Ảnh hưởng có lợi / không thuận lợi của Quercetin lên màng tế bào u nguyên bào thần kinh SK-N-SH Phần 2

Vui lòng bấm vàooscar.xiao@wecistanche.comđể biết thêm thông tin

2.2.2. Hoạt động chống oxy hóa của Quercetin

Để kiểm tra hiệu quả của quercetin trong việc bảo vệ màng chống lại stress oxy hóa, các thí nghiệm đã được thực hiện trong đó các mô hình lipid của màng được tiếp xúc với ozone trong điều kiện không có （Hình 4a） và sự hiện diện của quercetin ở nồng độ 6,25 μM (Hình 4b).

Dưới ảnh hưởng của ôzôn, quá trình của cả hai phần phụ thuộc, tức là, π {{0}} f (A) và Cs -1= f (rn) đều thay đổi. Các đường đẳng nhiệt thu được đối với sự lan truyền đơn lớp trên phân pha chứa ôzôn được đặc trưng bởi độ dốc nhỏ hơn và sự dịch chuyển về phía các giá trị A thấp hơn. Hơn nữa, giá trị Cs -1 giảm dưới ảnh hưởng của ôzôn. Những thay đổi này là lớn nhất ở nồng độ ôzôn khoảng 0,4 ppm.cintancheNồng độ ôzôn tăng hơn nữa không làm tăng những thay đổi trong các đặc tính của lớp đơn lớp (Hình 4a).

Hình 4. Đường đẳng nhiệt áp suất bề mặt và mô đun nén tương ứng (hình trong) của mô hình lipid của các lớp u nguyên bào thần kinh trải rộng trên tiểu pha chứa nồng độ ôzôn hòa tan trong dung dịch đệm được chỉ định. Isotherms: (a) khi không có chất chống oxy hóa; （b） với sự có mặt của quercetin （6,25 μM） được thêm vào đệm chứa ôzôn.

Khi quercetin ở nồng độ 6,25 μM được đưa vào pha con, ozon không ảnh hưởng đáng kể đến quá trình của đường đẳng nhiệt r (A); tuy nhiên, các giá trị của mô đun nén thay đổi khi có mặt ozone tương tự như trong trường hợp không có quercetin (Hình 4b inet).

Vui lòng bấm vào đây để biết thêm

Các giá trị số của các tham số đặc trưng cho các lớp đơn lớp được xác định dựa trên các đường đẳng nhiệt thu được được trình bày trong Bảng 3.

Bảng 3. Các thông số bề mặt của các lớp đơn lớp Alim và Cs-I được tính toán cho các lớp đơn lớp của mô hình màng u nguyên bào thần kinh trải trên tiểu pha chứa nồng độ chỉ định của ozon hòa tan trong đệm khi không có và có mặt của quercetin (6,25 uM). Dữ liệu đại diện cho giá trị trung bình từ ba thí nghiệm ± SD. Các chữ cái khác nhau biểu thị sự khác biệt đáng kể (p Nhỏ hơn hoặc bằng 0. 05).

Với sự có mặt của ôzôn, sự giảm nhẹ diện tích bề mặt trên mỗi phân tử (Alim) trong lớp đơn lớp dày đặc được quan sát thấy. Mức giảm tối đa của thông số này là 3,2 phần trăm so với đối chứng (đơn lớp trên bộ đệm thuần túy). Thông số Cs-I cũng giảm xuống, đạt giá trị ổn định ở nồng độ ôzôn trên 0. 6 ppm O. Mức giảm tối đa của thông số này đạt 24 phần trăm so với đối chứng.

Khi quercetin ở nồng độ 6,25 uM có mặt trong pha con, giá trị Alim (1-2 phần trăm) giảm nhẹ, trong khi mức giảm giá trị Cs -1 là khoảng 27 phần trăm.

Bản chất của Alim thay đổi khi có mặt ozone và ozone kết hợp với quercetin có các khóa học khác nhau. Ở nồng độ ôzôn khoảng 0. 3 ppm, khi không có quercetin, Aimdec giảm đột ngột xuống khoảng 88,3 A2. Sau đó, nó đạt đến giá trị bình nguyên tối thiểu cho sự phụ thuộc hình dạng S đặc trưng (Hình 5a, các điểm màu đỏ). Khi có mặt quercetin, Alim giảm đơn âm mịn nhẹ, đạt đến nồng độ ôzôn cao hơn bình nguyên khoảng 93,5 A2 (Hình 5a, các điểm màu xanh lá cây).

