Acylated Phenylethanoid Oligoglycosides với hoạt động bảo vệ gan từ thực vật sa mạc Cistanche Tubulosa

để biết thêm thông tin: Ali.ma@wecistanche.com

Toshio Morikawa và cộng sự

trừu tượng

Chiết xuất methanolic từ thân cây tươi củaCistanche tubulosa(Orobanchaceae) được phát hiện có tác dụng bảo vệ nhiệt chống lại tổn thương gan do D-galactosamine (D-GalN) / ​​lipopolysaccharide (LPS) gây ra ở chuột. Từ phần trích xuất, ba mớiphenylethanoidoligoglycoside, kankanosides H1 (1), H2 (2), và I (3), được phân lập cùng với 16phenylethanoid glycoside(4–19) và hai oligosugar acylated (20,21). Các cấu trúc của 1–3 được xác định trên cơ sở các đặc tính quang phổ cũng như độ tin cậy hóa học. Trong số các chủng phân lập, echinacoside (4, IC 50=10. 2 lM), acteoside (5, 4,6 lM), isoacteoside (6,5,3 lM), 20- acetylacteoside (8, 4,8 lM) và tubuloside A (10, 8,6 lM) ức chế tế bào chết do D-GalN gây ra. Năm phân lập này, 4 (31,1 lM), 5 (17,8 lM), 6 (22,7 lM), 8 (25,7 lM) và 10 (23,2 lM), và cistantubuloside B1 (11, 21,4 lM) cũng làm giảm TNF-a- gây độc tế bào trong tế bào L929. Hơn nữa, các thành phần chính (4–6) thể hiện tác dụng bảo vệ gan in vivo ở liều 25–100 mg / kg, PO.

Bấm để xem tác dụng phụ của cistanche và các sản phẩm của Cistanche

1. Giới thiệu

Cistanche tubulosa(SCHRENK) R. WIGHT (Orobanchaceae) là thực vật ký sinh lâu năm mọc trên rễ của Salvadora hoặc Calotropisspecies, và phân bố ở Bắc Phi, Ả Rập và các nước châu Á.Cistanche tubulosacũng như hỗ trợ salsa và Acistanche sa mạc theo truyền thống được sử dụng để điều trị chứng bất lực, vô sinh, đau thắt lưng và suy nhược cơ thể cũng như một tác nhân thúc đẩy tuần hoàn máu.phenylethanoids, iridoids, monoterpen và lignans được phân lập từ tiếng Trung Quốc và PakistanCistanche tubulosa.2,4–9 Trong quá trình nghiên cứu đặc điểm của chúng tôi về các thành phần hoạt tính sinh học trong loại thuốc tự nhiên này, trước đây chúng tôi đã báo cáo rằng năm iridoids, kankanosides A – D và kankanol, một monoterpeneglycoside, kankanoside E, haiphenylethanoidoligoglycoside, kankanosides F và G (23), và một đường oligo acyl hóa, kankanose (21), được phân lập từ chiết xuất methanolic của thân cây khô củaCistanche tubulosa.10,11. bởi noradrenaline trong động mạch chủ ngực chuột cô lập.11 Trong các nghiên cứu liên tục của chúng tôi về các thành phần trong cây, một chiết xuất methanolic từ thân cây tươi củaCistanche tubules cũ làcho thấy tác dụng bảo vệ đối với tổn thương gan doD-galactosamine (D-GalN) / ​​lipopolysaccharide (LPS) gây ra ở chuột. Từ chiết xuất metanolic, chúng tôi đã phân lập được baphenylethanoidoligoglycoside có tên kankanosides H1 (1), H2 (2), và I (3) cùng với 16 phenylethanoid glycoside (4–19) và hai oligosugar acyl hóa (20, 21). Bài báo này đề cập đến sự cô lập và làm sáng tỏ cấu trúc của nhữngphenylethanoidoligoglycosides (1–3). Yêu cầu về cấu trúc của glycoside phenylethanoid cho hoạt động bảo vệ nhiệt cũng được thảo luận (Hình 1)

2. Kết quả và thảo luận

2.1. Tác dụng bảo vệ của chiết xuất methanolic từ thân câyCistanche tubulosavề tổn thương gan do D-GalN / LPS gây ra ở chuột

Thân cây tươi củaCistanche tubulosa(được trồng ở Urumqi, Tân CươngProvince, Trung Quốc) được chiết xuất bằng metanol trong điều kiện hồi lưu để tạo ra chiết xuất metanol (8,36% từ thân cây tươi). Như bảng 1, ở liều 250–500 mg / kg, PO, dịch chiết metanol cho thấy tác dụng ức chế sự gia tăng trong huyết thanh aspartate amino transaminase (sAST) và alanin aminotransaminase (sALT), dấu hiệu tổn thương gan, gây ra bởi D- GalN / LPS ở chuột.

2.2. Các thành phần hóa học từ thân củaCistanche tubulosa

Chiết xuất methanolic từ thân cây tươi củaCistanche tubulosađược sắc ký cột Diaion HP -20 (H2O? MeOH) để tạo ra các phân đoạn rửa giải H2O- và MeOH (tương ứng là 5,63 phần trăm và 2,73 phần trăm). Phần được rửa giải MeOH được cho phép sắc ký cột SiO2 và ODS và cuối cùng là HPLC để cung cấp baphenylethanoidoligoglycosides, kankanosides H1 (1, 0. 0 0 08 phần trăm), H2 (2, 0,0001 phần trăm) và I (3, 0,0007 phần trăm) cùng với 16phenylethanoid glycoside, echinacoside2,11 (4, 0. 45 phần trăm), acteoside2,11 (5, 0. 28 phần trăm), isoacteoside2,11 (6, 0. 0 41 phần trăm), cis-acteoside12,13 (7, 0. 0 0 0 7 phần trăm), 20- acetylacteoside2,11 (8, {{ 42}}. 0 {{5 0}} 38 phần trăm), decaffeoylacteoside14 (9, 0. 0 0 0 2 phần trăm ), mặt tubulo A2,11 (1 0, 0. 013 phần trăm), cistantubulosides B19 (11, 0,0020 phần trăm), B29 (12,0,0003 phần trăm), Arenarioside15 (13, 0,0006 phần trăm), wiedemanninoside C16 (14,0,0008 phần trăm), cistantubuloside A9 (15, 0,0009 phần trăm), syringalide A 30- OaL rhamnopyranoside4 (16, 0,0017 phần trăm), campneosides I17,18 (17,0,015 phần trăm) và II17,18 (18 , 0,0005 phần trăm), và salidroside11 (19, 0,0027 phần trăm), và hai oligosugar acylated, cistanoside F11 (20, 0,0004 phần trăm) và kankanose11 (21, 0,0004 phần trăm).

