Vắc-xin MRNA tạo ra phản ứng miễn dịch chống ung thư phụ thuộc vào STING

trừu tượng

Vắc-xin RNA có công thức lipid đã được sử dụng rộng rãi để phòng ngừa và điều trị bệnh, tuy nhiên cơ chế hoạt động và các thành phần riêng lẻ góp phần vào các hoạt động đó vẫn chưa được mô tả. Ở đây, chúng tôi chứng minh rằng vắc-xin điều trị ung thư bao gồm lõi protamine/mRNA và vỏ lipid có hiệu quả cao trong việc thúc đẩy phản ứng tế bào T CD8+ gây độc tế bào và làm trung gian miễn dịch chống khối u. Về mặt cơ học, cả lõi mRNA và vỏ lipid đều cần thiết để kích thích hoàn toàn sự biểu hiện của interferon loại I và các cytokine gây viêm trong tế bào đuôi gai. Việc kích thích biểu hiện interferon-b hoàn toàn phụ thuộc vào STING và hoạt động chống ung thư từ vắc xin mRNA bị tổn hại đáng kể ở những con chuột có gen Sting bị khiếm khuyết. Do đó, vắc xin mRNA tạo ra khả năng miễn dịch chống ung thư phụ thuộc vào STING.

lợi ích cistanche cho nam giới - tăng cường hệ thống miễn dịch

1. Giới thiệu

Sự phát triển nhanh chóng và ứng dụng vắc xin mRNA trên toàn thế giới để ngăn ngừa nhiễm SARS-CoV{1}} đã chứng minh sức mạnh của thuốc dựa trên mRNA trong chăm sóc sức khỏe1,2. Do trọng lượng phân tử lớn và điện tích âm, các phân tử mRNA cần được đóng gói vào phương tiện vận chuyển để xâm nhập vào tế bào động vật có vú một cách hiệu quả. Việc đóng gói vào các phương tiện phân phối có kích thước nanomet cũng có lợi ích trong việc bảo vệ các phân tử mRNA khỏi sự phân hủy của enzyme. Nhiều nền tảng phân phối đã được phát triển để phù hợp với mục đích, chẳng hạn như hạt nano lipid4, lipo polyplex (LPP)5, liposome-protamine-RNA (LPR)6, RNA lipoplex (RNA-LPX)7 và hạt vắc xin giống virus (VLVP) )số 8. Mặc dù mỗi nền tảng có cấu trúc và thành phần riêng biệt, nhưng hầu hết các phương tiện đều chứa một phân tử lipid ion tạo điều kiện thuận lợi cho việc đóng gói mRNA và thoát ra khỏi các phân tử mRNA khỏi nội nhũ. Với sự thành công của vắc xin dự phòng, người ta nhận thức chung rằng liệu pháp mRNA có thể được sử dụng để điều trị có lẽ hầu hết nếu không phải tất cả các loại bệnh9e12. Thật vậy, vắc xin điều trị ung thư dựa trên mRNA đã được nghiên cứu trong nhiều năm13,14. Những tiến bộ gần đây trong các thử nghiệm lâm sàng cũng đã chứng minh tiềm năng ứng dụng của chúng ở một số bệnh nhân ung thư được chọn15e17. Không giống như vắc xin ung thư peptide được điều chế bằng các phân tử bổ trợ18e20, các hạt vắc xin mRNA cũng có thể đóng vai trò là chất tự bổ trợ21.

Ví dụ, vắc xin ung thư dựa trên mRNA hai thành phần chứa mRNA tự do và phức hợp protamine cũng có thể kích hoạt tín hiệu thụ thể giống thu phí 7 (TLR7)22. Tuy nhiên, với mối lo ngại ngày càng tăng về độc tính miễn dịch bẩm sinh cấp tính từ mRNA trần, hầu hết các nhà nghiên cứu và công ty đang sử dụng RNA biến đổi để tránh sự nhận biết bẩm sinh của TLR23. Do đó, các thành phần lipid đang đóng một vai trò quan trọng trong việc tăng cường hoạt động bổ trợ trong hạt vắc xin mRNA, tốt nhất là bằng cách kích hoạt tín hiệu không phải TLR. Một nghiên cứu gần đây về RNA-LPX tích điện âm, có công thức lipid được cấu thành từ liposome 1,2- di-octadecenyl-3-trimethylammonium (DOTMA, một lipid cation)/ dioleoylphosphatidylanolamine (DOPE, một lipid hỗ trợ) đã tiết lộ kích hoạt trục đối kháng thụ thể interleukin 1 (IL1)-interleukin 1 (IL{18}}ra) trong việc điều hòa sự bài tiết các cytokine tiền viêm và vai trò thiết yếu của việc kích hoạt con đường hồng cầu hai bước trong bạch cầu đơn nhân24. Điều thú vị là, một nghiên cứu khác gần đây về BNT162b2 dựa trên LNP được điều chế bằng ALC-0315 (một loại lipid bị ion hóa), 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC, một loại lipid hỗ trợ) , polyethylene glycol-2000-N, N-di tetradecyl acetamide (PEG2000-DTA) và cholesterol cho thấy vai trò chính trong việc kích hoạt tín hiệu MDA5 phụ thuộc interferon loại I, chứ không phải TLR hoặc hồng cầu, trong việc kích thích cả hai khả năng miễn dịch bẩm sinh và thích nghi của vắc xin ngừa COVID-1925. Những nghiên cứu này chỉ ra khả năng các nền tảng phân phối bao gồm các phân tử lipid biến đổi có thể dựa vào các đường dẫn truyền tín hiệu khác nhau cho hoạt động của vắc xin. Vì vậy, điều quan trọng là phải nghiên cứu đầy đủ chức năng của các phân tử quan trọng và sự kết hợp của chúng để cải thiện hơn nữa phương pháp điều trị bằng mRNA.