Hình 5. với các điểm màu xanh lá cây quercetin. Các đường không hiển thị bất kỳ mô hình vật lý nào, được điều chỉnh bằng toán học và được vẽ để thuận tiện cho việc theo dõi các thay đổi tham số. Các giá trị mô đun nén tầng cực đại thay đổi tương tự với nồng độ ôzôn đối với cả hai: Khi không có và có mặt của quercetin (Hình 5b).

3. Thảo luận

Cơ chế hoạt động của quercetin đã được nghiên cứu kỹ lưỡng trong nhiều năm, nhưng các kết quả thí nghiệm thường trái ngược nhau và chỉ ra rằng trong một số trường hợp, hợp chất này có lợi và trong một số trường hợp khác, không có lợi cho tế bào. Phân tích các nghiên cứu hiện có cho thấy tác dụng của hợp chất này đối với tế bào có liên quan đến hai khía cạnh, tức là sự tương tác của nó với màng và hoạt động chống oxy hóa. Tuy nhiên, trong tế bào, không thể phân biệt hai phương thức hoạt động của quercetin này và việc đánh giá sự phù hợp của hợp chất này như một chất tiềm năng, ví dụ, có hoạt tính kháng u. Vì lý do này, các thí nghiệm đã được lên kế hoạch để đánh giá một cách định tính và định lượng ảnh hưởng của hợp chất này đối với các tính chất cơ học của màng, cũng như hoạt động chống oxy hóa của nó trong hệ thống mô hình, giúp loại bỏ các ảnh hưởng của hoạt động của các con đường trao đổi chất khác.

Dựa trên các thí nghiệm đã thực hiện, người ta đã xác nhận rằng ngay cả ở nồng độ thấp nhất (6,25 uM), quercetin thay đổi (như được chỉ ra bởi sự gia tăng Alimvalue) các đơn lớp của mô hình, bắt chước phần lipid của màng tế bào u nguyên bào thần kinh. Nó chỉ ra khả năng tương tác của quercetin với màng của các tế bào này khi đến não, ngay cả ở nồng độ thấp. Điều này đặc biệt quan trọng đối với các tế bào thần kinh có màng chứa một lượng tương đối lớn lipid.

Cistanche có thể cải thiện khả năng miễn dịch

Tỷ lệ lipid-protein gần đúng đối với tế bào thần kinh là 80:20 phần trăm, và ví dụ, đối với màng hồng cầu, tỷ lệ này là 50:50 phần trăm [29]. Mức độ lipid như vậy trong màng tế bào thần kinh có liên quan đến vai trò của các tế bào này trong việc truyền tín hiệu điện. Đồng thời, ngay cả những thay đổi tinh vi trong các đặc tính hóa lý, chẳng hạn như tính linh hoạt và độ cứng, của màng tế bào, cũng có thể làm rối loạn chức năng này một cách đáng kể.

Điện thế hoạt động được chuyển dọc theo màng tế bào thần kinh nhờ hoạt động của các kênh ion, và sau đó, nhờ hoạt động của các bơm ion, điện thế nghỉ được phục hồi. Hoạt động thích hợp của các protein này (đặc biệt, được xác định bởi hình dạng của chúng) phụ thuộc chặt chẽ vào môi trường lipid. Hơn nữa, những thay đổi về tính chất cơ học của màng có thể làm xáo trộn hoạt động của các kênh mà cơ chế kiểm soát khí phụ thuộc chính xác vào các đặc tính cơ học của màng.

Những luận điểm này được xác nhận bởi các nghiên cứu cho thấy tác dụng của quercetin trên màng tế bào, liên quan đến sự vận chuyển của ion Ca2 cộng và / hoặc chuyển hóa Ca2 cộng [30,31]. Do đó, việc đưa các phân tử quercetin vào môi trường của màng (đặc biệt là của tế bào thần kinh) có thể gây ra những hậu quả đáng kể đối với hoạt động của chúng.