2.3. Cấu trúc của kankanosit H1 (1), H2 (2) và I (3)

Kankanoside H1 (1) thu được dưới dạng bột màu trắng có quay quang âm (½a -24 D -45. 3 trong MeOH). Quang phổ IR của nó cho thấy các dải hấp thụ tại 3416, 1736, 1638, 16 0 5, 1518, 1 {{1 0 7}} 70 và 1040 cm 1 tương ứng với hydroxyl, cacbonyl este, chức ete, và vòng thơm. Mặt kính FABMS của ion dương và ion âm của 1 cho thấy các đỉnh ion bán phân tử lần lượt là m / z 835 (M cộng với Na) và m / z 811 (MH), và công thức phân tử được xác định là C37H48O20 bằng dương tính có độ phân giải cao- đo ion FABMS. Phổ 1H và 13C NMR của 1 (CD3OD, Bảng 2 và 3), được chỉ định bởi các thí nghiệm NMR khác nhau, 19 cho thấy các tín hiệu có thể gán cho hai metylenes [d 2,70 (2H, m, H 2-7), 3,66 , 4,07 (mỗi hạt 1H, cả m, H 2-8)], proton thơm loại ABC liên kết với ortho- andmeta [d 6,52 (1H, dd, J=1. 8,7,8 Hz, H { {50}}), 6,65 (1H, d, J=1. 8 Hz, H -2), 6,67 (1H, d, J=7. 8 Hz, H {{62 }})], hai đơn nguyên bD-glucopyranosyl [d 4,29 (1H, d, J=7. 8 Hz, terminal-Glc-H -1), 4,54 (1H, d, J {{76 }}. 2 Hz, trong-Glc-H -1)] và aa-L-rhamnopyranosyl [d 1,06 (3H, d, J=6. 0 Hz, Rha-H {{89 }}), 4,80 (1H, br s, Rha-H -1)] cùng với nhóm acetyl [d 1,98 (3H, s)] và nhóm trans-p-coumaroyl {an trans-olefin [d 6,34,7,67 (1H mỗi proton, cả d, J=16. 0 Hz, H -8 và 7)] và các proton thơm loại ortho-coupledA2B 2- [d 6,80, 7,46 (2H mỗi proton , cả d, J=8. 7 Hz, H -3, 5 và 2,6)]}. Các liên kết giữa các nguyên tố oligoglycoside và acyl trong 1 được đặc trưng bởi một thí nghiệm HMBC, cho thấy các mối tương quan trong phạm vi dài giữa các cặp proton và carbon theo sau: inner-Glc-H -1 và C -8 (dC71.9 ); bên trong-Glc-H -2 [d 4,88 (1H, giống như dd)] và axetyl cacbonylcarbon (dC 171,4); inner-Glc-H -4 [d 5,08 (1H, dd, J=9. 6, 9,6 Hz)] và cacbon p-coumaroyl cacbonyl (dC 168,2); Rha-H -1 và inner-Glc-C -3 (dC 80,5); và terminal-Glc-H -1 và inner-Glc-C -6 (dC69.3) (Hình 2). Cuối cùng, quá trình thủy phân kiềm của 1 với 5% kalihydroxit (KOH) đã giải phóng axit trans-p-coumaric, được xác định bằng phân tích HPLC, cùng với một sản phẩm khử vòng. Sản phẩm từ tế bào được xử lý liên tiếp bằng axit clohydric 1,0 M (HCl) để giải phóng L-rhamnose và D-glucose, được xác định bằng phân tích HPLC sử dụng máy dò quay quang học.10,11 Do đó, cấu trúc của kankanoside H1 đã được làm sáng tỏ {{181 }} (3, 4- dihydroxy phenyl) etyl OaL-rhamnopyranosyl - (1- 3) - [bD-glucopyranosyl - (1-6)] -2- O-acetyl {{196 }} O-trans-p-coumaroyl-bD-glucopyranoside (1).

Kankanoside H2 (2) được phân lập dưới dạng bột trắng với chuyển động quang âm (½a 25 D 52,4 trong MeOH). Công thức phân tử của nó C37H48O2 0 giống với công thức 1 bằng phép đo FABMS ion dương có độ phân giải cao. Các đặc tính quang phổ của số 2 rất giống với tính chất của 1, ngoại trừ các tín hiệu do nhóm cis-p-coumaroyl [d 5,79, 6,95 (mỗi chất 1H, cả d, J=12. 8 Hz, H {{ 22}} và 7), 6,76, 7,73 (2H mỗi loại, cả d, J=8. 7 Hz, H -3, 5 và 2,6)]. Hơn nữa, thí nghiệm HMBC trên 2 cũng cho thấy các chế độ tương quan tầm xa tương tự như các chế độ được phát hiện đối với 1 giữa các cặp proton và carbon sau: inner-Glc-H -1 [d 4.51 (1H, d, J {{44 }}. 8 Hz)] và C -8 (dC 72.0); trong-Glc-H -2 [d 4,88 (1H, m)] và cacbon axetyl cacbonyl (dC 171,4); trong-Glc-H -4 [d 4,98 (1H, dd, J=9. 6, 9,7 Hz)] và cacbon p-coumaroyl cacbonyl (dC 166,7); Rha-H -1 [d 4,77 (1H, d, J=1. 4 Hz, Rha-H -1)] và inner-Glc-C -3 (dC 80,7 ); và terminal-Glc-H -1 [d 4.28 (1H, d, J=7. 8 Hz)] và inner-Glc-C -6 (dC 69.4) (Hình 2) . Bằng nghiên cứu phân huỷ, 2 đã tạo ra axit cis-p-coumaric và hai loại đường giống như những đường thu được trong trường hợp 1. Do đó, cấu trúc của kankanoside H2 được làm sáng tỏ là 2- (3, 4- dihydroxy phenyl) etyl OaL-rhamnopyranosyl - (1-3) - [bD-glucopyranosyl - (1-6)] -2- O-acetyl -4- O-cis-p-coumaroyl- bD-glucopyranoside (2).