Trong nghiên cứu hiện tại, chúng tôi đã thiết lập các thí nghiệm để phân tích vai trò chức năng của từng thành phần trong vắc xin điều trị ung thư. Hạt vắc xin mRNA (MVP) bao gồm lõi protamine/mRNA được bọc trong lớp vỏ lipid bao gồm lipid cation, lipid trợ giúp, lipid pegylat hóa và cholesterol (Hình 1A). Người ta đã chứng minh rằng việc đưa lipid tích điện vào có thể tạo điều kiện thuận lợi cho việc vận chuyển RNA mục tiêu26 và dioleoylethyl phosphatidylcholine (EDOPC) và dioleoyl-3- trimethylammonium propane (DOTAP) là hai trong số các lipid cation đã được thử nghiệm cho mục đích này5,27. Chúng tôi đã kiểm tra sự kích thích biểu hiện của interferon-b (IFN-b), IL-1b và yếu tố hoại tử khối u-a (TNF-a) bằng lõi mRNA, phương tiện không có mRNA và toàn bộ MVP, và liên hệ các hoạt động như vậy với TLR7, tín hiệu kháng virus của ty thể (MAVS, còn được gọi là IPS{12}}), chất kích thích gen IFN (STING) và bộ điều hợp chứa miền TIR tạo ra tín hiệu IFN-b (TRIF). Sau đó, chúng tôi đã nghiên cứu vai trò của protamine trong lõi và lipid cation trong vỏ trong việc kích thích biểu hiện IFN-b và TNF-a. Cuối cùng, chúng tôi so sánh phản ứng miễn dịch chống ung thư từ MVP ở chuột hoang dã và chuột bị loại bỏ gen.

Lợi ích của cistanche tubulosa-Chống ung thư

2. Vật liệu và phương pháp

2.1. Nguyên vật liệu

1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine (EDOPC) (890704), 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphatidyl-etanolamine (DOPE) (850725 ), 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoetanolamine-N- [amino(polyethylene glycol)-2000 (DSPE-PEG2k) (880128), 1,2- dioleoyl-3-trimethylammonium-propane (DOTAP) (890890), 1,2- dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) (850375) được mua từ Avanti Polar Lipids, Inc. ( Birmingham, AL, Hoa Kỳ). Cholesterol (C8667) được lấy từ Sigma-Aldrich (Saint Louis, MO, USA). Thuốc thử được hòa tan trong etanol ở nồng độ 2 mg/mL đối với DSPE-PEG2k, 10 mg/mL đối với cholesterol và DOPC, và 20 mg/mL đối với EDOPC, DOPE và DOTAP tương ứng. Protamine sulfate (P4020) được lấy từ Sigma Aldrich. Các phân tử mRNA mã hóa ovalbumin (OVA-mRNA) (L-7210), eGFP (eGFP mRNA) (L-7201) và luciferase (Luc-mRNA) (L-7204) được mua từ Công nghệ sinh học TriLink (San Diego, CA, Hoa Kỳ). Nước không có RNase (W0805-010) được lấy từ GeneDEPOT (Baker, TX, USA). Chất chủ vận TLR7 imiquimod (tlrimq) và chất chủ vận Sting 20 30 - cGAMP (tlrl-nacga23) là sản phẩm của Invivogen (San Diego, CA, USA). Bộ xét nghiệm Lipofectamine 2000 (11668019) và Quant-iT™ RiboGreen™ RNA (R11490) đã được mua từ Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA). Chuột tái tổ hợp GM-CSF (554586) được mua từ BD Bioscatics (San Diego, CA, USA). Cocktail ức chế vận chuyển protein 500 (00-4980-93) là một sản phẩm của Invitrogen. Bộ Cytofix/Cytoperm (AB_2869010) được mua từ BD Bioscatics. Bộ cách ly tế bào T của chuột EasySep™ (19851) được lấy từ STEMCELL Technologies, Inc. (Vancouver, BC, CAN). Các kháng thể sau được lấy từ BioLegend (San Diego, CA, USA): anti-CD80-PE-Cy7 (104734), anti-CD86-FITC (105006), anti-CD11b-APC- Cy7 (101226), chống CD8-BV510 (100752), chống CD44-APC (103012), chống CD69-APC (104514) và chống H{{89 }}Kb (SIINFEKL)-PE (141604), anti-CD64- PE-Cy7 (139314), anti-B220-APC (103212), anti-MHCII-BV711 (107643) và chống CD{105}}PE (121406). Thuốc chống CD40-FITC (553723), thuốc chống LY6C-AF700 (557979) và thuốc chống IFN-g-PE (554412) là của BD Biosciences. OVA257e264-MHCI dextramerPE (JD2163) được mua từ ImmuDex (Fairfax, VA, USA). Bộ dụng cụ ELISA cho IL{122}}b (EM2IL1B) và TNF-a (BMS607-3) được mua từ Invitrogen và bộ dụng cụ ELISA cho CCL5 (DY478) và IFN-b (DY8234) được lấy từ Hệ thống R&D , Inc. (Minneapolis, MN, Hoa Kỳ). Các kháng thể để phân tích Western blot bao gồm kháng MAVS (4983), kháng STING (13647), kháng TBK1 (3504), kháng phospho-TBK1 (5483), kháng b-actin (4970) và kháng GAPDH (5174) được mua từ Cell Signaling Technology, Inc. (Danvers, MA, USA).