Để kiểm tra xem hoạt động của quercetin được xác định trong hệ thống mô hình đóng vai trò có lợi hay bất lợi đối với tế bào, kết quả thu được đối với màng mô hình được so sánh với tác dụng của hợp chất này trên toàn bộ tế bào u nguyên bào thần kinh. Đối với các ô SK-N-SH, thử nghiệm MTT đã được thực hiện,Chiết xuất Cistanche chống bệnh Alzheimercung cấp thông tin về khả năng sống sót của tế bào tỷ lệ thuận với các enzym dehydrogenase của ty thể.

Kết quả thu được cho thấy sự hiện diện của quercetin ở nồng độ 100 và 200uM làm tăng số lượng tế bào sống sót. Bao và cộng sự cũng thu được kết quả tương tự. [32], điều tra ảnh hưởng của quercetin trên tế bào PC -12. Sự rò rỉ LDH ra môi trường ngoại bào, cung cấp thông tin về sự phá vỡ màng tế bào, cũng được kiểm tra ở mức quercetin tương tự. Các kết quả thu được đã chứng minh rằng màng của các tế bào được thử nghiệm không bị hư hại trong điều kiện như vậy. Boots và cộng sự. [2], nghiên cứu ảnh hưởng của quercetin trên tế bào biểu mô phổi, đã quan sát thấy kết quả tương tự. Do đó, có thể kết luận rằng ở những nồng độ này, quercetin có tác động tích cực đến tế bào, làm tăng khả năng tồn tại của chúng.

Khía cạnh quan trọng thứ hai của cơ chế hoạt động của quercetin liên quan đến đặc tính chống oxy hóa của nó. Để đánh giá tác dụng liên quan của polyphenol được nghiên cứu, các thí nghiệm đã được thực hiện trong đó kiểm tra xem quercetin có đóng vai trò bảo vệ trong các tế bào tiếp xúc với stress oxy hóa hay không. Stress oxy hóa được tạo ra bằng cách đưa H, O2 vào môi trường tế bào.Cistanche để cải thiện trí nhớNhư đã chứng minh trong nghiên cứu này, hydrogen peroxide gây ra tỷ lệ tử vong tế bào đáng kể, được biểu thị bằng cách làm hỏng ty thể.

Khi tế bào SK-N-SH được nuôi cấy trong 3 giờ trong môi trường chứa 3 và 5 mM H2O2, khả năng sống sót của tế bào giảm xuống còn khoảng 44% so với tế bào không được xử lý (xét nghiệm MTT). Các nghiên cứu cho thấy rằng việc xử lý trước 24 giờ đối với các tế bào bằng quercetin làm tăng số lượng tế bào sống so với các tế bào được xử lý bằng H2O2. Suematsu và cộng sự. [13] đã báo cáo các hiệu ứng tương tự.

Chúng tôi cũng đo mức MDA, là một dấu ấn sinh học của stress oxy hóa như là sản phẩm cuối cùng của quá trình peroxy hóa lipid [33]. Tiền xử lý tế bào với nồng độ quercetin cao, tiếp theo là bổ sung hydrogen peroxide, dẫn đến hàm lượng MDA tăng nhẹ so với các tế bào chỉ tiếp xúc với HO. Điều này có thể là do quercetin (ở nồng độ cao hơn) cũng có thể trải qua quá trình hoạt hóa khử oxit và là đối tượng của chu trình oxy hóa khử, tạo ra các loại oxy phản ứng nội bào [34].

Không có thay đổi đáng kể nào về sự phá hủy màng (như được chỉ ra bởi mức LDH không thay đổi) của các tế bào được điều trị bằng quercetin và H2O2 so với trường hợp tế bào chỉ tiếp xúc với stress oxy hóa. Do đó, có thể kết luận rằng mặc dù sự gia tăng quá trình peroxy hóa lipid (ở nồng độ quercetin cao), điều này không đủ đáng kể để phá hủy màng và phá vỡ tính liên tục của chúng.

