 giờ và được phép tiếp cận với thức ăn và nước uống. Những con chuột được ít nhất tám tuần tuổi khi được kiểm tra. Thử nghiệm được thực hiện trong pha sáng của chu kỳ. Tất cả các thí nghiệm đều được thực hiện mù mờ về tình trạng điều trị của những con chuột.

Thử nghiệm IA Thiết bị IA từng bước (Dược phẩm OHARA) bao gồm một hộp với các ngăn sáng và tối riêng biệt (cả hai 15,5 12,5 11,5 cm). Ngăn ánh sáng được chiếu sáng bằng đèn huỳnh quang (25 0 0 lux; Fukushima và cộng sự, 2008, 2014; Zhang và cộng sự, 2011; Ishikawa và cộng sự, 2016). Trước khi bắt đầu huấn luyện IA, các con chuột được xử lý riêng lẻ trong 2 phút mỗi ngày trong một tuần. Trong các buổi huấn luyện, mỗi con chuột được phép đi vào khoang sáng trong 30 giây, và cửa máy chém được nâng lên để cho phép vào khoang tối. Độ trễ để đi vào khoang tối được coi là một thước đo để đạt được. Ngay khi chuột vừa vào khoang tối, cửa máy chém đã đóng lại. Sau 5 s, một cú va chạm (0,2 mA) được chuyển giao trong thời gian tổng cộng là 2 s (luyện tập). Vào 24 giờ sau buổi huấn luyện, chuột được đặt trở lại ngăn sáng cho đến khi vào ngăn tối (trung bình 459 6 15. 49 giây). Ngay sau khi chuột vào ngăn tối, cửa máy chém được đóng lại và chuột ở trong ngăn tối trong một khoảng thời gian khác nhau (0, 1 hoặc 10 phút) mà không bị giật chân (kích hoạt lại). Bộ nhớ được đánh giá 48 giờ sau [kiểm tra bộ nhớ dài hạn sau kích hoạt (PR-LTM)] như độ trễ chéo để chuột vào ngăn tối khi được thay thế trong ngăn sáng, như khi kích hoạt lại.

Đối với thử nghiệm đầu tiên, chúng tôi đã kiểm tra ảnh hưởng của sự ức chế tổng hợp protein sau khi tái hoạt động (tái tiếp xúc với ngăn tối trong 0, 1 hoặc 1 0 phút; Hình 1). Chất ức chế tổng hợp protein anisomycin (ANI; Wako) được hòa tan trong nước muối (pH được điều chỉnh thành 7. 0 - 7,4 bằng NaOH). Những con chuột đã được huấn luyện như mô tả ở trên, và vào 24 giờ sau, chúng nhận được xe (VEH) hoặc ANI (150 mg / kg, ip) ngay sau khi tiếp xúc lại với ngăn tối trong 0, 1 hoặc 10 phút mà không bị giật chân. (kích hoạt lại). Ở liều này, ANI ức chế 0,90% tổng hợp protein trong não trong 2 giờ đầu tiên (Flood và cộng sự, 1973). Vào 48 giờ sau phiên kích hoạt lại, từng con chuột một lần nữa được đưa vào ngăn sáng và độ trễ giao nhau được đánh giá.

Đối với thí nghiệm thứ hai [CREB được phosphoryl hóa (pCREB) và hóa mô miễn dịch phosphoryl hóa ERK (pERK); Hình 2–5], chúng tôi đã kiểm tra các vùng não được kích hoạt sau khi tái tiếp xúc với ánh sáng (cho đến khi chuột vào ngăn tối, tiếp xúc lại với ngăn tối trong 0 phút) hoặc ngăn tối (tái tiếp xúc với ngăn tối trong 1 hoặc 1 0 phút). Những con chuột được chia thành bốn Fukushima et al. · Chuyển đổi ký ức sợ hãi Các giai đoạn sau khi Truy xuất J. Neurosci., 10 tháng 2 năm 2021, • 41 (6): 1288–1300 • 1289 nhóm. Vào 24 giờ sau khi huấn luyện, các cá thể chuột được tái tiếp xúc với ngăn sáng và sau đó ở lại ngăn tối sau khi chúng đi vào từ ngăn tối [kích hoạt lại: 0 phút trong ngăn tối, nhóm tái hợp (Recon); 1 min, nhóm chuyển tiếp (Tran); 10 phút, nhóm tuyệt chủng (Ext)]. Một nhóm chuột khác không được đưa trở lại ngăn sáng / tối [nhóm không kích hoạt lại (NR)]. Những con chuột sau đó được gây mê bằng Nembutal (750 mg / kg, ip) ở 5, 15 hoặc 30 phút sau khi kích hoạt lại.