Hình 1 Chuẩn bị và mô tả đặc tính của các hạt mRNA. (A) Sơ đồ chuẩn bị hạt vắc xin. (B) Điện di trên gel agarose cho thấy các phân tử mRNA được giữ lại trong giếng nạp mẫu trong các mẫu được chuẩn bị bằng mRNA/protamine theo tỷ lệ 1:1 đến 1:2. (CeF) Đặc tính của các hạt vắc xin mRNA (MVP) dựa trên tỷ lệ đóng gói, chỉ số đa phân tán, thế zeta và kích thước. (G) Ảnh TEM đại diện của các hạt MVP2, thanh tỷ lệ Z 50 nm. (H) Tỷ lệ biểu hiện eGFP sau khi các tế bào DC2.4 được xử lý bằng eGFP-MVP trong 16 giờ. (I) Hình ảnh huỳnh quang của tế bào DC2.4 biểu hiện eGFP, thanh tỷ lệ Z 400 mm. ( J ) Phân tích định lượng về phát quang sinh học trong BMDC được xử lý bằng MVP được gói gọn bằng mRNA mã hóa luciferase trong 16 giờ. (K) Những thay đổi về khả năng tồn tại của BMDC được xử lý bằng PBS, phương tiện không có mRNA, lõi mRNA/protamine hoặc MVP2 được đóng gói bằng mRNA. Nồng độ điều trị tương đương với mRNA. Dữ liệu được trình bày dưới dạng SEM trung bình (n Z 3). * P < 0,05; ** P < 0,01.

2.2. Dòng tế bào và nuôi cấy tế bào

Dòng tế bào đuôi gai chuột DC2.4 được lấy từ ATCC (Manassas, VA, USA) và được nuôi cấy trong RPMI-1640 chứa 10% huyết thanh bò bào thai (FBS) và 1% penicillin-streptomycin. Dòng tế bào u ác tính ở chuột B16-OVA được mua lại từ Tiến sĩ Kenneth Rock, Viện Ung thư Dana-Farber (Boston, MA, Hoa Kỳ). Tế bào B{8}}OVA được nuôi cấy trong DMEM bổ sung 10% FBS và 1% penicillin-streptomycin. Dòng tế bào ung thư biểu mô đại tràng MC38 ở chuột được mua từ ATCC. Các tế bào được thiết kế với biểu hiện OVA và được nuôi cấy trong DMEM với 10% FBS và 1% penicillin-streptomycin. Nuôi cấy tế bào được duy trì ở 37 C với 5% CO2.

cistanche tubulosa-cải thiện hệ thống miễn dịch

2.3. chuẩn bị hạt vắc xin mRNA

Tất cả các hạt vắc xin mRNA đã được điều chế bằng thiết bị vi lỏng NanoAssemblr Benchtop của Precision Nanosystems, Inc., (Vancouver, BC, CAN) bằng cách trộn pha hữu cơ và pha nước. Để chuẩn bị pha hữu cơ, EDOPC (20 mg/mL), DOPE (20 mg/mL), cholesterol (10 mg/mL) và bis-DSPE-PEG2k (2 mg/mL) được hòa tan trong etanol và trộn ở 34 :30:35:1 Tỷ lệ M với tốc độ dòng 9 mL/phút. Để chuẩn bị lõi mRNA pha nước, mRNA được trộn với protamine sulfate với tỷ lệ 1:1 (w/w) trong thiết bị vi lỏng ở tốc độ dòng 9 mL/phút. Sau 20 phút ủ ở 20 C, lõi mRNA pha nước được trộn với pha hữu cơ để tạo ra các hạt vắc xin mRNA. Sau 20 phút, huyền phù hạt vắc xin được chuyển vào bộ lọc siêu ly tâm Amicon (MWCO 30 kDa) và 9-thể tích nước cấp phân tử được thêm vào để pha loãng nồng độ etanol từ 25% đến 2,5%. Sau đó, huyền phù hạt được cô đặc bằng cách ly tâm ở 2000 g (Multifuge X4, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) ở 4 C. Một thể tích tương đương 2 PBS đã được thêm vào sản phẩm cô đặc để điều chỉnh áp suất thẩm thấu.

2.4. Xét nghiệm làm chậm gel

Lõi mRNA/protamine lần đầu tiên được phân tích bằng phương pháp làm chậm gel. Tóm lại, lõi mRNA/protamine chứa 0,5 mg mRNA được nạp vào giếng gel agarose 1% trong dung dịch 1 TBE và điện di được thực hiện ở điện áp 120 V trong 30 phút (PowerPac™, BioRad Co., Ltd., Hercules, CA). Các dải RNA được nhuộm bằng Gelred (Biotium, Hayward, CA) và được phát hiện bằng hệ thống GelDoc (Gel Doc XRþ, BioRad Co., Ltd.).

2.5. Đặc tính của hạt vắc xin mRNA

Sự phân bố kích thước và điện thế zeta được đo bằng Zetasizer tán xạ ánh sáng động (Zetasizer Nano, Malvern Pananalytical, Inc., Westborough, MA, USA). Tốc độ đóng gói được xác định bằng cách sử dụng bộ xét nghiệm Quant-iT™ RiboGreen™ RNA. Tóm lại, mẫu hạt vắc xin chứa 0,5 mg mRNA đã được pha loãng với dung dịch đệm TriseEDTA (10 mmol/L TriseHCl, 1 mmol/L EDTA, pH 7,5) có hoặc không có 2% Triton-X100 trong { {10}}đĩa giếng. Sau 10 phút ủ ở 37 C, RiboGreen được thêm vào từng giếng và đo cường độ huỳnh quang. Hiệu suất đóng gói được tính toán như trong biểu thức. (1): Kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM) của các hạt vắc xin được thực hiện theo quy trình được mô tả trước đó9.