Các quan sát thu được đối với hệ thống tự nhiên được đối chiếu với những quan sát nhận được đối với hệ thống mô hình nơi có thể kiểm soát chính xác cả nồng độ quercetin và mức độ căng thẳng. Người ta đã kiểm tra xem phần lipid của màng u nguyên bào thần kinh có khả năng chống lại stress oxy hóa như thế nào. Điều kiện căng thẳng được tạo ra bằng cách đưa ôzôn vào đệm, trong đó ôzôn trong môi trường nước trải qua các phản ứng phân hủy tạo thành các gốc oxy hóa, trong số các gốc hydroxyl và các gốc anion superoxide [35]. Hỗn hợp thu được của các loại ôxy phản ứng tương ứng với các loại ôxy tự nhiên xuất hiện trong tế bào, do sự mất cân bằng rối loạn trạng thái ôxy hóa khử [36-38].

Dưới tác động của ứng suất, hình dạng của các đường đẳng nhiệt thay đổi, cho thấy sự giảm đáng kể diện tích trên mỗi phân tử đơn lẻ trong lớp đơn lớp dày đặc. Những thay đổi như vậy diễn ra do quá trình oxy hóa các liên kết không bão hòa trong chuỗi axit béo. Hiệu ứng này tăng lên khi nồng độ ôzôn tăng lên khoảng {{0}}. 3 ppm, và sau đó thông số đẳng nhiệt này vẫn ở cùng mức mặc dù ROS tăng. Điều này có nghĩa là ở nồng độ ôzôn khoảng 0,3 ppm, tất cả các axit béo không bão hòa có trong đơn lớp đều bị oxy hóa (trong mô hình u nguyên bào thần kinh, tổng lượng axit béo không bão hòa là 52%)

Các lớp đơn lớp oxy hóa có độ cứng đáng kể,cistanche trong tiếng Trung Quốcđược biểu diễn bằng giá trị Cs -1 (giá trị của tham số này càng cao thì độ cứng của lớp càng lớn). Khi có mặt của quercetin, ngay cả ở nồng độ thấp （6,25 μM）, các biến đổi của màng tiếp xúc với ozone, như được hình dung bằng những thay đổi trong giá trị Alim, đã giảm đáng kể (Hình 5a), điều này chứng tỏ hoạt tính chống oxy hóa của hợp chất này . Tuy nhiên, điều đáng chú ý là mặc dù quercetin quét các gốc, bảo vệ các axit béo không bão hòa chống lại quá trình oxy hóa, nhưng nó không đảo ngược sự thay đổi độ cứng của màng (Hình 5b).

Do đó, người ta đã chứng minh rằng quercetin thể hiện tác dụng chống oxy hóa, nhưng sự hiện diện đơn thuần của nó giữa các phân tử lipid ảnh hưởng (xác định) các thông số của laver, tức là, mặc dù có sự bảo vệ của chuỗi axit béo chống lại quá trình oxy hóa, độ cứng của màng giảm đáng kể (Cs- Tôi đánh giá thấp hơn khoảng 25 phần trăm so với đối chứng).

Những kết quả này chỉ ra rằng sự thay đổi màng là yếu tố chính gây ra các tác động tế bào do sự hiện diện của quercetin. Tuy nhiên, hậu quả của sự thay đổi này (thay đổi tín hiệu, vận chuyển) khác nhau tùy thuộc vào số lượng phân tử polyphenol, thành phần ban đầu của màng và chức năng của tế bào. Điều này giải thích tại sao, trong các hoàn cảnh khác nhau và trong các nghiên cứu khác nhau, quercetin cho thấy tác dụng bảo vệ, trong khi ở những người khác thì hoàn toàn ngược lại.

Trong tình huống căng thẳng oxy hóa cao, tác dụng chống oxy hóa sẽ giúp tế bào bằng cách bảo vệ các thành phần của nó khỏi bị hư hại. Tuy nhiên, nếu các màng bị biến đổi đáng kể bằng cách định vị hợp chất này trong môi trường của chúng, dẫn đến sự phân bố các đường truyền tín hiệu hoặc đường vận chuyển do độ cứng của màng thay đổi, điều này có thể dẫn đến các tác động bất lợi. Cũng nên nhớ rằng nhiều quá trình trong tế bào diễn ra đồng thời, cả những quá trình liên quan đến màng và những quá trình tạo ra stress oxy hóa. Hiệu quả có thể được quan sát và đo lường bằng cách xác định mức độ của các chỉ số cụ thể luôn là tổng thể. Do đó, có những tình huống mà tác dụng của quercetin được coi là thuận lợi và không thuận lợi.