Đối với thí nghiệm thứ ba (vi tưới máu U0126; Hình 6,7), chúng tôi đã kiểm tra tác động của sự ức chế ERK trong hạch hạnh nhân, hồi hải mã hoặc mPFC trênkỉ niệmtái hợp nhất / tăng cường, chuyển tiếp và tuyệt chủng. Chất ức chế MEK U 0 126 (Sigma-Aldrich) được hòa tan trong dịch não tủy nhân tạo có chứa ba giọt Tween 8 0 (Sigma) trong 2,5 ml 7,5% dimethyl sulfoxide (Wako) và được điều chỉnh theo pH 7.4 với NaOH. Những con chuột được huấn luyện như mô tả ở trên, và 24 giờ sau, chúng được đưa trở lại ngăn ánh sáng (kích hoạt lại). Những con chuột được truyền vi sinh với U 0 126 (1 mg) hoặc VEH vào các vùng não khác nhau ngay sau đó (Hình 6A, C, E – H, 7A – C) hoặc sau 3 0 phút (Hình 6B, D) kích hoạt lại. Ở 48 giờ sau khi kích hoạt lại, từng con chuột một lần nữa được đặt vào ngăn sáng và độ trễ giao nhau được đánh giá (PR LTM). Truyền vi mô vào đồi hải mã và mPFC (0,5 ml) được thực hiện với tốc độ 0,25ml / phút. Truyền vi sinh vào hạch hạnh nhân (0,2 ml) được thực hiện với tốc độ 0,1ml / phút. Ống tiêm được giữ nguyên trong 2 phút sau khi tiêm vi khuẩn và những con chuột sau đó được đưa về lồng nhà của chúng. Chất ức chế MEK SL327 (Công nghệ sinh học Santa Cruz) được hòa tan trong dimethyl sulfoxide và pha loãng với nước muối. Những con chuột được huấn luyện như mô tả ở trên, và 24 giờ sau đó, những con chuột riêng lẻ được đưa trở lại ngăn ánh sáng (kích hoạt lại). Những con chuột được tiêm SL327 (10 hoặc 20 mg / kg) hoặc VEH một cách hệ thống ngay sau khi kích hoạt lại (Hình 7D – F). Ở 48 giờ sau khi kích hoạt lại, từng con chuột một lần nữa được đặt vào ngăn sáng và độ trễ giao nhau được đánh giá (PR-LTM).

Hóa mô miễn dịch đã được thực hiện như đã mô tả trước đây (Mamiya và cộng sự, 2009; Suzuki và cộng sự, 2011; Zhang và cộng sự, 2011; Fukushima và cộng sự, 2014; Ishikawa và cộng sự, 2016; Hasegawa và cộng sự, 2019). Sau khi gây mê, tất cả các con chuột đều được truyền 4% paraformaldehyde. Não được lấy ra, cố định qua đêm, chuyển sang 30% đường sucrose, và được bảo quản ở 4 độ. Các phần mạch vành (30mm) được cắt bằng máy lạnh.

Đối với phương pháp nhuộm pCREB và pERK, các phần nổi tự do được xử lý bằng 1 phần trăm H2O2 và ủ qua đêm với kháng thể kháng phospho-CREB (serine 133; S133) đa dòng của thỏ (1: 1 0 00; # {{10 }}, Millipore) và / hoặc kháng thể đơn dòng chống phospho-ERK1 / 2 (T202 / Y204) của thỏ (1: 300; # 4370; Công nghệ tín hiệu tế bào) trong dung dịch chặn (nước muối đệm phosphat cộng với 1% albumin huyết thanh dê, 1 mg / ml albumin huyết thanh bò và 0,05 phần trăm Triton X -100). Các phần được rửa bằng nước muối đệm phosphat và ủ với IgG chống thỏ liên hợp peroxidase của cải ngựa (1: 500; Jackson ImmunoResearch) để tìm pCREB hoặc IgG dê liên hợp peroxidase từ cải ngựa để tạo pERK trong 1 giờ ở nhiệt độ phòng. Tín hiệu pCREB được khuếch đại bởi biotin tyramide và được hiển thị bằng cách sử dụng streptavidin liên hợp với Alexa Fluor (Invitrogen). Tín hiệu pERK được khuếch đại bằng TSA-FCM (Invitrogen). Các phần được gắn trên các trang trình bày và được lật lại bằng cách sử dụng phương tiện gắn kết (Millipore).

Việc định lượng đã được thực hiện như đã mô tả trước đây (Frankland và cộng sự, 2006; Fukushima và cộng sự, 2014; Mamiya và cộng sự, 2009; Zhang và cộng sự, 2011; Suzuki và cộng sự, 2008). Các cấu trúc được xác định về mặt giải phẫu theo tập bản đồ của Franklin và Paxinos (1997). Tất cả các tế bào thần kinh phản ứng miễn dịch được đếm bởi một người thí nghiệm mù với điều kiện điều trị