2.6. Động vật

Tất cả các hoạt động của động vật đã được phê duyệt bởi Ủy ban Chăm sóc và Sử dụng Động vật của Bệnh viện Giám lý Houston (số giao thức AUP06200042). Chuột được nuôi trong môi trường đáp ứng đầy đủ các tiêu chuẩn quy định của Viện Y tế Quốc gia và Hiệp hội Chăm sóc Động vật Phòng thí nghiệm Hoa Kỳ. Chuột C57BL/6J hoang dã và chuột biến đổi gen bao gồm chuột Tlr7/, Sting/, Mavs/, và Trif/ được mua từ Phòng thí nghiệm Jackson.

2.7. Tạo ra các tế bào đuôi gai có nguồn gốc từ tủy xương chuột (BMDC)

Các tế bào tủy xương được thải ra khỏi xương đùi và xương chày với RPMI 1640 hoàn chỉnh. Các tế bào hồng cầu được ly giải bằng dung dịch đệm ly giải ACK và các tế bào tủy xương chưa trưởng thành được nuôi cấy trong RPMI 1640 bổ sung GM-CSF chuột tái tổ hợp 20 ng/mL trong 10 ngày ở 37 C với 5% CO2. Môi trường nuôi cấy tế bào được làm mới vào Ngày 3, 6 và 8, và các tế bào đuôi gai không bám dính được thu thập vào Ngày 10.

2.8. Đo lường cytokine và chemokine

BMDC được gieo vào đĩa 24-giếng với mật độ 5  105 tế bào/giếng. Sau 1 giờ lắng, các tế bào được xử lý bằng các hạt vắc xin hoặc đối chứng 1 mg/mL imiquimod, 20 mg/mL 20 30 -cGAMP, (tương đương 1 mg/mL mRNA). Môi trường nuôi cấy tế bào được thu thập 24 giờ sau đó và nồng độ TNF-a, CCL5, IFN-b và IL{11}}b được đo bằng bộ xét nghiệm miễn dịch hấp thụ liên kết enzyme (ELISA) theo quy trình do nhà sản xuất đề xuất.

cistanche thực vật tăng cường hệ thống miễn dịch

2.9. Phân tích về sự chuyển đổi DC, sự trưởng thành và kích thích DC

Để phân tích hiệu suất truyền DC trong ống nghiệm, các tế bào DC2.4 được gieo hạt ở 2.5 105 tế bào/giếng trong một đĩa giếng 24-. Các tế bào được xử lý bằng các hạt bao bọc mRNA mã hóa eGFP hoặc luciferase ở nồng độ cuối cùng là 1 mg mRNA/mL. Các tế bào được thu hoạch 24 giờ sau đó, rửa bằng 2% FBS trong dung dịch PBS và sau đó được treo lại trong cùng dung dịch trước khi chúng được áp dụng để phân tích tế bào học dòng chảy bằng máy đo tế bào dòng chảy BD LSR II (LSR II, BD Bioscatics, San Jose, CA) . Để đo sự trưởng thành của DC và sự trình diện kháng nguyên trong ống nghiệm, BMDC được gieo hạt ở 2.5  105 tế bào/giếng trong một đĩa giếng 24-và được xử lý với 1 mg/mL OVA-MVP trong 24 giờ. BMDC được nhuộm trong 30 phút với các kháng thể đặc hiệu với CD11c, MHC I, MHC II, CD40, CD80 và CD86 để trưởng thành DC và kháng H-2Kb (SIINFEKL) để trình diện kháng nguyên. Để xác định hiệu lực kích thích in vivo, chuột C57BL/6J đã được tiêm vắc-xin một lần với 10 mg OVA-MVP cho mỗi con chuột trong bàn chân và việc hút hết LN vùng khoeo đã được thu hoạch 24, 48 và các dấu hiệu bề mặt tế bào sau: CD11c, MHC I, CD11b, B220 , LY6C, CD64, CD8, CD103, CD86.