Kankanoside I (3) cũng được phân lập dưới dạng bột màu trắng với chuyển động quay quang âm (½a - 25 D -62. 2 trong MeOH). Công thức phân tử của nó, C35H46O18, được xác định bằng các phép đo FABMS vàHRFABMS dương và âm. Các đặc tính quang phổ của 3 (CD3OD, Bảng 2 và 3) là chồng chất lên các đặc tính của echinacoside (4), ngoại trừ các tín hiệu do phần aglycone {{hai methylenes {d 2,95 (2H, dd, J=7. 3, 7,8 Hz, H 2-7), [3,79 (1H, m), 4,1 0 (1H, dt, J=16. 9, 7,3 Hz), H {{32} }]}, proton thơm đơn phân [d7.18 (1H, m, H -4), 7.26–7.28 (4H, m, H -2, 6, 3,5)]}}. Quá trình thủy phân kiềm hóa 3 với 5% KOH giải phóng axit trans-caffeic, và sản phẩm tạo vòng được xử lý liên tiếp bằng HCl 1,0 M để giải phóng L-rhamnose và D-glucose. Cuối cùng, các liên kết của nhóm acyl và các phần tử đường trong 3 đã được làm rõ bởi HMBCexperiment, như được thể hiện trong Hình 2. Trên cơ sở xác định ở trên, cấu trúc của kankanoside I đã được làm sáng tỏ là 2- phenylethyl OaL- rhamnopyranosyl - (1-3) - [bD-glucopyrano-syl - (1-6)] -4- O-trans-caffeoyl-bD-glucopyranoside (3)

2.4. Ảnh hưởng của các thành phần hóa học từ thân cây Nhục thung dung lên độc tính tế bào do D-GalN gây ra trong tế bào gan nuôi cấy sơ cấp

Tổn thương gan do D-GalN / LPS được công nhận là phát triển các đáp ứng về mặt vi-rút học.19 Loại tổn thương gan này được báo cáo xảy ra ở hai dạng. Đầu tiên, độ nhạy đối với TNF-a do sự cạn kiệt củauridine triphosphate trong tế bào gan được tăng lên bởi D-GalN. Thứ hai, các chất trung gian gây viêm, chẳng hạn như NO và TNF-a, được giải phóng từ các đại thực bào được kích hoạt bằng LPS (tế bào của Kupffer). Quá trình chết của tế bào thực bào bởi TNF-a được báo cáo là có vai trò quan trọng trong tổn thương gan do D-GalN / LPS.20

Trong các nghiên cứu trước đây của chúng tôi về các hợp chất bảo vệ gan từ các loại thuốc tự nhiên, chúng tôi đã báo cáo rằng một số thành phần từ Hovenia Dulcis, 21 Bupleurum scorzonerifolium, 22,23 Curcuma zedoaria, 24–26Angelica furcijuga, 27,28 Betula sativum, 30 Salacia reticulata, 31 Tilia argentea, 32 Anastca hierochuntica, 33 Panax notoginseng, 34 Cyperus longus, 35 Erycibe expansa, 36Camellia sinensis, 37 Sedum sarmentosum, 38,39 Sinocrassula indica, 40Hedychium coronarium, 41 và Piper chaba42,43 cho thấy tác dụng bảo vệ gan đối với tổn thương gan do D-GalN / LPS gây ra ở chuột và / hoặc platyphylla var. japonica, 29 Tác dụng ức chế Pisum đối với độc tế bào do D-GalN gây ra ở tế bào nuôi cấy sơ cấp. Kể từ khi chiết xuất methanolic từ thân cây củaCistanche tubulosacho thấy tác dụng bảo vệ gan đối với tổn thương gan do D-GalN / LPS gây ra ở chuột (vide ante), tác dụng ức chế của các thành phần gây ra độc tế bào do D-GalN trong tế bào gan của chuột được nuôi cấy sơ cấp đã được kiểm tra bằng cách sử dụng 3- (4, { Thử nghiệm {6}} dimethylthiazol -2- yl) -2, 5- diphenyltetrazolium bromide (MTT). Như được trình bày trong Bảng 4, echinacoside (4, IC 50=10. 2 lM), acteoside (5, 4,6 lM), isoaceteoside (6, 5,3 lM), 20- acetylacteoside (8, 4,8 lM), tubulosides A (10,8,6 lM) và B11 (22, 14,6 lM), và kankanoside G11 (23, 14,8 lM) cho thấy hoạt động mạnh mẽ. Các hoạt động của chúng lớn hơn so với silybin thương mại (38,8 lM), 33–43 như là một đối chứng tích cực.44,45 Các yêu cầu về cấu trúc củaphenylethanoid glycoside for the activity were as follows; (1) the aglycone part was essential for the activity [4 >> kankanose (21, >100 lM), 5 >> cistanoside F (20, >100 lM)]; (2) aglycone có nhóm 3, 4- dihydroxy cho thấy hoạt động mạnh hơn so với có nhóm hydroxy 4- (6> 23); (3) gốc 60- ObD-glucopyranosyl làm giảm hoạt tính (4 <5,10><8); (4)="" phần="" 8-="" obd-glucopyranosyl="" có="" nhóm="" 40-="" o-caffeoyl="" cho="" thấy="" hoạt="" tính="" mạnh="" hơn="" phần="" có="" 60-="" nhóm="" o-caffeoyl="" (5="6," 8=""> 22 ); và (5) giới thiệu 20- O-acetylmoiety làm giảm hoạt động (8 5 5, 22 <>

Next, effects of the principal constituents (4–6) on NO and TNF productions, as markers of macrophage activation in LPS-activated mouse peritoneal macrophages were examined.43,46,47 As a result, these constituents (4–6) showed neither NO nor TNF production inhibitory activities (IC50 >100 lM, dữ liệu không được hiển thị) Do đó, các hợp chất này được tìm thấy không ảnh hưởng đến việc sản xuất quá mức NO và TNF-a từ các đại thực bào được kích hoạt bằng LPS.