Kết quả

Đặc điểm của các pha bộ nhớ sau khi truy xuất trong tác vụ IA

Nhiệm vụ IA cho phép chúng tôi phân biệt các giai đoạn tái hợp nhất và tuyệt chủng tại thời điểm khi một con chuột đi vào ngăn tối từ ngăn sáng (Fukushima và cộng sự, 2014). Để hiểu cơ chế cơ bản của việc chuyển đổi các giai đoạn bộ nhớ từ tái hợp nhất thành tuyệt chủng, chúng tôi đã đặc trưng cho các giai đoạn bộ nhớ IA sau khi truy xuất bộ nhớ bằng cách kiểm tra tác động của việc ức chế sự tổng hợp protein cần thiết cho sự hợp nhất và tắt của bộ nhớ IA (Fukushima và cộng sự, 2014). Đầu tiên những con chuột được đặt trong ngăn ánh sáng. Vào lúc 5 giây sau khi họ bước vào khoang tối, một cú sốc điện ngắn đã được phát ra (huấn luyện). Những con chuột được tiếp xúc lại với ngăn sáng 24 giờ sau khi huấn luyện (phiên kích hoạt lại; Hình 1A) và độ trễ chéo của chúng để vào ngăn tối đã được đánh giá (Hình 1B). Chuột được đưa trở lại lồng nhà của chúng ngay sau khi chúng từ ngăn sáng vào ngăn tối (0- phút tái tiếp xúc với ngăn tối; giai đoạn tái hợp nhất) hoặc ở trong ngăn tối 1, 3, hoặc 10 phút mà không nhận được một cú giật chân (giai đoạn tắt; Hình 1C – E). Ngay sau phiên kích hoạt lại, những con chuột được tiêm VEH toàn thân hoặc chất ức chế tổng hợp protein ANI. Sau 48 giờ, độ trễ giao nhau được đánh giá PR-LTM.

Phù hợp với nghiên cứu trước đây của chúng tôi (Fukushima và cộng sự, 2 0 14), việc tiếp xúc lại với ngăn ánh sáng (nhóm 0 phút) tạo ra sự hợp nhất và tăng cường trí nhớ IA. ANOVA hai chiều cho thấy những tác động đáng kể của thời gian (F (1,24)=10. 433, p=0. {{2 0}} 036), ma túy (F (1 , 24)=23. 197, p, 0,0001) và tương tác thuốc theo thời gian (F (1,24)=25. 022, p, 0,0001; Hình 1B). Thử nghiệm post hoc Bonferroni và thử nghiệm t được ghép nối cho thấy rằng các nhóm VEH và ANI, hiển thị tăng hoặc giảm tương ứng, độ trễ chéo ở PR-LTM so với phiên kích hoạt lại (ps, 0,05; VEH, t (6) {{28 }} 5.134, p=0. 0021, ANI, t (6)=4. 804, p=0. 003; Hình 1B). Những quan sát này chỉ ra rằng việc truy xuất bộ nhớ IA trong ngăn ánh sáng đã tăng cường bộ nhớ, trong khi sự ức chế tổng hợp protein làm gián đoạn bộ nhớ được truy xuất, xác nhận quan sát trước đó rằng việc truy xuất bộ nhớ IA giúp tăng cường bộ nhớ thông qua việc tái hợp nhất theo cách thức tổng hợp protein.

Ngược lại, việc tái tiếp xúc với ngăn tối gây ra sự tuyệt chủng lâu dài [ANOVA hai chiều, thời gian (Hình. 1C, F (1,28)=9. 575, p=0. { {5 0}} 0 4; Hình 1D, F (1,36)=11. 699, p=0. 0 016), ma túy (Hình 1C, F (1,28)=4. 674, tr=0. 039; Hình 1D, F (1,36)=12. 285, tr {{29 }}. 0012), tương tác thuốc theo thời gian (Hình 1C, F (1,28)=7. 916, p=0. 009; Hình 1D, F (1,36) {{41 }}. 915, p=0. 0079)], như đã quan sát trước đây (Fukushima và cộng sự, 2014). Các nhóm VEH ở trong ngăn tối trong 3 hoặc 10 phút cho thấy độ trễ chéo qua PR-LTM giảm đáng kể so với phiên kích hoạt lại, trong khi các nhóm ANI hiển thị độ trễ chéo tương đương ở PR-LTM so với phiên kích hoạt lại và với Các nhóm VEH (thử nghiệm post hoc Bonferroni, ps, 0,05; thử nghiệm t ghép nối, Hình 1C, VEH, t (7)=4. 976, p=0. 0016, ANI, t (7) { {59}}. 796, trang 0,05; Hình 1D, VEH, t (9)=10. 211, p, 0,0001, ANI, t (9)=1. 02, trang 0,05 ). Những đặc điểm quan sát này chỉ ra rằng việc tái tiếp xúc với ngăn tối trong 3 hoặc 10 phút đã dập tắt bộ nhớ IA và sự ức chế tổng hợp protein đã ngăn chặn sự tuyệt chủng lâu dài. Do đó, việc truy xuất bộ nhớ IA trong bộ nhớ tối ưu đã dập tắt bộ nhớ IA theo cách thức không biểu hiện gen.

Quan trọng là, nhóm VEH cho thấy độ trễ chéo so với thời gian chờ ở PR-LTM so với phiên kích hoạt lại và với nhóm ANI khi họ ở trong ngăn tối trong 1 phút [ANOVA hai chiều, thời gian (F (1,36) {{ 5}}. 0 3, tr. 0. 0 5), ma tuý (F (1,36)=0. 0 19, tr. 0. 0 5), tương tác thuốc theo thời gian (F (1,36)=0. 011, tr. 0,05); bài kiểm tra của Bonferroni post hoc, ps. 0,05; thử nghiệm t được ghép nối, VEH, t (9)=0. 091, tr. 0,05, ANI, t (9)=0. 328, tr. 0,05; Hình 1E]. Những quan sát này chỉ ra rằng nhóm VEH không cho thấy sự tăng cường cũng như không bị mất trí nhớ IA và nhóm ANI không cho thấy sự gián đoạn của bộ nhớ IA. Do đó, việc tiếp xúc lại với ngăn tối trong 1 phút đã chặn cả việc tăng cường và sự gián đoạn do ANI gây ra đối với bộ nhớ IA được kích hoạt lại, nhưng không dập tắt bộ nhớ IA, cho thấy rằng 1- phút tiếp xúc lại này sẽ hủy bỏ cảm ứng tái hợp nhất , nhưng không đủ để dập tắt bộ nhớ IA.