2.10. Phân tích tế bào học dòng chảy về kích hoạt và tăng sinh tế bào T

Để đo kích hoạt tế bào T in vivo, chuột được tiêm vắc-xin một lần với 10 mg OVA-MVP và LN ở vùng khoeo được phân lập sau 24 hoặc 48 giờ. Các tế bào T được nhuộm bằng các kháng thể sau: CD45, CD3, CD4, CD8 và CD69. Để phát hiện tế bào T đặc hiệu với kháng nguyên, các khối u, lá lách và hạch bạch huyết vùng khoeo được thu hoạch 5 ngày sau lần tiêm chủng thứ hai. Các mô được xử lý để tạo ra huyền phù tế bào đơn và các tế bào được nhuộm bằng kháng thể đặc hiệu tế bào T và OVA257e264-MHCI dextramer theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Để đo mức IFN-g nội bào, 2  106 tế bào lách hoặc tế bào phân lập từ LN khoeo và khối u được kích thích bằng peptide 10 mg/mL OVA257e264 trong môi trường RPMI 1640 hoàn chỉnh được bổ sung 55 mmol/L b-mercaptoetanol và 1 chất ức chế vận chuyển protein cocktail trong 18 giờ. Các tế bào được thu hoạch và nhuộm màu bằng kháng thể đặc hiệu tế bào T. Sau khi cố định và thẩm thấu bằng bộ Cytofix/Cytoperm, các tế bào được nhuộm bằng kháng thể kháng IFN-g và áp dụng để phân tích trên máy đo tế bào dòng chảy BD LSR II (BD Bioscatics). Để đo sự tăng sinh của tế bào T, các tế bào T được phân lập từ lá lách của chuột biến đổi gen OT-I bằng cách sử dụng bộ phân lập tế bào T của chuột. Chúng được nhuộm bằng 1 mmol/L CFSE trong RPMI 1640 chứa 200 mg/mL BSA trong 10 phút ở 37 C. Các tế bào T được dán nhãn CFSE được rửa hai lần với 5 thể tích RPMI 1640 hoàn chỉnh lạnh. Trong khi đó, BMDC trưởng thành được xử lý bằng 2 mg/mL MVP đóng gói OVA mRNA trong 24 giờ trước khi phân lập tế bào T. Khi các tế bào T đã sẵn sàng, BMDC và tế bào T được nuôi cấy đồng thời với tỷ lệ 1:5 (DC: T) trong 72 giờ. Các tế bào được thu thập và nhuộm màu bằng kháng thể bề mặt dành cho tế bào T, sự tăng sinh được kiểm tra bằng máy đo tế bào dòng chảy BD LSR II (BD Bioscatics) và được phân tích. Tất cả các kết quả tế bào học dòng chảy được phân tích bằng phần mềm FlowJo v10 (Ashland, OH, USA).

2.11. Theo dõi biểu hiện protein ở chuột sống

Chuột BALB/c được điều trị bằng cách tiêm vào bàn chân với 10 mg MVP được đóng gói bởi Luc mRNA. Chúng được tiêm trong màng bụng 30 mg RediJect D-luciferin cho mỗi con chuột 6, 12, 24 hoặc 48 giờ sau đó và đo độ phát quang sinh học bằng hệ thống hình ảnh Xenogen IVIS-200 (Caliper Life Sciences, Inc., Hopkinton, MA, Hoa Kỳ).

2.12. Xét nghiệm ELISpot

Các tấm lọc IP được rửa trước bằng 50 mL etanol 35% và rửa kỹ 3 lần bằng PBS trước khi etanol bay hơi. Các tấm này sau đó được phủ kháng thể bắt giữ kháng IFN-g ở 4 C qua đêm. Các đĩa được chặn bằng môi trường hoàn chỉnh RPMI 1640 chứa 55 mmol/L b-mercaptoetanol trong 2 giờ ở 37 C. Các tế bào (1  105 tế bào lách, 1  105 tế bào từ LN khoeo) được gieo vào từng giếng và được kích thích trong 36 giờ với peptide 10 mg/mL OVA257e264. Môi trường bị loại bỏ và tế bào được rửa 4 lần bằng PBST (PBS chứa 0,05% Tween 20) và hai lần bằng PBS. Sau lần rửa cuối cùng, kháng thể phát hiện kháng IFN-g được thêm vào và ủ trong 2 giờ ở nhiệt độ phòng trong bóng tối. Các đĩa được rửa 4 lần bằng PBST và hai lần bằng PBS, đồng thời thêm avidin-HRP vào và ủ thêm 45 phút nữa ở nhiệt độ phòng trong bóng tối. Cuối cùng, các đĩa được rửa lại bằng PBST và PBS như mô tả ở trên, và 50 mL chất nền AEC được bôi lên và theo dõi phản ứng tại chỗ. Khi các vết xuất hiện rõ ràng, phản ứng được dừng lại bằng cách loại bỏ chất nền AEC và rửa nó bằng nước cất hai lần 5 lần. Sau khi để khô qua đêm, các đĩa được quét và phân tích bằng Máy phân tích ELISpot CTL ImmunoSpot SeriesS5 Versa (S5Versa-02- 9038, CTL Inc., Cleveland, OH, USA).

2.13. Phân tích Western blot

BMDC có nguồn gốc từ chuột hoang dã, Mavs KO hoặc Sting KO đã được thu thập và các tế bào được lọc trong dung dịch đệm ly giải tế bào RIPA có bổ sung chất ức chế protease và phosphatase. Nồng độ protein trong dịch ly giải tế bào được đo bằng bộ xét nghiệm protein BCA. Các mẫu protein được phân tách bằng điện di trên gel natri dodecyl sulfate-polyacrylamide (SDS-PAGE) và chuyển sang màng polyvinylidene Difluoride (PVDF). Biểu hiện MAVS và STING được phát hiện sau khi màng được ủ với kháng thể kháng MAVS hoặc kháng STING ở độ pha loãng 1:2000, sau đó là phương pháp dò tìm miễn dịch bằng SuperSignal West Pico và Chất nền phát quang hóa học Femto. Để đo kích hoạt con đường STING, BMDC có nguồn gốc từ chuột hoang dã đã được xử lý bằng MVP được đóng gói bằng phương tiện hoặc OVA mRNA ở nồng độ được chỉ định trong 2 giờ. Các tế bào được ly giải và tiến hành phân tích Western blot bằng kháng thể kháng TBK1 và kháng phospho-TBK1 ở độ pha loãng 1:2000.