2.5. Ảnh hưởng của các thành phần hóa học đối với độc tính gây ra TNF-a trong tế bào L929

Để làm rõ ảnh hưởng của các thành phần đối với sự nhạy cảm của tế bào gan với TNF-a, sự giảm khả năng sống của tế bào L929 do TNF-a gây ra, một dòng tế bào nhạy cảm với TNF-a, 48 đã được kiểm tra bằng cách sử dụng xét nghiệmMTT. Nếu không có mẫu thử nghiệm, khả năng sống sót của tế bào đã giảm xuống còn ca. 60% sau khi ủ tế bào với 20 ng / mL TNF-a trong 44 giờ so với trường hợp không có TNF-a. Như được trình bày trong Bảng 5, echinacoside (4, IC 50=31. 1 lM), acteoside (5, 17,8 lM), isoaceteoside (6, 22,7 lM), 20- acetylacteoside (8, 25,7 lM), tubuloside A (10,23,2 lM) và cistantubuloside B1 (11, 21,4 lM) ức chế sự giảm khả năng sống của tế bào, và các hoạt động của chúng được tìm thấy nhiều hơn hoạt động của piperine42,43 và silybin. Yêu cầu về cấu trúc so vớiphenylethanoid glycoside for the activity were as follows; (1) the aglycone part was essential for the activity [4 >> kankanose (21, >100 lM)]; (2) the aglycone having the 3,4-dihydroxy group showed stronger activity than that having the 4-hydroxy group [4 > cistantubuloside A (15, >100 lM), 5 > syringalide A 30 -O-a-L-rhamnopyranoside (16, >100 lM), 6 > kankanoside G (23, >100 lM)]; (3) the 60 -O-b-D-glucopyranosyl moiety reduced the activity (4 < 5); (4) the 8-O-b-D-glucopyranosyl part having the 40 -O-caffeoyl group showed stronger activity than that having the 60 -O-caffeoyl group [5 > 6, 8 > tubuloside B (22, >100 lM)]; và (5) đưa vào gốc 20- O-acetyl làm giảm hoạt tính (8 <5, 22=""><6). các="" yêu="" cầu="" này="" tương="" tự="" như="" các="" yêu="" cầu="" đã="" quan="" sát="" trong="" chương="" trước="" liên="" quan="" đến="" tác="" dụng="" ức="" chế="" độc="" tế="" bào="" do="" d-galn="" gây="" ra="" trong="" tế="" bào="" gan="" của="" chuột="" được="" nuôi="" cấy="" sơ="">

Những phát hiện trong ống nghiệm này cho thấy các cơ chế hoạt động có thể có sau đây đối với tác dụng bảo vệ gan của các thành phần của thân câyCistanche tubulosa: (i) giảm độc tính tế bào do D-GalN gây ra (4–6, 8, 10, 22, và 23), và (ii) giảm độc tính tế bào do TNF-a gây ra (4–6, 8, 10, và 11) .

2.6. Tác dụng bảo vệ của echinacoside (4), acteoside (5), andisoacteoside (6) chống lại tổn thương gan gây ra bởi sự xâm nhập của D-GalN / LPS và phương thức hoạt động của chúng

Cuối cùng, chúng tôi đã kiểm tra tác dụng của hiệu trưởngphenylethanoid glycoside, echinacoside (4), acteoside (5), và isoacteoside (6) đối với tổn thương gan do D-GalN / LPS gây ra ở chuột. Như được trình bày trong Bảng 6 và 4–6 đã ức chế đáng kể sự gia tăng sAST và sALT do D-GalN / LPS gây ra ở chuột ở liều 25–100 mg / kg, PO. Mặt khác, 4–6 không ảnh hưởng đến việc sản xuất quá mức TNF-a từ các đại thực bào được kích hoạt LPS. Hơn nữa, 4-6 ức chế đáng kể sự chết của tế bào L929 do TNF-a gây ra, cho thấy sự giảm độ nhạy của tế bào L929 đối với TNF-a (vide ante). Những phát hiện này cho rằng 4–6 làm giảm độ nhạy của các tế bào này với độc tính tế bào do TNF-a gây ra. Nhiều hợp chất ức chế tế bào bị cản trở bởi D-GalN và sản xuất TNF-a đã được báo cáo, 24,26,32 nhưng có một số báo cáo có ít hợp chất làm giảm độ nhạy của tế bào gan với TNF-a. 42,43,49,50 một cách có chọn lọc.

Tóm lại, từ thân cây tươi củaCistanche tubulosa, ba mớiphenylethanoid glycoside, kankanosides H1 (1), H2 (2) và I (3) cùng với 16phenylethanoid glycoside(4–19) và oligosugars haiacylated (20, 21) đã bị cô lập. Các yêu cầu về cấu trúc đối với tác dụng bảo vệ của chúng đối với tổn thương tế bào gan do D-GalN gây ra, và tác dụng bảo vệ tế bào đối với tế bào L929 doTNF-a gây ra như sau; (1) phần aglycone cần thiết cho hoạt động; (2) aglycone có nhóm 3, 4- dihydroxy cho thấy hoạt tính mạnh hơn so với nhóm hydroxy 4-; (3) gốc 60- ObD-glucopyranosyl làm giảm hoạt tính; (4) phần 8- ObD-glucopyranosyl có nhóm 40- O-caffeoyl cho thấy hoạt động mạnh hơn phần có nhóm 60- O-caffeoyl; và (5) giới thiệu {{27 }} Phân tử O-acetyl làm giảm hoạt tính. Hơn nữa, hiệu trưởngphenylethanoid glycoside, echinacoside (4), acteoside (5), và isoacteoside (6), ức chế sự gia tăng insAST và sALT ở liều 25–100 mg / kg PO trong chế phẩm được xử lý bằng D-GalN / LPS, và những tác dụng ức chế đó được đề xuất là phụ thuộc vào sự giảm nhạy cảm của tế bào gan với TNF-a. Biểu đồ chi tiết của hoạt động củaphenylethanoid glycosidenên được nghiên cứu thêm.