Tóm lại, các kết quả này chỉ ra rằng việc tiếp xúc lại với ngăn sáng tạo ra giai đoạn tái hợp nhất, trong khi việc tiếp xúc lại với ngăn tối lâu hơn (3 hoặc 10 phút) sẽ tạo ra giai đoạn tắt. Quan trọng hơn, ở trong 1 phút trong ngăn tối sẽ tạo ra giai đoạn chuyển tiếp từ tái hợp thành tuyệt chủng, điều này ức chế sự tái hợp nhất ký ức về nỗi sợ hãi mà không gây ra sự tuyệt chủng.

Dấu hiệu phân tử của các giai đoạn tái hợp nhất, chuyển tiếp và tuyệt chủng trong hạch hạnh nhân, hồi hải mã và mPFC sau khi truy xuất bộ nhớ IA

Sự hợp nhất lại và sự biến mất của trí nhớ sợ hãi theo ngữ cảnh cho thấy sự gia tăng quá trình phosphoryl hóa CREB tại S133, một dấu hiệu kích hoạt biểu hiện gen cần thiết để tái hợp nhất và sự tuyệt chủng lâu dài, nhưng cho thấy động lực khác biệt của sự phosphoryl hóa CREB (Mamiya và cộng sự, 2 0 09 ). Điều thú vị là, các nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rằng không có sự gia tăng quá trình phosphoryl hóa ERK, một chất điều hòa ngược dòng của CREB (Impey và cộng sự, 1998; Wu và cộng sự, 2001), ở vùng cơ bản của hạch hạnh nhân khi chuyển từ quá trình tái hợp nhất dẫn đến sự tuyệt chủng của ký ức sợ hãi giả định, mặc dù quá trình phosphoryl hóa này tăng lên ở vùng cơ bản khi ký ức về nỗi sợ hãi được kiểm chứng được củng cố lại và bị dập tắt (Merlo và cộng sự, 2014, 2018). Một nghiên cứu khác chỉ ra rằng ERK ở hồi hải mã chỉ được kích hoạt khi trí nhớ sợ hãi theo ngữ cảnh bị dập tắt, nhưng không được hợp nhất lại (Tronson và cộng sự, 2009). Những phát hiện này cho thấy rằng các giai đoạn tái hợp nhất, chuyển tiếp và tắt cho thấy các dấu hiệu phân tử và tế bào riêng biệt. Do đó, chúng tôi đã đo và so sánh mức độ của pCREB và pERK trong các giai đoạn tái hợp nhất, chuyển tiếp và tắt bằng cách sử dụng hóa mô miễn dịch. Chúng tôi thực hiện các lịch trình thí nghiệm tương tự như trong Hình 1B, D, E bằng cách sử dụng bốn nhóm thí nghiệm. Những con chuột được tiếp xúc lại với ngăn sáng sau 24 giờ sau khi huấn luyện và sau đó ở lại ngăn tối [kích hoạt lại: 0 phút trong ngăn tối, nhóm tái hợp (Recon); 1 min, nhóm chuyển tiếp (Tran); 10 phút, nhóm tuyệt chủng (Ext)]. Một nhóm chuột khác không được đưa trở lại ngăn sáng / tối (không kích hoạt lại, nhóm NR). Chúng tôi đếm các tế bào thần kinh pCREB dương tính (pCREB1), tế bào thần kinh pERK dương tính (pERK1) và tế bào thần kinh dương tính kép (pCREB1 / pERK1) trong hạch hạnh nhân, hồi hải mã và mPFC vào 30 phút sau phiên kích hoạt lại.

Amygdala (vùng bên) CREB được kích hoạt trong giai đoạn tắt và tái hợp nhất, trong khi ERK chỉ được kích hoạt trong giai đoạn tắt (Hình. 2A – C). ANOVA một chiều tiết lộ ảnh hưởng đáng kể của nhóm (Hình 2B, F (3,29)=14. 85, p, 0. 0 001). Tương tự như những phát hiện trước đây (Mamiya và cộng sự, 2009), thử nghiệm post hoc Newman – Keuls cho thấy nhóm Recon và Ext cho thấy số lượng nơron pCREB1 nhiều hơn đáng kể so với các nhóm khác (p, 0,05). Những quan sát này chỉ ra rằng tương tự như những quan sát ở các cấp độ hành vi (Hình 1), việc tiếp xúc với ngăn tối trong 1 phút (giai đoạn chuyển tiếp) sẽ hủy bỏ sự "bật" của quá trình phosphoryl hóa CREB sẽ tăng lên trong giai đoạn tái hợp nhất. Ngược lại, quan sát thấy nhiều tế bào thần kinh pERK1 hơn đáng kể trong nhóm Ext so với các nhóm khác, mặc dù có ít tế bào thần kinh pERK1 hơn nhiều so với tế bào thần kinh pCREB1 trong nhóm Ext (F (3,29)=3. 793, p { {23}}. 0207; Hình 2C).