2.14. Xét nghiệm chống ung thư

Các mô hình khối u ở chuột được tạo ra bằng cách cấy các tế bào 2  105 tế bào B16-tế bào u ác tính OVA hoặc tế bào 5  105 MC38-OVA trên mỗi con chuột dưới da vào sườn trái của 6 đến {{5} }chuột C57BL/6J cái một tuần tuổi. Chuột được phân ngẫu nhiên vào các nhóm điều trị và được điều trị hai lần, cách nhau 7 ngày với 10 mg OVA MVP hoặc đối chứng ở bàn chân. Sự phát triển của khối u được theo dõi 2 ngày một lần. Khối lượng khối u được tính theo phương trình. (2):

Chuột đã được tiêu hủy 5 ngày sau lần tiêm phòng thứ hai và trọng lượng của các mô khối u đã được ghi lại.

2.15. Phân tích thống kê

Tất cả các kết quả được trình bày dưới dạng SEM trung bình. Số liệu thống kê được đánh giá bằng thử nghiệm ANOVA một chiều sử dụng hiệu chỉnh Tukey để so sánh nhiều nhóm và thử nghiệm t hai đuôi không ghép đôi để so sánh hai nhóm. Dữ liệu được phân tích bằng phần mềm GraphPad Prism v8.0.2. P < 0.{{10}}5 được coi là có ý nghĩa thống kê (*P < 0.05; **P < 0,01; ***P < 0,005; **** P < 0,001).

3. Kết quả

3.1. MVP làm trung gian biểu hiện mRNA mạnh mẽ trong các tế bào đuôi gai (DC)

Chúng tôi đã chuẩn bị các hạt vắc xin vỏ lõi theo phương pháp vi lỏng hai bước (Hình 1A) và đánh giá một cách có hệ thống các thành phần riêng lẻ trong hạt nano để lắp ráp hạt vắc xin có độ ổn định cao, khả năng hấp thu tế bào cao và khả năng biểu hiện cao ở DC. Điện di trên gel cho thấy lõi mRNA ổn định có thể được hình thành khi tỷ lệ mRNA-protamine ở mức 1 hoặc thấp hơn (Hình 1 B). Sử dụng mRNA mã hóa eGFP làm chất đánh dấu thay thế, chúng tôi nhận thấy rằng chế phẩm lipid ở tỷ lệ mol 34% EDOPC/30% DOPE/35% cholesterol/1% DSPEPEG2k mang lại tốc độ đóng gói lý tưởng và hiệu suất biểu hiện tốt nhất (Bảng 1, Thông tin hỗ trợ Hình S1AeS1D). Việc thay đổi tỷ lệ điện tích không làm thay đổi đáng kể tốc độ đóng gói, chỉ số đa phân tán hoặc điện tích bề mặt của các hạt (Bảng 2, Hình 1CeE); tuy nhiên, kích thước của các hạt thu được có đường kính từ 70 đến 80 nm khi tỷ lệ nằm trong khoảng từ 12 đến 16, so với đường kính 120-130 nm khi tỷ lệ này nằm ngoài phạm vi (Hình 1F và G). Biểu hiện tốt nhất được phát hiện trong các tế bào DC2.4 được xử lý bằng MVP2 có tỷ lệ điện tích là 12 (Hình 1H và I). Một mô hình tương tự đã được quan sát thấy khi các hạt được điều chế bằng luciferase mã hóa mRNA và phát hiện biểu hiện phụ thuộc vào liều (Hình 1J). Các hạt được bao bọc bởi mRNA đã thể hiện tính ổn định mong muốn vì chúng không bị mất hoạt động sau khi đông khô hoặc đóng băng (Hình S1E và S1F). Ngoài ra, không có độc tính tế bào sau khi các tế bào đuôi gai có nguồn gốc từ tủy xương (BMDC) được xử lý chỉ bằng lõi mRNA, một hạt phương tiện được điều chế không có phân tử mRNA hoặc MVP2 chứa mRNA (Hình 1K). Do đó, MVP2 thể hiện tiềm năng biểu hiện tốt nhất. Nó được sử dụng cho tất cả các thử nghiệm tiếp theo trong nghiên cứu và được gắn nhãn là MVP trong phần còn lại của văn bản. Các hạt MVP có thể cung cấp các phân tử mRNA in vivo một cách hiệu quả và không có độc tính nào có thể phát hiện được từ MVP được bao bọc bởi mRNA dựa trên sự thay đổi trọng lượng cơ thể (Hình S1GeS1I).