3. Thực nghiệm

3.1. Chung

Các dụng cụ sau đây được sử dụng để lấy dữ liệu quang phổ và vật lý: phép quay cụ thể, máy đo phân cực kỹ thuật số Horiba SEPA -300 (l=5 cm); Quang phổ UV, quang phổ kế Shimadzu UV -1600; Quang phổ hồng ngoại, quang phổ kế Shimadzu FTIR -8100; Phổ 1H và 13C NMR, máy đo phổ JEOLJNM-ECA600 (600 và 150 MHz) và JEOL JNM-ECS400 (400 và 100 HMz) với tetramethylsilane làm chất chuẩn nội; FABMS và FABMS độ phân giải cao, máy đo mặt nạ JEOL JMS-SX 102A; Đầu dò HPLC, Shimadzu RID -10 Một chỉ số khúc xạ, Shimadzu SPD -10 A UV – vis và Shodex OR -2. Cột HPLC, Cosmosil 5C 18- MS-II và pNAP (Nacalai TesqueInc., 250 4,6 mm id) và (250 - 20 mm id) lần lượt được sử dụng cho mục đích phân tích và chuẩn bị.

Các điều kiện thí nghiệm sau được sử dụng cho sắc ký: sắc ký cột silica gel pha thường (CC), silica gel 6 0 N (Kanto Chemical Co., Ltd, 63–21 0 lưới, hình cầu, trung tính ); silica gel pha đảo ngược CC, Diaion HP -20 (NipponRensui) và Chromatorex ODS DM1 0 20T (Fuji Silysia Chemical, Ltd, 100–200 mesh); TLC pha bình thường, tấm TLC tráng trước bằng gel silica 60F254 (Merck, 0,25 mm); TLC pha đảo ngược, tấmTLC được tráng trước bằng silica gel RP -18 F254S (Merck, 0,25 mm); HPTLC pha đảo ngược, các tấm TLC được tráng trước bằng silica gel RP -18 WF254S (Merck, 0,25 mm), việc phát hiện đạt được bằng cách phun 1 phần trăm Ce (SO4) 2–10 phần trăm dung dịch H2SO4, sau đó đun nóng .

3.2. Nguyên liệu thực vật

Thân cây tươi củaCistanche tubulosađược trồng tại Urumqi, tỉnh Tân Cương, Trung Quốc được thu hái vào tháng 9 năm 2007. Nguyên liệu thực vật được xác định bởi một trong các tác giả (MY). Phiếu mua vật liệu thực vật có trong hồ sơ trong phòng thí nghiệm của chúng tôi.

