Những tiến bộ trong nhận dạng phân tử của Cistanche

Trừu tượng:rãnhHerba, một loại dược liệu quý hiếm ở Trung Quốc, có giá trị dược liệu và giá trị sinh thái cao. Với sự tiến bộ của các kỹ thuật sinh học phân tử, nhiều kỹ thuật nhận dạng phân tử dựa trên DNA đã dần được cải thiện và đã đạt được bước tiến lớn trong nghiên cứu vềrãnhthảo dược. Bài báo này xem xét các kỹ thuật nhận dạng phân tử dựa trên DNA chonước tiểuvà thảo luận về những hạn chế và triển vọng ứng dụng, dự kiến ​​sẽ đóng vai trò là tài liệu tham khảo để xác định chính xác và đánh giá chất lượng của Cistanches Herba, bảo vệ và sử dụng hợp lý các nguồn tài nguyên cũng như đa dạng về nhân giống.

từ khóa:nước tiểu; nhận dạng phân tử; kỹ thuật đánh dấu phân tử; việc xác định và chất lượng; bảo tồn tài nguyên

Nhấn vào đây để biết thêm chi tiết về các thành phần của Cistanche

Cistanche là thân thịt có lá vảy khô của cây Cistanche Deserticola YC Ma vàCistache tubulosa(Schenk) Wight, một loài thực vật thuộc chinước tiểutrong gia đình Cistanche. Jiangyun, Cunyun, Cistanche, và Chagangaoya (tiếng Mông Cổ) được mệnh danh là “nhân sâm sa mạc” [2]. Trong những năm gần đây, khi nguồn tài nguyên của Cistanche hoang dã đang trên bờ vực cạn kiệt và nhu cầu trong nước ngày càng tăng, một số lượng lớn các sản phẩm giả của Cistanche đã tràn vào thị trường thuốc thảo dược Trung Quốc, gây ra sự biến động lớn về giá cả thị trường , và chất lượng của dược liệu không được đảm bảo, điều này gây nguy hiểm nghiêm trọng đến sự an toàn của thuốc lâm sàng. tình dục [3]. Do đó, việc bảo tồn, nghiên cứu và phát triển hợp lý cũng như sử dụng nguồn gen thực vật Cistanche sắp xảy ra và việc xác định chính xác nguồn gen thực vật Cistanche là đặc biệt quan trọng.

càng quan trọng. Ấn bản năm 2020 của "Dược điển Cộng hòa Nhân dân Trung Hoa" (sau đây gọi là "Dược điển Trung Quốc") chỉ ghi rằng thân cây có vảy khô của Cistanche Deserticola được sử dụng làm thuốc chính hiệu. Từ góc độ tình hình, ngoài các cây Cistanche và Cistanche tubehua được ghi trong ấn bản 2020 của "Dược điển Trung Quốc", còn có Cistanche sinensis G. Beck, C. salsa (CA Mey.) G. Beck, Lanzhou Cistanche C. lanzhouensis ZY Zhang, v.v. [4], cũng có một số lượng lớn hiện tượng pha tạp giả. Với sự phát triển và cải tiến liên tục của công nghệ sinh học phân tử, công nghệ nhận dạng phân tử có ưu điểm là tiêu thụ ít mẫu, tốc độ cao và độ chính xác cao, và đã được sử dụng rộng rãi trong việc xác định loài động vật và thực vật. Sự phát triển của nghiên cứu khai thác tài nguyên cũng tương đối nhanh [5]. Hiện nay đã có một số tiến bộ trong việc định danh dược liệu Cistanche bằng công nghệ định danh phân tử. Theo phân loại của công nghệ đánh dấu phân tử cần thiết để nhận dạng phân tử [6], bài viết này xem xét việc nhận dạng tế bào mầm của Cistanche Deserticola và các khía cạnh khác, đồng thời thảo luận về sự tồn tại của việc nhận dạng tế bào mầm của Cistanche Deserticola. Phân tích các vấn đề và đưa ra các giải pháp tương ứng, nhằm cung cấp tài liệu tham khảo cho việc bảo vệ, sử dụng hợp lý và canh tác các giống cây Cistanche mới.

1 Ứng dụng công nghệ mã vạch DNA trong nhận dạng cây Cistanche

1.1 Công nghệ mã vạch DNA

Năm 2003, Giáo sư Paul Hebert của Đại học Guelph ở Canada đã đưa công nghệ mã vạch vào thế giới sinh học và lần đầu tiên đưa ra khái niệm “mã vạch DNA” [7]. Công nghệ mã vạch DNA là một phương pháp hiệu quả để xác định y học cổ truyền Trung Quốc và các nguyên liệu thô đa dạng. Đối với DNA tương ứng, các đoạn ứng cử viên được khuếch đại bằng phản ứng chuỗi polymerase mồi chung (PCR), các sản phẩm khuếch đại PCR được tinh chế, giải trình tự và phân tích, trình tự mã vạch DNA đích được tìm kiếm và hệ thống nhận dạng mã vạch DNA được xây dựng [8 ]. Tóm lại, nhận dạng mã vạch DNA là một phương pháp nhận dạng phân tử sinh học sử dụng một hoặc một vài đoạn DNA tiêu chuẩn, tương đối ngắn để nhận dạng loài [9].