3.2. MVP tạo ra sự trình diện kháng nguyên và kích hoạt tế bào T một cách hiệu quả trong ống nghiệm và in vivo

Chúng tôi đã chuẩn bị lõi mRNA, phương tiện không có mRNA và MVP đóng gói OVA mRNA và áp dụng chúng để kiểm tra sự trưởng thành DC và trình bày kháng nguyên (Hình 2A). BMDC được xử lý bằng MVP biểu hiện sự biểu hiện quá mức phụ thuộc vào liều lượng của các dấu hiệu trưởng thành DC bao gồm CD40, CD80 và CD86 (Hình 2BeD). Việc điều trị bằng phương tiện không có mRNA hoặc MVP được bao bọc bởi mRNA đã kích hoạt biểu hiện quá mức MHC I (Hình 2E), cho thấy rằng hiệu ứng này có liên quan đến phương tiện chứ không phải phức hợp mRNA. Ngoài ra, việc xử lý MVP dẫn đến hiển thị bề mặt tế bào của phức hợp kháng nguyên OVA257e264 epitope-MHC I (SIINFEKL-MHC I) được phát hiện bằng kháng thể kháng SIINFEKL-MHCI (Hình 2F), chứng tỏ quá trình xử lý và trình bày kháng nguyên hiệu quả của BMDC . Hơn nữa, việc ủ đồng thời các BMDC được xử lý MVP với B3Z, một dòng tế bào T CD8þ nhận biết cụ thể epitope OVA257e264 hoặc các tế bào T được phân lập từ lá lách của chuột OT-I biểu hiện tế bào T đặc hiệu OVA257e{25}} thụ thể, kích hoạt sự bài tiết IL{26}}, một kết quả không được quan sát thấy ở các tế bào T được ủ cùng với DC được điều trị chỉ bằng phương tiện hoặc chỉ dùng lõi mRNA/protamine (Hình 2G). Phân tích tế bào học dòng chảy đã phát hiện 32,5% tế bào T CD8þ tăng sinh sau khi ủ cùng với MVP (Hình 2H và I). Các hạt MVP bao bọc OVA mRNA cũng được áp dụng để điều trị chuột bằng cách tiêm trong da. Kiểm tra các tế bào trong các hạch bạch huyết dẫn lưu cho thấy sự gia tăng ổn định biểu hiện CD86 ở cả DC cổ điển (CD8þ DC, CD11bþ DC, CD103þ DC) và DC plasmacytoid (pDC) trong 48 giờ đầu tiên, cho thấy sự kích thích của DC trưởng thành (Hình 2J). Việc điều trị cũng thúc đẩy sự phong phú của tế bào T CD8þ trong các hạch bạch huyết, với sự gia tăng đáng kể về số lượng tế bào T CD69þCD8þ (Hình 2K và L), cho thấy sự kích hoạt tế bào T bằng phương pháp điều trị. Để xác định kích hoạt tế bào T, chúng tôi đã thu thập các tế bào trong các hạch bạch huyết đang thoát nước 3, 5 hoặc 7 ngày sau khi điều trị MVP và thực hiện phân tích ELISpot sau khi các tế bào được thử thách với peptide kháng nguyên OVA257e264 (Thông tin hỗ trợ Hình S2). Việc điều trị MVP đã tạo ra bước nhảy vọt về số lượng tế bào tiết IFN-g trong thời gian đó, với hoạt động cao nhất vào Ngày thứ 5 (Hình 2M). Những kết quả này cho thấy sự kích thích DC mạnh mẽ, sự trình diện kháng nguyên và hoạt hóa tế bào T sau khi điều trị bằng MVP.

Bảng 1 Thành phần của các hạt nano được bao bọc bằng mRNA mã hóa eGFP.

ban 2Thành phần lipid và tỷ lệ điện tích của MVPvật rất nhỏ.

3.3. MVP gợi ra khả năng miễn dịch chống khối u mạnh mẽ trong các mô hình chuột có khối u đại trực tràng và khối u ác tính

MVP được áp dụng để điều trị chuột mắc bệnh ung thư ruột kết MC38 và khối u ác tính B16. Trong cả hai mô hình, điều trị bằng OVA mRNA bao bọc MVP hai lần đã ngăn chặn hoàn toàn sự phát triển của khối u dưới da; so sánh, điều trị bằng MVP đóng gói eGFP mRNA hoặc chỉ dùng phương tiện không có bất kỳ tác dụng ức chế nào có thể phát hiện được đối với sự phát triển của khối u (Hình 3AeD, Thông tin hỗ trợ Hình S3). Theo mô hình chuyển đổi CD4 sang CD8 trong các hạch bạch huyết (Hình 2), chúng tôi đã quan sát thấy sự gia tăng tỷ lệ tế bào T CD8þ/CD4þ trong các khối u từ chuột được điều trị bằng MVP đóng gói OVA mRNA (Hình 3E). Ngoài ra, chúng tôi đã phát hiện thấy mức độ tăng cao trong các tế bào T IFN-gþCD8þ ở lá lách, hạch bạch huyết và khối u ở chuột được điều trị bằng MVP bao bọc OVA mRNA, nhưng không phải chỉ bằng phương tiện hoặc MVP bao bọc GFP mRNA (Hình 3FeH, Thông tin hỗ trợ) Hình S4). Hơn nữa, có sự gia tăng đáng kể các tế bào T CD8þ T dương tính với OVA257e264-MHCI trong các khối u từ nhóm điều trị MVP bao bọc OVA mRNA cho thấy sự tăng sinh của các tế bào T CD8þ đặc hiệu với kháng nguyên (Hình 3I). Xét nghiệm ELISpot với các tế bào phân lập từ lá lách và hạch bạch huyết đã hỗ trợ thêm cho việc kích hoạt tế bào T (Hình 3JeM).

3.4. MVP kích thích phản ứng miễn dịch bẩm sinh bằng cách kích hoạt tín hiệu phụ thuộc STING

Chúng tôi đã áp dụng lõi mRNA, phương tiện không có mRNA và MVP đóng gói mRNA để điều trị BMDC nhằm xác định các yếu tố và con đường chính chịu trách nhiệm kích thích IFN loại I và biểu hiện cytokine gây viêm. Điều thú vị là, MVP cũng mạnh như chất chủ vận Tlr7 imiquimod trong việc kích hoạt bài tiết IFN-b, và riêng phương tiện cũng cho thấy hoạt động trong việc thúc đẩy bài tiết IFN-b, mặc dù hiệu lực của nó không cao bằng MVP; tuy nhiên, riêng lõi mRNA không có hiệu quả trong việc kích thích bài tiết IFN-b (Hình 4A). Kết quả ngụ ý rằng cả mRNA và các thành phần trong xe đều cần thiết để tối đa hóa biểu hiện IFN-b. Trong khi đó, imiquimod và phương tiện cho thấy hoạt động tương tự trong việc thúc đẩy biểu hiện TNF-a và IL{8}}b, trong khi MVP mạnh hơn nhiều so với cả hai (Hình 4B và C). Biểu hiện của CCL5, một cytokine thường liên quan đến các yếu tố điều hòa NF-kB và IFN, được kích thích như nhau trong các tế bào được điều trị bằng imiquimod, chỉ phương tiện hoặc MVP (Hình 4D). TLR7, MAVS, STING và TRIF là những yếu tố chính trong đường dẫn truyền tín hiệu chính làm trung gian cho phản ứng của tế bào với RNA virus và DNA28e30 bị hư hỏng. Chúng tôi đã tạo ra BMDC từ những con chuột bị loại bỏ gen Tlr7, Mavs, Sting hoặc Trif (KO) và xử lý các tế bào bằng lõi mRNA, phương tiện không có mRNA hoặc MVP đóng gói mRNA để kiểm tra biểu hiện IFN-b và TNF-a.