Nhất quán, số lượng tế bào thần kinh dương tính kép (pCREB1 / pERK1) nhiều hơn đáng kể được quan sát thấy trong nhóm Ext (F (3,29)=6. 698, p=0. 0 0 14; Hình 2D), trong khi các tế bào thần kinh pCREB1 / pERK– (pCREB đơn dương tính) nhiều hơn đáng kể được quan sát thấy trong nhóm Recon và Ext (F (3,29)=13. 689, p, 0 . 0 001; Hình 2E). Do đó, giai đoạn tái hợp nhất chỉ cho thấy một quần thể tế bào thần kinh pCREB1 / pERK– duy nhất. Ngược lại, giai đoạn tuyệt chủng cho thấy hai quần thể tế bào thần kinh pCREB1 / pERK– và pCREB1 / pERK1, cho thấy rằng ERK chỉ được kích hoạt trong một tập hợp con tế bào thần kinh pCREB1. Quan trọng là, các kết quả tương tự cũng được quan sát thấy ở vùng đáy của hạch hạnh nhân (Hình 2G, F (3,29)=13. 042, p, 0,0001; Hình 2H, F (3,29) {{32} } .824, p=0. 0201; Hình 2I, F (3,29)=12. 633, p, 0,0001; Hình 2J, F (3,29)=12 .505, tr, 0,0001).

Kích hoạt hai pha ERK trong giai đoạn tuyệt chủng ERK là một chất kích hoạt ngược dòng của CREB và do đó, kích hoạt ERK là cần thiết để củng cố và củng cố lại trí nhớ sợ hãi (Schafe và cộng sự, 2 0 0 {{31 }}; Duvarci và cộng sự, 2 0 0 5). Tuy nhiên, không nhất quán, không có sự kích hoạt ERK nào được quan sát thấy ở hạch hạnh nhân, hồi hải mã hoặc mPFC trong giai đoạn tái hợp nhất khi đo pERK ở 3 0 phút sau phiên kích hoạt lại (Hình. 2-4). Do đó, chúng tôi đã kiểm tra các quy trình thời gian của quá trình phosphoryl hóa ERK và CREB. Chúng tôi đã thực hiện một thử nghiệm tương tự như trong Hình 2-4, ngoại trừ mức pCREB và pERK được đo ở 5, 15 và 3 0 phút sau phiên kích hoạt lại (tiếp xúc lại với ngăn tối cho {{ 66}}, 1 hoặc 1 0 phút; Hình 5A). Phù hợp với dữ liệu được hiển thị trong Hình 2-4, sự gia tăng đáng kể các tế bào thần kinh pCREB1 được quan sát thấy ở 30 phút, nhưng không phải ở 5 phút, sau phiên kích hoạt lại trong Recon (hạch hạnh nhân, mPFC và hải mã) và Ext (hạch hạnh nhân và mPFC ) nhóm, nhưng không phải nhóm Tran (Hình 5E, ANOVA một chiều, hạch hạnh nhân, 5 phút, F (3,23)=0. 346, trang 0,05, 30 phút, F (3,23)=15. 272, p, 0,0001; mPFC, 5 phút, F (3,23)=1. 169, trang 0,05, 30 phút, F (3,23)=32. 346, p, 0,0001; hippocampus, 5 min, F (3,23)=0. 154, p. 0,05, 30 min, F (3,23)=16. 197, p, 0,0001; kiểm tra t không ghép đôi, hạch hạnh nhân, tái hợp nhất, 5 đấu 30 phút, t (12)=7. 807, p, 0,0001, tuyệt chủng, 5 đấu 30 phút, t (12)=5. 405, p { {73}}. 0002; mPFC, hợp nhất lại, 5 đấu 30 phút, t (12)=5. 727, p, 0,0001, tuyệt chủng, 5 đấu 30 phút, t (12)=4. 188 , p=0. 0013; vùng hải mã CA1, tái hợp nhất, 5 so với 30 phút, t (12)=2. 339, tr=0. 0374).

Điều thú vị là, sự gia tăng đáng kể các tế bào thần kinh pERK1 được quan sát thấy ở hạch hạnh nhân, mPFC và hồi hải mã của các nhóm Recon, Tran và Ext vào 5 phút sau phiên kích hoạt lại so với nhóm NR (Hình 5F, hạch hạnh nhân, F (3,23)=10. 961, tr=0. 0 0 0 1; mPFC, F (3,23)=7. 525, tr { {13}}. 0011; hippocampus, F (3,23)=6. 924, tr=0. 0017). Những quan sát này chỉ ra rằng ERK được kích hoạt ngay sau phiên kích hoạt lại trong tất cả các giai đoạn bộ nhớ. Tuy nhiên, những sự gia tăng này làm tăng số lượng tế bào thần kinh pERK1 trở về mức cơ bản (so sánh với nhóm NR) sau 15 phút sau phiên kích hoạt lại (Hình 5F, hạch hạnh nhân, F (3,20)=2. 676, tr . 0,05; mPFC, F (3,23)=0. 683, trang 0,05; hồi hải mã, F (3,20)=0. 74, trang 0,05). Hơn nữa, phù hợp với những phát hiện được hiển thị trong Hình 2-4, nhiều tế bào thần kinh pERK1 hơn đáng kể được quan sát thấy trong hạch hạnh nhân, mPFC và hải mã ở 30 phút sau phiên kích hoạt lại chỉ trong nhóm Ext (Hình 5F, hạch hạnh nhân, F ( 3,23)=6. 616, p=0. 022; mPFC, F (3,23)=8. 012, p=0. 0008; hippocampus, F ( 3,23)=6. 206, tr=0. 003). Do đó, giai đoạn tái hợp nhất và giai đoạn chuyển tiếp chỉ cho thấy sự hoạt hóa thoáng qua của ERK ở thời điểm sớm (5 phút), trong khi giai đoạn tắt cho thấy sự hoạt hóa hai pha của ERK ở thời điểm sớm (5 phút) và muộn (30 phút) sau khi kích hoạt lại. phiên họp. Những quan sát này chỉ ra rằng các cơ chế điều chỉnh sự hoạt hóa ERK khác nhau ở các giai đoạn tái hợp nhất / chuyển tiếp và tắt. Nói chung, các quan sát của chúng tôi đã chứng minh rằng các giai đoạn tái hợp nhất, chuyển tiếp và tắt cho thấy các dấu hiệu phân tử riêng biệt.