Trong những năm gần đây, thông qua sự kết hợp giữa công nghệ giải trình tự thông lượng cao và công nghệ nhận dạng mã vạch DNA, một công nghệ mới có thể phát hiện trình tự mã vạch của nhiều loài trong các mẫu hỗn hợp cùng một lúc đã được phát triển——Mã mã vạch DNA, nguyên tắc cơ bản của nó là áp dụng giải trình tự thông lượng cao Công nghệ thu được trình tự khuếch đại của mã vạch hỗn hợp và xác định thành phần loài trong mẫu hỗn hợp bằng phương pháp phân tích tin sinh học[10].

1.2 Lựa chọn trình tự mã vạch DNA

Các trình tự mã vạch có thể được sử dụng trong công nghệ mã vạch DNA bao gồm coenzyme ty thể Ⅰ (CO Ⅰ) DNA, trình tự 12S rRNA, 16S rRNA và 18S rDNA của ribosome để nhận dạng loài động vật[11]; 16S rDNA của ribosome để nhận dạng vi khuẩn[12] ], các đoạn gen đặc hiệu của gen phiên mã bên trong ribosome (ITS) và trình tự CO I để nhận dạng nấm[13]; do tốc độ tiến hóa chậm của bộ gen ty thể ở thực vật, các đoạn mã vạch chủ yếu được chọn lọc trên bộ gen lục lạp. Các đoạn gen được đề xuất chủ yếu bao gồm rpoB, rpoC1, matK, rbcL và UPA, và các đoạn vùng không mã hóa bao gồm atpF-atpH, trnH-psbA, psbK-psbI, và

ITS gen có nhân [14]. Năm 2006, nhóm nghiên cứu của Chen Shilin đã kiểm tra khả năng phân biệt của ITS2 trên hơn 6.600 mẫu thực vật và phát hiện ra rằng hiệu quả nhận dạng của ITS2 ở cấp loài cao tới 92,7%, cho thấy trình tự ITS2 có thể xác định mã vạch DNA tiêu chuẩn của cây thuốc và các loài có liên quan chặt chẽ. ITS2 đã được sử dụng như một loại mã vạch DNA phổ quát mới cho cây thuốc [15] và đã được các chuyên gia ngang hàng quốc tế công nhận [16].

Vào năm 2013, Ủy ban Dược điển Quốc gia đã thảo luận và phê duyệt việc đưa các hướng dẫn về nhận dạng phân tử mã vạch DNA cho các dược liệu Trung Quốc trong phiên bản bổ sung của "Dược điển Trung Quốc". ITS2 là hệ thống nhận dạng mã vạch DNA cốt lõi cho dược liệu thực vật [17].

Hiện tại, nhiều học giả đã tiến hành nghiên cứu nhận dạng phân tử trên cây Cistanche. Theo nghiên cứu của Chen Shilin et al. [18], ITS2 phù hợp làm chuỗi mã vạch tiêu chuẩn để nhận dạng cây thuốc. Sun Zhiying và cộng sự [19] đã phát hiện ra rằng trình tự ITS2 có thể được sử dụng làm cơ sở để xác định hiệu quả loại thuốc thảo dược Trung Quốc Cistanche Deserticola và các sản phẩm giả của nó trong mã vạch DNA. Wang Xiaoyue và cộng sự [20] đã sử dụng mã vạch ITS2 để xác định 4 sản phẩm bị xáo trộn phổ biến của Cynomorium, Cistanche, Liedang và Cistanche, đồng thời thiết lập thành công "thẻ nhận dạng phân tử" cho các sản phẩm bị xáo trộn của Cistanche. Phương pháp xác định cây thuốc thông qua trình tự ITS2 tương đối hoàn thiện và có ưu điểm là nhanh chóng, chính xác và hiệu quả. Do đó, sử dụng trình tự ITS2 để xác định cây Cistanche đã trở thành phương pháp được sử dụng phổ biến nhất.