4. Vật liệu và Phương pháp

4.1 Vật liệu

Thành phần của mô hình phần lipid của màng tế bào u nguyên bào thần kinh được thiết lập dựa trên công trình nghiên cứu của các tác giả của [39-41]. Phospholipid: 1- oleoyl -2- palmitoyl-sn-glycerol -3- phosphocholine; 1- hexacosanoyl-d 4-2- hydroxy-sn-glycerol -3- phosphocholine; 1, 2- dioleoyl-sn-glycerol -3- phosphocholine; L - - phosphatidylethanolamine (Não bộ); sphingomyelin (Não bộ) - (Avanti Polar Lipids Inc., Alabaster, AL, Hoa Kỳ). Cholesterol được loại bỏ (Sigma-Aldrich, Darmstadt, Đức). Tỷ lệ phospholipid trên cholesterol là 79% đến 21%. Tỷ lệ axit béo bão hòa và không bão hòa là 48% đến 52%.

Các dung môi (cloroform, etanol) có độ tinh khiết hóa học-Poch (Gliwice, Ba Lan); nước mới khử ion do HLP 5 Hydrolab (Straszyn, Ba Lan) sản xuất. Môi trường nuôi cấy, huyết thanh và kháng sinh được mua từ CytoGen GmbH. Thuốc thử hóa học được sử dụng trong các thí nghiệm được lấy từ Sigma Aldrich.

4.2 Văn hóa tế bào

Dòng tế bào u nguyên bào thần kinh ở người SK-N-SH (Bộ sưu tập Châu Âu về Nuôi cấy Tế bào Xác thực (ECACC) được nuôi cấy trong 1 0 phần trăm huyết thanh bò thai (FBS) trong Môi trường Đại bàng Biến đổi (DMEM) của Dulbecco, bổ sung 0,01 phần trăm penicillin -streptomycin ở 37 độ trong bầu không khí ẩm, chứa 5% CO2.

4.3. Đo lường khả năng tồn tại của tế bào (Thử nghiệm MTT)

Tế bào được gieo hạt trong đĩa giếng {{0}} với mật độ 1 × 104 tế bào mỗi giếng trong thể tích 0,1 mL. Các tế bào được xử lý trong 24 giờ với các nồng độ quercetin khác nhau (3. 75-200 μM）. Sau thời gian này, 3 mM và 5 mM hydrogen peroxide được thêm vào trong 3 giờ. Do không có sự khác biệt giữa các tác động của Nồng độ HO2 at3 và 5 μM, đối với các nghiên cứu thống kê, chúng được coi là các phương pháp xử lý giống nhau và được mô tả là phương pháp xử lý 3-5 uM H2O2.

Sau đó, 5 0 μL MTT （3- 【4, 5- dimethylthiazol -2- yl】 -2, 5 diphenyl tetrazolium bromide） dung dịch (dung dịch gốc vô trùng của 5 mg / mL) được thêm vào tế bào và ủ trong 2 giờ ở 37 độ trong môi trường 5% CO được làm ẩm. Sau đó, 0,4 mL dimethyl sulfoxit (DMSO) được thêm vào mỗi giếng và giữ trong 10 phút. Sau khi ly tâm, mật độ quang học của phần nổi được đo ở bước sóng 570 nm bằng đầu đọc tấm microlít (BioTek Instruments, VT, USA).

4.4.Mem1brane Damage Test (Thử nghiệm LDH)

Xét nghiệm lactate dehydrogenase (LDH) được sử dụng làm chất đánh dấu toàn bộ màng tế bào.

Các tế bào với số lượng 1 × 1 {{1 0}} * tế bào trên mỗi giếng được gieo vào đĩa 96- giếng và được ủ với sự hiện diện của quercetin （3. 75-200 μM） trong 24 giờ; Sau đó, 3 mM và 5 mM H2O được thêm vào trong 3 giờ. Đối với các ống chứa 0. 5 mL natri pyruvate 0,75 mM và 10 uL NADH （140 μM） （được làm nóng ở 37C trong 10 phút）, 150 μL phần nổi phía trên được thêm vào và ủ trong 30 phút ở 37 độ. Sau đó, 0,5 mL 2, 4- dinitrophenylhydrazine được thêm vào mẫu và sau 1 giờ đo độ hấp thụ ở bước sóng 450 nm.