Vai trò của kích hoạt ERK trong các giai đoạn tái hợp nhất và kết thúc của bộ nhớ IA

Các giai đoạn tái hợp nhất / chuyển tiếp và tắt cho thấy sự hoạt hóa ERK một pha và hai pha, tương ứng. Tiếp theo, chúng tôi nghiên cứu và so sánh vai trò của kích hoạt ERK sớm (5 phút) và muộn (30 phút) trong mPFC trong các giai đoạn tái hợp nhất và tắt bằng cách xem xét tác động của việc ức chế ERK (Hình 6).

Thảo luận

Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã khảo sát các cơ chế chuyển đổi bộ nhớ từ giai đoạn tái hợp nhất sang giai đoạn tắt sau khi khôi phục bộ nhớ IA. Đầu tiên chúng tôi mô tả các dấu hiệu hành vi của các giai đoạn bộ nhớ IA sau khi truy xuất. Phù hợp với nghiên cứu trước đây của chúng tôi (Fukushima và cộng sự, 2 0 14), sự tái hợp nhất và tuyệt chủng do phục hồi bộ nhớ IA do tái tiếp xúc với ánh sáng (0 phút trong ngăn tối) và bóng tối ( 3 hoặc 10 phút), tương ứng. Điều thú vị là trí nhớ IA không được tăng cường cũng như không bị dập tắt và cho thấy khả năng chống lại sự ức chế tổng hợp protein khi những con chuột được tiếp xúc lại với ngăn tối chỉ 1 phút. Do đó, những quan sát này cho thấy rằng 1- phút tiếp xúc lại với ngăn tối sẽ hủy bỏ cảm ứng tái hợp nhất, nhưng không đủ để dập tắt bộ nhớ IA. Hơn nữa, chúng tôi phát hiện ra rằng ERK đã được kích hoạt trong hạch hạnh nhân, hồi hải mã và mPFC ở thời điểm sớm (5 phút) sau khi tiếp xúc lại với ngăn tối trong 0, 1 hoặc 10 phút. Nhất quán, sự ức chế ERK trong các vùng não này đã ngăn chặn quá trình tái hợp nhất / tăng cường và làm mất trí nhớ IA. Quan trọng nhất, sự ức chế ERK trong hạch hạnh nhân, hồi hải mã và mPFC sau 1- phút tiếp xúc lại với ngăn tối đã ngăn chặn sự tăng cường tái hợp nhất của bộ nhớ IA, cho thấy rằng sự kích hoạt ERK sau những lần tiếp xúc lại ngắn (1 phút) để ngăn tối là cần thiết để ức chế tái hợp nhất bộ nhớ IA. Ngược lại, 1- phút tiếp xúc lại với ngăn tối là không đủ để dập tắt bộ nhớ IA, mặc dù việc tiếp xúc lại kéo dài với ngăn tối (3 hoặc 10 phút) đã dập tắt bộ nhớ này. Do đó, kết quả của chúng tôi cho thấy rằng 1- phút tiếp xúc lại với ngăn tối sẽ tạo ra quá trình chuyển đổi bộ nhớ có thể hủy bỏ quá trình củng cố / tăng cường nhưng không bắt đầu quá trình học tắt. Nói chung, chúng tôi đề xuất rằng quá trình chuyển đổi bộ nhớ góp phần chuyển các giai đoạn của bộ nhớ từ tái hợp nhất sang tuyệt chủng thông qua việc ngăn chặn tái hợp nhất qua trung gian ERK.