1.3 Quy trình làm việc của mã vạch DNA

Quy trình của mã vạch DNA tương tự như hoạt động của nghiên cứu phát sinh loài phân tử và các bước chính được thể hiện trong Hình 1. Gu Xiuyan [21] đã thu được trình tự cơ sở của ITS và phân tích sự khác biệt giữa các loài và phát hiện ra rằng Cistanche có quan hệ họ hàng gần nước muối Cistanche, và Cistanche ở Lan Châu có liên quan mật thiết với Cistanche, điều này cũng tạo cơ sở cho việc phát triển các nguồn thuốc mới của Cistanche. nền tảng. Li Zhenhua và cộng sự [22] đã thực hiện nghiên cứu xác định phân tử DNA trên Cynomorium, Cistanche và Huanghua Liedang, và nhận ra việc xác định nhanh chóng và chính xác Cistanche và Cynomorium giả, Cistanche và Huanghualiedang bằng PCR tại chỗ cụ thể.

Nói tóm lại, đã có một quy trình tương đối hoàn chỉnh để xác định các loài thực vật bằng mã vạch DNA. Xác định cây Cistanche bằng cách phân tích trình tự DNA và thiết lập cơ sở dữ liệu liên quan có thể cung cấp thêm cơ sở cho việc xác định và phân loại cây Cistanche trong tương lai.

1.4 Phân tích dữ liệu mã vạch DNA

Xử lý và phân tích dữ liệu thu được là một nhiệm vụ rất quan trọng [18]. Sau khi quá trình giải trình tự hoàn tất, so sánh trình tự và hiệu chỉnh thủ công được thực hiện để loại bỏ các vùng trình tự và đoạn mồi chất lượng thấp. Phần mềm thường được sử dụng bao gồm Chromas, CExpress[23], v.v.; Phân tích khoảng cách di truyền của trình tự cuối cùng thường được thực hiện bởi phần mềm MEGA [24] để phân tích khoảng cách di truyền giữa các mẫu của các loài thực vật khác nhau và mô hình K2P [25-26] được sử dụng để tính khoảng cách giữa các loài ; sau đó xây dựng Cây phát sinh loài liên kết hàng xóm (NJ), sử dụng trang web trực tuyến iTol [27] để cải thiện và làm đẹp cây phát triển (https://itol.embl.de/) và kiểm tra tỷ lệ hỗ trợ của từng nhánh theo bootstrap (1000 lần lặp lại).

Phương pháp BLAST là một thuật toán tìm kiếm dựa trên BLAST. Cần thiết lập hoặc tải xuống cơ sở dữ liệu trình tự tham chiếu để xác định loài trên cơ sở dữ liệu GenBank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) để phân tích tiếp theo các đoạn gen và công việc xác định loài [28]. Xu Danyun và cộng sự [29] đã sử dụng 3 cặp mồi phổ mã vạch DNA để xác định 22 loài thực vật Lauraceae và đã xác định thành công 20 loài thực vật. Adolfo và cộng sự [30] đã xác định thành công 3 loài cây Pueraria sử dụng mã vạch ITS2 và matK. Các nghiên cứu trên chứng minh rằng bằng cách lấy và phân tích trình tự DNA của cây thuốc, các loài thực vật có thể được xác định nhanh chóng và hiệu quả.

2 Ứng dụng các kỹ thuật đánh dấu phân tử khác trong việc xác định cây Cistanche

Đối với các sinh vật, các đặc điểm của chúng trên cấp độ phân tử cuối cùng được xác định bởi các đặc điểm phân tử. So với phân tích hình thái [31] và phân tích nhiễm sắc thể [32], chỉ thị phân tử có thể tiết lộ bộ mặt thật của đa dạng di truyền sinh học. Sarwat và cộng sự [33] đã sử dụng đa hình độ dài đoạn khuếch đại (AFLP), công nghệ locus vi vệ tinh đa hình khuếch đại có chọn lọc (SAMPL), khuếch đại lặp lại xen kẽ trình tự đơn giản (ISSR), DNA đa hình khuếch đại ngẫu nhiên (RAPD) và các kỹ thuật đánh dấu phân tử khác đã phát hiện ra sự đa dạng di truyền của các mẫu Tribulus terrestris được thu thập từ những nơi khác nhau ở Ấn Độ và kết quả cho thấy bốn kỹ thuật đánh dấu phân tử này có thể thu được các dấu vết DNA khác nhau duy nhất cho từng khu vực địa lý. Liên minh quốc tế về bảo vệ quyền giống cây trồng (UPOV) cũng sử dụng nhận dạng dấu hiệu phân tử DNA như một phương tiện phụ trợ cho thử nghiệm DUS (tính đồng nhất và tính ổn định khác biệt) của các giống cây trồng [34]. Hiện tại, các công nghệ đánh dấu phân tử như AFLP, RAPD và ISSR đã tương đối hoàn thiện và được sử dụng rộng rãi trong việc xác định cây Cistanche (Bảng 1).

Hỗ trợ:

wallence.suen@wecistanche.com 0015292862950