3.3. Chiết xuất và phân lập

Thân cây tươi củaCistanche tubulosa(2,98 kg) được cắt mịn và xử lý ba lần bằng metanol trong điều kiện hồi lưu trong 3 giờ. Làm bay hơi dung môi dưới áp suất giảm tạo ra dịch chiết metanol (249,1 g, 8,36 phần trăm). Dịch chiết metanol đã chịu tác dụng của Diaion HP 2 0 CC (5. 0 kg, H2O? MeOH) để tạo ra các phân đoạn được rửa giải bằng H2O và MeOH (167,84 g, 5,63 phần trăm và 81,21 g, 2,73 phần trăm , tương ứng). Phần MeOH rửa giải (61. 00 g) được cho vào silica gel pha thường CC [1,8 kg, CHCl3 – MeOH – H2O (15: 3: 0. 4? 1 {{48} }: 3: 0. 5? 6: 4: 1, v / v / v)? MeOH] để đưa ra bảy phân số [Fr. 1 (1,12 g), 2 (9,56 g), 3 (0. 89 g), 4 (1 0. 69 g), 5 (8,84 g), 6 (12,52 g) và 7 (4,6 0 g)]. Phần 2 (9,56 g) được tách bằng silica gel pha đảo CC [4 00 g, MeOH – H2O (1 {{2 0 1}}: 9 0, v / v)? meOH? axeton] để cho năm phân số [Fr. 2–1 (55,9 mg), 2–2 (4,48 g), 2–3 (3,42 g), 2–4 (1,16 g) và 2–5 (31,9 mg)]. Phần 2-3 (1. 0 0 g) chịu HPLC [Cosmo sil 5C 18- MS-II, CH3CN – 1 phần trăm AcOH trong nước (7:93, v / v)] để đưa ra bảy phân số [Fr. 2–3–1 (66,5 mg), 2–3–2 (2 0. 4 mg), 2–3–3 (26. 0 mg), 2–3–4 (136,6 mg), 2–3–5 (38 {{3 0 0}}. 6 mg), 2–3–7 (84,9 mg)]. Phần 2–3–4 (1 0 6,6 mg) được tinh chế thêm bằng HPLC [Cosmosil pNAP, CH3CN – 1 phần trăm AcOH trong nước (5:95, v / v)] để tạo ra salidroside (19,13,7 mg, {{34 0}}. 0 {{4 0 9}} 27 phần trăm). Phần 4 (1 0. 69 g) được phân tách bằng silica gel pha lại CC [5 0 0 g, MeOH – H2O (3 0: 7 0, v / v)? MeOH? Axeton] để cho bốn phân số [Fr. 4–1 (878,2 mg), 4–2 (7. 0 6 g), 4–3 (1,57 g) và 4–4 (792,8 mg)]. Phần 4–2 (1,5 {{56 0}} g) chịu HPLC [Cosmosil 5C 18- MS-II, CH3CN – 1 phần trăm AcOH trong nước (2 {{57 {{586} }}}: 8 0, v / v)] để cho năm phân số {Fr. 4–2–1 (42,9 mg), 4–2–2 [= campneoside I (17, 67. 0 mg, 0. 014 phần trăm)], 4–2– 3 [= acteoside (5, 1,21 g, 0,26 phần trăm)], 4–2–4 (41,6 mg) và 4–2–5 (181,3 mg)}. Phần 4–2–4 (41,6 mg) được tinh chế thêm bằng HPLC [Cosmosil pNAP, CH3CN – 1 phần trăm AcOH trong nước (18:82, v / v)] để tạo ra isoacteoside (6, 19,1 mg, 0,0040 phần trăm) và cis-acteoside (7,3,4 mg, 0,0007 phần trăm). Phần 4–3 (1,57 g) được tinh chế bằng HPLC [Cosmosil 5C 18- MS-II, CH3CN – 1 phần trăm AcOH trong nước (20:80, v / v)] để tạo ra 11 phần [Fr. 4–3–1 (30,4 mg), 4–3–2 (55,2 mg), 4–3–3 (= 17, 22,1 mg, 0,0010 phần trăm), 4–3–4 (= 5 , 224,6 mg, 0,010 phần trăm), 4–3–5 (27,4 mg), 4–3–6 (43,6 mg), 4–3–7 (= 6, 825,0 mg, 0,037 phần trăm), 4–3 –8 [= syringa lide A 30- OaL-rhamnopyranoside (16, 37,6 mg, 0,0017 phần trăm)], 4–3–9 (39,8 mg), 4–3–10 [{{310} } acetylacteoside (8, 85,4 mg, 0,0038 phần trăm)], và 4–3–11 (64,6 mg)]. Phần 4–3–6 (43,6 mg) được tinh chế thêm bởi HPLC [Cosmosil pNAP, CH3CN – 1 phần trăm AcOH trong nước (18: 82, v / v)] để tạo ra kankanoside H1 (1, 17,0 mg, 0,0008 phần trăm) và H2 (2,3,3 mg, 0,0001 phần trăm). Phần 4–3–9 (39,8 mg) được tinh chế thêm bằng HPLC [Cosmosil pNAP, CH3CN – 1 phần trăm AcOH trong nước (18:82, v / v)] để tạo ra kankanoside I (3, 15,4 mg, 0,0007 phần trăm) và 6 ( 3,1 mg, 0,0001 phần trăm). Phần 5 (8,84 g) được tách bằng silica gel pha đảo .CC [400 g, MeOH – H2O (20: 80-30: 70, v / v)? MeOH? Axeton] bảy phân số [Fr. 5–1 (870,2 mg), 5–2 (478,9 mg), 5–3 (3,72 g), 5–4 (979,9 mg), 5–5 (1,19 g), 5–6 (1,27 g) và 5 –7 (130,1 mg)]. Phần 5–1 (870,2 mg) được tinh chế bằng HPLC [Cos mosilpNAP, CH3CN – 1 phần trăm AcOH trong nước (5:95, v / v)] để cung cấp lacteoside decaffeoy (9, 5,1 mg, 0,0002 phần trăm) và cistanoside F ( 20, 8,1 mg, 0,0004 phần trăm). Phần 5–3 (3,72 g) được tinh chế bởi HPLC [Cosmosil5C 18- MS-II, CH3CN – 1 phần trăm AcOH trong nước (15:85, v / v)] để tạo ra sáu phần tử [Fr. 5–3–1 (128,6 mg), 5–3–2 [= kankanose (21, 9,4 mg, 0,0004 phần trăm)], 5–3–3 (64,6 mg), 5–3–4 (72,3 mg), 5–3–5 [= bên echinaco (4, 2,54 g, 0,11 phần trăm) và 5–3–6 (318,5 mg)]. Phần 5–3–4 (72,3 mg) được tinh chế thêm bằng HPLC [Cosmosil pNAP, CH3CN – 1 phần trăm AcOH trong nước (10:90, v / v)] để tạo ra campneoside II (18,10,6 mg, 0,0005 phần trăm). Phần 5–4 (979,9 mg) được tinh chế bằng HPLC [Cosmosil 5C 18- MS-II, CH3CN – 1 phần trăm AcOH trong nước (15:85, v / v)] để cung cấp các phân đoạn chonine [Fr. 5–4–1 (28,6 mg), 5–4–2 (90,5 mg), 5–4–3 (99,7 mg), 5–4–4 (= 4, 25,7 mg, 0,0012 phần trăm), 5 –4–5 (16,4 mg), 5–4–6 (318,5 mg), 5–4–7 (21,6 mg), 5–4–8 (= 5, 204,4 mg, 0,0091 phần trăm) và 5– 4–9 (134,7 mg)]. Phần 5–4–6 (318,5 mg) được tinh chế bằng HPLC [Cosmosil pNAP, CH3CN – 1 phần trăm AcOH trong nước (15:85, v / v)] để tạo cistantubulosides B1 (11, 44,9 mg, 0,0020 phần trăm), B2 (12 , 7,6 mg, 0,0003 phần trăm), và A (15, 21,1 mg, 0,0009 phần trăm) và wiedemanninoside C (14, 17,2 mg, 0,0008 phần trăm). Phần 5–5 (1,19 g) được tinh chế bằng HPLC [Cosmosil 5C 18- MS-II, CH3CN – 1 phần trăm AcOH trong nước (18:82, v / v)] để tạo ra tubuloside A (10, 300,3 mg, 0,013 phần trăm) và Arenarioside (13,5,8 mg, 0,0006 phần trăm). Phần 6 (12,52 g) được tách bằng silica gel pha đảo CC [600 g, MeOH – H2O (20: 80? 30: 70, v / v)? MeOH? Axeton] để tạo ra bốn phần [Fr. 6–1 (553,8 mg), 6–2 (10,69 g), 6–3 (1,40 g) và 6–4 (17,8 mg)]. Phần 6–2 (500,0 mg) được tinh chế bằng HPLC [Cosmosil 5C 18- MS-II, CH3CN – 1 phần trăm AcOH trong nước (25:75, v / v)] để tạo ra 4 (353,1 mg, 0,34 phần trăm ).

3.3.1. Kankanoside H1 (1)

Một chất bột màu trắng, ½a - 24 D -45. 3 (c 1,06, MeOH). FABMS ion dương có độ phân giải cao: Calcd cho C37H48O20Na (M cộng với Na) cộng với: 835.2637.Found: 835.2633. UV [MeOH, nm (log e)]: 226 (4,33), 293 (sh, 4,36), 317 (4,52). IR (KBr): 3416, 1736, 1638, 1605, 1518, 1070,1044 cm -1. 1H NMR (600 MHz, CD3OD) d: cho trong Bảng 2. 13CNMR (150 MHz, CD3OD) dC: cho trong Bảng 3. FABMS ion dương: m / z 835 (M cộng với Na) cộng. FABMS ion âm: m / z 811 (MH) -.