Tương tự như các quan sát hiện tại của chúng tôi, một nghiên cứu gần đây sử dụng điều hòa sợ hãi thính giác cho thấy rằng các bài thuyết trình CS đơn lẻ (1) hoặc kéo dài (10) gây ra sự tái hợp nhất và biến mất trí nhớ, tương ứng thông qua sự gia tăng mức pERK ở vùng đáy của hạch hạnh nhân. Ngược lại, các bài thuyết trình CS trung gian (4–7) không thay đổi mức pERK ở vùng đáy của hạch hạnh nhân. Quan trọng là, sự ức chế ERK ở các bài thuyết trình CS trung gian không ảnh hưởng đến trí nhớ sợ hãi. Nghiên cứu này gợi ý rằng có một sự chuyển đổi giai đoạn trí nhớ từ hợp nhất lại thành tuyệt chủng sau khi lấy lại bộ nhớ sợ hãi (Merlo và cộng sự, 2018). Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã mở rộng phát hiện này và gợi ý rằng giai đoạn chuyển tiếp chủ động chuyển các giai đoạn của bộ nhớ từ tái hợp nhất sang kết thúc thông qua việc kích hoạt con đường dẫn truyền tín hiệu ERK. Ngược lại với những phát hiện trước đây (Merlo và cộng sự, 2018), chúng tôi nhận thấy rằng giai đoạn chuyển tiếp liên quan đến quá trình phosphoryl hóa ERK trong hạch hạnh nhân, hồi hải mã và mPFC. Những khác biệt này có thể là do sự khác biệt của các mốc thời gian kiểm tra quá trình phosphoryl hóa ERK; nghiên cứu trước đó đo mức pERK tại; 12 phút sau khi trình bày CS (Merlo và cộng sự, 2018), trong khi nghiên cứu của chúng tôi cho thấy mức pERK tăng trở lại mức cơ bản vào khoảng thời gian này (15 phút sau khi tiếp xúc lại). Ngoài ra, điều quan trọng cần lưu ý là nhiệm vụ IA cho phép quan sát sự tăng cường trí nhớ IA thông qua việc tái hợp nhất, do đó dẫn đến kết quả của chúng tôi rằng sự ức chế ERK ở giai đoạn chuyển tiếp sẽ ngăn cản sự tăng cường của trí nhớ IA.

Các nghiên cứu trước đây đã chỉ ra rằng quá trình phosphoryl hóa ERK được tăng lên ở vùng đáy của hạch hạnh nhân ở thời điểm 20–60 phút sau khi tuyệt chủng học ký ức sợ hãi (Herry và cộng sự, 2006; Merlo và cộng sự, 2014, 2018), trong khi hải mã cho thấy sự kích hoạt này vào lúc 1 giờ sau khi học về sự tuyệt chủng của trí nhớ sợ hãi theo ngữ cảnh (Fischer và cộng sự, 2007; Tronson và cộng sự, 2009). Trong nghiên cứu này, chúng tôi thu được các quan sát tương tự rằng pERK tăng lên ở 30 phút sau phiên kích hoạt lại trong giai đoạn tuyệt chủng. Những phát hiện này cho thấy rằng sự phosphoryl hóa ERK là một dấu hiệu phân tử phổ biến của giai đoạn tuyệt chủng muộn (20-60 phút).

Hơn nữa, chúng tôi quan sát thấy rằng sự kích hoạt ERK xảy ra theo hai pha tại các điểm thời gian sớm và muộn (5 và 30 phút) sau phiên kích hoạt lại trong giai đoạn tắt, trong khi sự kích hoạt này xảy ra đơn pha tại thời điểm sớm trong giai đoạn tái hợp nhất (Hình 5) . Một cách nhất quán, việc ức chế ERK trong các vùng não tại các thời điểm này của giai đoạn tái hợp nhất và giai đoạn tắt đã ngăn chặn sự tái hợp nhất / tăng cường và sự tuyệt chủng lâu dài, tương ứng (Hình 6A, C – H). Những quan sát này cho thấy rằng sự kích hoạt ERK một pha và hai pha là cần thiết cho sự tăng cường qua trung gian tái hợp nhất và sự biến mất của bộ nhớ IA tương ứng. Điều quan trọng cần lưu ý là ERK có chức năng như một bộ điều chỉnh ngược dòng của quá trình phosphoryl hóa CREB. Do đó, sự hoạt hóa thoáng qua của ERK trong giai đoạn ký ức ban đầu, ít nhất một phần, có thể góp phần vào quá trình phosphoryl hóa CREB này, kích hoạt sự biểu hiện của các gen cần thiết để tái hợp nhất và sự tuyệt chủng lâu dài.

Tương tự như những phát hiện trước đây của chúng tôi bằng cách sử dụng điều hòa sợ hãi theo ngữ cảnh (Mamiya và cộng sự, 2009), CREB được kích hoạt trong giai đoạn tái hợp nhất (amygdala / hippocampus / mPFC) và tuyệt chủng (amygdala / mPFC), trong khi ERK chỉ được kích hoạt trong giai đoạn tuyệt chủng 30 phút sau phiên kích hoạt lại. Nhất quán, chỉ một quần thể tế bào thần kinh pCREB1 / pERK– được quan sát thấy trong giai đoạn tái hợp nhất, trong khi các quần thể tế bào thần kinh riêng biệt được quan sát trong giai đoạn tuyệt chủng: pCREB1 / pERK– và pCREB1 / pERK1 trong hạch hạnh nhân (Hình 2); tế bào thần kinh pCREB– / pERK1 trong hồi hải mã (Hình 3); và các tế bào thần kinh pCREB1 / pERK–, pCREB– / pERK1 và pCREB1 / pERK1 trong mPFC (Hình 4). Những quan sát này, đặc biệt là quan sát tương phản về tế bào thần kinh pCREB– / pERK1 và pCREB1 / pERK–, gợi ý rằng sự hoạt hóa của CREB và ERK được điều chỉnh khác nhau trong mỗi vùng não khi trí nhớ bị dập tắt và sự kích hoạt pha muộn của ERK đóng vai trò cụ thể và riêng biệt. vai trò đối với sự tuyệt chủng của trí nhớ sợ hãi so với các quá trình trí nhớ khác như hợp nhất và tái hợp nhất như được thảo luận dưới đây. Điều thú vị là chúng tôi quan sát thấy rằng các tế bào thần kinh pERK1 có nhiều hơn trong mPFC so với hồi hải mã và hạch hạnh nhân, vì mPFC cho thấy tỷ lệ tế bào thần kinh pERK1 (giai đoạn tuyệt chủng) và tế bào thần kinh pCREB1 (giai đoạn tái hợp nhất) cao hơn so với hồi hải mã và hạch hạnh nhân, cho thấy rằng việc kích hoạt ERK trong mPFC đóng một vai trò cụ thể hơn trong việc xóa sổ bộ nhớ.