4.5. Xác định độ Peroxy hóa Lipid (Nồng độ MDA)

Quá trình peroxy hóa lipid màng được ước tính bằng phản ứng axit thiobarbituric (TBA) với malondialdehyde (MDA). Tế bào được gieo hạt trong {{0}} đĩa giếng có chứa quercetin và H, O2 (ở nồng độ và thời gian được mô tả ở trên) với số lượng 1 × 1 0 4 tế bào mỗi giếng với thể tích { {1 0}}. 25 mL. Sau khi xử lý, các mẫu được thu thập và ly tâm (1 000 × &, 5 phút). Vào các viên bột, 0. 5 mL TCA 0,5% đã được thêm vào, xoáy trong 1 phút và lọc qua cách âm trong 5 phút. Sau khi ly tâm ở 10.000 × g trong 10 phút, 0,4 mL phần nổi phía trên được thêm vào 1,25 mL 20% TCA với 0,5% TBA và được làm nóng trong một khối nhiệt khô (100 độ) trong 30 phút. Sau khi làm nguội, độ hấp thụ được đo ở bước sóng 532 nm sử dụng hệ số tắt phân tử của MDA bằng 155 M -1 cm -1.

4.6 Màng mô hình

Ozon hóa đệm. Bộ đệm phốt phát (0. 01 M, pH 7,4) đã được bão hòa với ôzôn được tạo ra bởi máy tạo ôzôn FM 500 (Grekos, Ba Lan). Nồng độ ôzôn trong dung dịch đệm được xác định theo Bader và Hoigne [42].

Áp suất bề mặt đẳng nhiệt.dương vật cistanche phát triểnMáng Langmuir (KSV, Phần Lan) được sử dụng để đăng ký đẳng nhiệt áp suất bề mặt ở tốc độ nén không đổi tương ứng với tốc độ rào cản 5 mm / phút. Đơn lớp lipid được hình thành bằng cách trải một lượng xác định dung dịch lipid chloroform ở nồng độ 1 mg / mL trên pha con bao gồm dung dịch đệm nước 0. 01 M đệm phosphat, pH 7,4 có hoặc không có quercetin và có hoặc không có ozon. Lực căng bề mặt được đo bằng tấm Pt-Wilhelmy. Các thí nghiệm được thực hiện ở 25 độ ± 1 độ.

4.7. Phân tích thống kê

Ba đến sáu phân tích độc lập được thực hiện cho mỗi biến thể được thử nghiệm và được tính trung bình (± SD). Sự khác biệt đáng kể so với đối chứng được ước tính bằng cách khai thác quy trình SAS ANOVA. Phân tích thống kê được thực hiện bằng thử nghiệm nhiều phạm vi của Duncan, lấy p<0.05. statistical="" tests="" were="" carried="" out="" using="" statistica="" 13.3(cracow,="">

Đóng góp của tác giả: Khái niệm hóa, BK, BD và ER-S.methodology, BKBD; phần mềm, BK, BDvalidation, BK, BD, ER-S., ABwriting — chuẩn bị bản nháp ban đầu BK, BD, ER-S., viết — xem xét và chỉnh sửa, BK, BD, ER-S., ABvisualization, BK, BDsupervision, BK, BD, ER-S., ABTất cả các tác giả đã đọc và đồng ý với phiên bản xuất bản của bản thảo.

Kinh phí:Nghiên cứu này không nhận được tài trợ từ bên ngoài.

Tuyên bố của Ban Đánh giá Thể chế: Không áp dụng.

Tuyên bố đồng ý được thông báo: Không áp dụng.

Tuyên bố về tính khả dụng của dữ liệu: Dữ liệu được chứa trong bài viết. Xung đột lợi ích: Các tác giả tuyên bố không có xung đột lợi ích.

Bài viết này được trích từ Molecules 2021, 26, 4945. https://doi.org/10.3390/molecules26164945 https://www.mdpi.com/journal/molecules