3.3.2. Kankanoside

H2 (2) Một chất bột màu trắng, ½a - 25 D -52. 4 (c 0. 27, MeOH). FABMS ion dương có độ phân giải cao: Màn hình C37H48O20Na (M cộng với Na) cộng với C37H48O20Na: 835.2637. Tìm thấy: 835.2644. UV [MeOH, nm (log e)]: 228 (4,26), 290 (sh, 4,22), 316 (4,37). IR (KBr): 3420, 1717, 1638, 1605, 1508, 1159, 1067 cm -1. 1H NMR (600 MHz, CD3OD) d: cho trong Bảng 2. 13C NMR (150 MHz, CD3OD) dC: cho trong Bảng 3. FABMS ion dương: m / z 835 (M cộng với Na) cộng với .Negative-ion FABMS : m / z 811 (MH) -.

3.3.3. Kankanoside I (3)

Bột màu trắng, ½a -25 D -62. 2 (c 1. 00, MeOH). FABMS ion dương có độ phân giải cao: Bộ điều khiển cho C35H46O18Na (M cộng với Na) cộng với: 777.2581.Found: 777.2585. UV [MeOH, nm (log e)]: 246 (3,97), 295 (sh, 4,04), 334 (4,23). IR (KBr): 3415, 1717, 1647, 1603, 1508, 1070.1046 cm -1. 1H NMR (600 MHz, CD3OD) d: cho trong Bảng 2. 13CNMR (150 MHz, CD3OD) dC: cho trong Bảng 3. FABMS ion dương: m / z 777 (M cộng với Na) cộng. FABMS ion âm: m / z 753 (MH) -.

3.4. Thủy phân kiềm và axit từ 1-3

Các dung dịch 1, 2 và 3 (mỗi 1,5 mg) trong 5 phần trăm kalihydroxit trong nước (KOH, 0. 5 mL) được khuấy ở 4 0 độ trong 1 giờ. Mỗi dung dịch được trung hòa bằng Dowex HCR W2 (dạng H cộng), và phần mềm được loại bỏ bằng cách lọc. Sự bay hơi của dung môi dưới áp suất giảm tạo ra các sản phẩm khử vòng tương ứng, được phân tích HPLC [cột: Cosmosil pNAP, 250 - 4. 6 mm id; pha động: CH3CN – 1 phần trăm AcOH trong nước (15:85, v / v); phát hiện: UV (254 nm); tốc độ dòng chảy: 1. 0 mL / phút] tobe được xác định là axit trans-caffeic (tR 9,9 phút từ 3), axit trans-p-coumaric (tR 17,1 phút từ 1) và axit cis-p-coumaric (tR17,8 phút tương ứng từ 2). Sau đó, mỗi chất được hòa tan trong 1. 0 MHCl (1. 0 mL) và được đun nóng ở 80 C trong 3 giờ. Sau khi được làm lạnh, hỗn hợp phản ứng được trung hòa bằng Amberlite IRA -400 (dạng OH), và nhựa được loại bỏ bằng cách lọc. Sau khi loại bỏ dung môi dưới áp suất giảm, cặn được tách ra bằng cột hộp mực Sep-Pak C18 (H2O? MeOH). Phân đoạn H2O rửa giải được phân tích HPLC trong các điều kiện sau: Cột HPLC, Kaseisorb LC NH 2-60-5, 4,6 mm id - 250 mm (Tokyo Kasei Co., Ltd, Tokyo, Nhật Bản); phát hiện, quay quang học [Shodex OR -2 (Showa Denko Co., Ltd, Tokyo, Nhật Bản); pha động, CH3CN – H2O (85:15, v / v); tốc độ dòng 0,8 mL / phút]. Việc xác định L-rhamnose (i) và D-glucose (ii) được giải phóng từ 1, 2 hoặc 3 trong phân đoạn rửa giảiH2O được thực hiện bằng cách so sánh thời gian lưu và quay quang học của chúng với thời gian lưu của chúng và độ quay quang học của các mẫu xác thực [i, tR 9,9 phút (âm)] và [ii, tR 17,9 phút (dương)].

3.5. Thử nghiệm sinh học

3.5.1. Thuốc thử

LPS (từ Salmonella enteritidis), môi trường thiết yếu tối thiểu (MEM), và môi trường William's E được mua từ Sigma – Aldrich Chemical (St. Louis, MO, Hoa Kỳ); huyết thanh bò thai (FBS) từ Invitrogen (Carlsbad, CA, USA); và các hóa chất khác của Wako Pure Chemical Industries, Co., Ltd (Osaka, Nhật Bản). 96- Các mẫu tốt được mua từ Sumitomo Bakelite Co., Ltd (Tokyo, Nhật Bản).

3.5.2. Loài vật

Chuột ddY đực được mua từ Phòng thí nghiệm Kiwa AnimalCo., Ltd, (Wakayama, Nhật Bản). Các con vật được nuôi ở nhiệt độ không đổi 23 ± 2 C và được cho ăn trong chuồng thí nghiệm tiêu chuẩn (MF, Oriental Yeast Co., Ltd, Tokyo, Japan). Tất cả các thí nghiệm đều được thực hiện với những con chuột có ý thức trừ khi có chú thích khác. Quy trình thử nghiệm đã được Ủy ban Nghiên cứu Động vật Thực nghiệm của Đại học Kinki phê duyệt.

3.5.3. Tác dụng bảo vệ đối với tổn thương gan do D-GalN / LPS gây ra

Phương pháp được mô tả bởi Tiegs và cộng sự.51 đã được sửa đổi và sử dụng cho thí nghiệm này. Tóm lại, những con chuột ddY đực có trọng lượng khoảng 25–30 được ăn thịt trong 20 giờ trước khi thí nghiệm. D-GalN (350 mg / kg) và LPS (10 lg / kg) hòa tan trong nước muối được tiêm vào màng bụng để gây tổn thương gan. Mỗi mẫu thử nghiệm được cho uống 1 giờ trước khi tiêm D-GalN / LPS. Mẫu máu được thu thập từ đám rối tĩnh mạch khung sau 10 giờ sau khi tiêm D-GalN / LPS. Mức sAST vàsALT được xác định bằng phương pháp Reitman – Frankel (bộ dụng cụ thương mại, Transaminase CII-Test Wako, Wako Pure ChemicalIndustries, Co., Ltd). Hydrocortisone được sử dụng như một đồng bảng Anh tham chiếu. Các mẫu thử nghiệm được treo bằng dung dịch kẹo cao su Ả Rập 5%, và dung dịch này được sử dụng bằng đường uống ở 10 mL / kg trong mỗi thử nghiệm, trong khi phương tiện được cho uống ở mức 10 mL / kg trong nhóm đối chứng tương ứng.