Vẫn chưa rõ liệu các quần thể tế bào thần kinh giống nhau hay khác nhau được kích hoạt trong các giai đoạn tái hợp nhất, chuyển tiếp và tuyệt chủng của bộ nhớ. Một nghiên cứu trước đây đã xác định sự kích hoạt của "tế bào thần kinh sợ hãi" và "tế bào thần kinh tuyệt chủng" trong hạch hạnh nhân khi trí nhớ về nỗi sợ hãi được dự đoán được kích hoạt lại hoặc bị dập tắt tương ứng (Herry và cộng sự, 2008). Do đó, có thể ERK và CREB được kích hoạt trong các quần thể tế bào thần kinh khác nhau có cấu hình thời gian khác nhau (tức là "tế bào thần kinh tái hợp nhất" và tế bào thần kinh tuyệt chủng). Như đã thảo luận ở trên, các tế bào thần kinh pCREB1, bao gồm các tế bào thần kinh pCREB1 / pERK1, có thể điều chỉnh quá trình tái hợp nhất và sự tắt lâu dài của bộ nhớ IA thông qua việc kích hoạt biểu hiện gen tương ứng là các tế bào thần kinh tái hợp nhất và tắt. Ngược lại, sự kích hoạt ERK trong tế bào thần kinh pCREB– / pERK1 có thể góp phần hủy bỏ hoạt động phiên mã qua trung gian CREB cần thiết để tái hợp nhất vì sự kích hoạt ERK này được quan sát cụ thể trong giai đoạn tắt muộn; ERK đã kích hoạt trong các tế bào thần kinh tái hợp nhất để hủy bỏ sự kích hoạt biểu hiện gen trong giai đoạn tuyệt chủng. Điều thú vị là, một nghiên cứu trước đây cho thấy kích hoạt ERK ở hải mã ngăn chặn sự cảm ứng của c-fos khi trí nhớ sợ hãi theo ngữ cảnh bị dập tắt (Guedea và cộng sự, 2011), làm tăng khả năng kích hoạt ERK này đối kháng với con đường tín hiệu CREB. Điều quan trọng là phải xác định các quần thể tế bào thần kinh điều chỉnh sự tái hợp nhất, chuyển tiếp và tuyệt chủng cũng như điều tra các dấu hiệu phân tử và ý nghĩa chức năng của các tế bào thần kinh đó. Ngoài ra, sự tương tác giữa các quần thể thần kinh được xác định trong nghiên cứu này vẫn chưa được biết. Có thể là các tế bào thần kinh "tuyệt chủng (chuyển tiếp)" điều chỉnh chức năng của các tế bào thần kinh tái hợp nhất để hủy bỏ ngăn chặn sự tái hợp nhất thông qua các tương tác giữa chúng (Eisenberg và cộng sự, 2003; Merlo và cộng sự, 2014). Do đó, điều quan trọng là phải kiểm tra những tương tác này trong và giữa các hạch hạnh nhân, mPFC và hồi hải mã.

Trước đây, chúng tôi đã chỉ ra rằng hải mã không có biểu hiện thay đổi quá trình phosphoryl hóa CREB và biểu hiện Arc sau khi học về sự sợ hãi theo ngữ cảnh về sự tuyệt chủng và nhất quán, sự ức chế tổng hợp protein ở hải mã trong giai đoạn tuyệt chủng không ngăn chặn được sự tuyệt chủng lâu dài (Mamiya et al. , 2009). Những quan sát này đã làm dấy lên khả năng rằng loài hải mã không cần thiết cho sự tuyệt chủng lâu dài. Tuy nhiên, chúng tôi đã chỉ ra rằng ERK được kích hoạt trong hải mã sau khi quá trình học tập trí nhớ IA bị tuyệt chủng, và liên tục, việc ngăn chặn kích hoạt ERK ở hải mã làm suy giảm sự tuyệt chủng lâu dài. Do đó, những quan sát hiện tại của chúng tôi chỉ ra những vai trò thiết yếu của hải mã trong việc tuyệt chủng trí nhớ. Kết hợp với những phát hiện trước đây của chúng tôi, chúng tôi gợi ý rằng hải mã là cần thiết cho quá trình tuyệt chủng trí nhớ nhưng không phải cho một quá trình giống như hợp nhất để ổn định "ký ức tuyệt chủng" thông qua việc kích hoạt biểu hiện gen.