3.5.4. Tác dụng bảo vệ đối với độc tính tế bào do tế bào gan chuột nuôi cấy nội địa D-GalN gây ra

Tác dụng bảo vệ gan của các thành phần được xác định bởi {{0}} (4, 5- dimethylthiazol -2- yl) -2, 5- diphenyltetrazolium bromide (MTT ) xét nghiệm so màu sử dụng các tế bào gan nuôi cấy sơ cấp.33–43 Tế bào gan được phân lập từ chuột maleddY (30–35 g) bằng phương pháp truyền collagenase. Hỗn dịch tế bào ở 4 - 104 tế bào trong môi trường William's E 100 lL có chứa FBS (10 phần trăm), penicillin G (100 đơn vị / mL) và streptomycin (100lg / mL) được cấy vào 96- microlate tốt và được nuôi cấy trước trong 4 giờ ở 37 độ trong môi trường 5% CO2. Môi trường được bổ sung 100 lL môi trường tươi có chứa D-GalN (2 mM) có hoặc không có mẫu thử và tế bào gan được nuôi cấy trong 44 giờ. Môi trường được trao đổi với 100 lL môi trường mới, và 10 lL MTT [5 mg / mL trong dung dịch phosphat đệm kiềm (PBS)] được thêm vào môi trường. Sau 4 giờ ủ, môi trường được loại bỏ và 100 lL isopropanol chứa HCl 0,04 M sau đó được thêm vào để hòa tan formazan được tạo ra trong tế bào. Mật độ quang học (OD) của formazansolution được đo bằng đầu đọc vi tấm ở bước sóng 570 nm (tham chiếu: 655 nm). Sự ức chế (phần trăm) thu được theo công thức sau.

Ức chế (phần trăm)=[(OD (mẫu) - OD (kiểm soát)) / (OD (bình thường) -OD (kiểm soát))] x 100

3.5.5. Ảnh hưởng đến việc sản xuất NO trong đại thực bào phúc mạc chuột được kích thích bằng LPS

Thử nghiệm sàng lọc để phát hiện NO bằng cách sử dụng đại thực bào phúc mạc chuột do TGC cảm ứng đã được thực hiện như mô tả trước đây. 43,46,

3.5.6. Ảnh hưởng đến việc sản xuất TNF-a trong các đại thực bào phúc mạc chuột được kích thích bằng LPS

TNF-a được giải phóng trong môi trường được xác định như mô tả trước đây28 với một chút sửa đổi. Tóm lại, đại thực bào phúc mạc do TGC gây ra (5 - 105 tế bào / giếng) được thu thập từ các khoang phúc mạc của chuột ddY đực, lơ lửng trong 1 0 0 lLof RPMI 1640 được bổ sung 5 phần trăm FBS, penicillin (100 đơn vị / mL), và streptomycin (100 lg / mL), và được nuôi cấy trước trong 96- vi mẫu tốt ở 37 độ trong 5% CO2 trong không khí trong 1 giờ. Các tế bào không kết dính được loại bỏ bằng cách rửa với PBS, và thêm 100 lL môi trường tươi có chứa các nồng độ khác nhau của hợp chất thử nghiệm. Sau 10 phút, 100 lL môi trường chứa 10 lg / mL LPS được thêm vào và ủ trong 4 giờ. Sản xuất TNF-a trong mỗi giếng được xác định bằng cách sử dụng bộ ELISA (Bộ kit ELISA TNF-a của chuột, Invitrogen). Mỗi hợp chất thử nghiệm được hòa tan trong DMSO, và dung dịch được thêm vào môi trường (nồng độ DMSO cuối cùng là 0,5 phần trăm)

3.5.7. Tác dụng ức chế sự chết tế bào do TNF-a gây ra trong tế bào L929

Tế bào L929 (Dainippon Pharmaceuticals, Osaka, Japan) được sơn màu trong Minimum Essential Medium Eagle (MEM, Sigma – Aldrich) chứa 1 0 phần trăm FBS, 1 phần trăm MEM axit amin không thiết yếu (Invitrogen), penicillin G (100 đơn vị / mL), và streptomycin (100 lg / mL) ở 37 C trong môi trường 5% CO2. Các tế bào được cấy trong 96- đĩa nuôi cấy mô giếng [3 -104 tế bào / giếng trong 100 lL / giếng trong MEM]. Sau 44 giờ ủ trong môi trườngTNF-a (20 ng / mL) có hoặc không có mẫu thử, khả năng sống của các tế bào được đánh giá bằng xét nghiệm so màu MTT (videante) .49,50 Mỗi hợp chất thử nghiệm được hòa tan trong DMSO, và độ phân giải được thêm vào môi trường (nồng độ cuối cùng tính bằng DMSO0,5 phần trăm).

3.6. Số liệu thống kê

Giá trị được biểu thị bằng giá trị trung bình ± SEM Phân tích phương sai một chiều (ANOVA) theo sau thử nghiệm của Dunnett được sử dụng để phân tích thống kê. Giá trị xác suất (p) nhỏ hơn 0. 05 được coi là quan trọng.

Sự nhìn nhận

TM, KN và OM được hỗ trợ bởi Dự án Tài trợ cho Nghiên cứu Khoa học từ Trung tâm Nghiên cứu Công nghệ cao dành cho Tư nhân , Thể thao, Khoa học và Công nghệ (MEXT) của Nhật Bản, 2007–2011 và cũng được hỗ trợ bởi Khoản tài trợ cho Nghiên cứu Khoa học từ MEXT. MY và HM đã được hỗ trợ bởi Chương trình COE lần thứ 21, Dự án Biên giới Học thuật và Khoản tài trợ cho Nghiên cứu Khoa học từ MEX

Từ: 'Acylatedphenylethanoidoligoglycosides có hoạt tính bảo vệ gan từ cây sa mạcCistanche tubulosa' quaToshio Morikawa và cộng sự

---Tổ chức sinh học & Hóa dược 18 (2010) 1882–1890.