Hình 2 Kích thích phản ứng miễn dịch bằng MVP. (A) Sơ đồ của lõi mRNA/protamine, phương tiện không có mRNA và MVP hoàn chỉnh. (BeD) Sự trưởng thành của BMDC sau khi được xử lý bằng OVA-MVP trong 24 giờ. (E và F) Biểu hiện MHC I và phức hợp kháng nguyên OVA257e264 epitope-MHC I trong BMDC sau khi được xử lý bằng OVA-MVP trong 24 giờ. (G) Mức IL-2 từ BMDC đã xử lý được ủ cùng với các tế bào T B3Z hoặc OT-I. (H và I) Phân tích tế bào học dòng chảy của các tế bào T tăng sinh. Sắc ký đồ đại diện của tế bào T được hiển thị. (J) Sự trưởng thành của DC sau khi xử lý MVP in vivo. Chuột C57BL/6J được điều trị bằng OVA-MVP và DC trong các hạch bạch huyết vùng khoeo đã được phân tích. (K và L) Phân tích quần thể tế bào T. Chuột C57BL/6J được điều trị bằng phương tiện hoặc OVA-MVP và tế bào T trong các hạch bạch huyết vùng khoeo được phân tích bằng phương pháp tế bào học dòng chảy. (M) Xét nghiệm ELISpot. Chuột C57BL/6J được điều trị bằng OVA-MVP và các hạch bạch huyết được thu thập tại các thời điểm được chỉ định. Các tế bào biệt lập được áp dụng để đo các tế bào biểu hiện IFN-g. Dữ liệu được trình bày dưới dạng SEM trung bình (n Z 3). *P < 0.05; **P < 0.01; *** P < 0,005; **** P < 0,001; ns, không đáng kể.

Hình 3 Hoạt động chống khối u từ MVP. (A) Ức chế sự phát triển khối u MC38-OVA. Chuột cái C57BL/6J được tiêm dưới da 5  105 MC38-tế bào/chuột khối u OVA vào Ngày 0 và được điều trị bằng điều khiển PBS, điều khiển phương tiện, GFP-MVP hoặc OVA-MVP vào ngày Ngày 3 và 10. (B) Ức chế sự phát triển khối u B{12}}OVA. Chuột cái C57BL/6J được tiêm dưới da bằng 2  105 B16-tế bào/chuột khối u OVA vào Ngày 0 và được điều trị bằng kiểm soát PBS, kiểm soát phương tiện, GFP-MVP hoặc OVA-MVP vào Ngày 3 và 10. (C và D) Hình ảnh và trọng lượng của khối u B{22}}OVA vào Ngày 17. (E) Quần thể tế bào T trong khối u của chuột sau điều trị. (FeH) Tế bào T IFN-gþCD8þ ở lá lách, hạch bạch huyết (LN) và khối u của chuột sau điều trị. (I) Tế bào T CD8+ đặc hiệu OVA trong khối u của chuột sau điều trị. (JeM) Hình ảnh và phân tích định lượng xét nghiệm ELISpot của tế bào lách và tế bào LN từ chuột sau điều trị. Dữ liệu được trình bày dưới dạng SEM trung bình (n Z 5). *P < 0.05; ** P < 0,01; *** P < 0,005; **** P < 0,001.

Trạng thái KO của Mavs và Sting trong BMDC đã được xác nhận bằng phân tích Western blot (Thông tin hỗ trợ Hình. S5A). Đáng ngạc nhiên là Sting KO đã xóa sạch hoạt động kích thích bài tiết IFN-b từ cả phương tiện và MVP (Hình 4E), cho thấy rằng MVP đã kích hoạt biểu hiện IFN loại I thông qua STING. Để hỗ trợ cho khái niệm này, chúng tôi đã phát hiện quá trình phosphoryl hóa kinase 1 liên kết với bể (TBK1) (Hình. S5B), một kinase thường liên quan đến hoạt động STING31. Ngoài ra, con đường này không phụ thuộc vào tín hiệu TLR7, vì biểu hiện IFN-b không bị ảnh hưởng trong các tế bào được xử lý bằng imiquimod (Hình 4E). Khi so sánh, Trif hoặc Mavs KO có tác động tối thiểu đến biểu hiện IFN-b do MVP quảng bá. Đúng như dự đoán, imiquimod không hiệu quả trong việc kích thích bài tiết IFN-b trong BMDC có nguồn gốc từ Tlr7 KO; tuy nhiên, Tlr7 KO có tác động tiêu cực đến tác dụng kích thích từ MVP (Hình 4E). Điều thú vị là, một đặc điểm khác đã được quan sát thấy về sự tiết TNF-a từ các phương pháp điều trị tương tự. Loại bỏ Sting, Trif hoặc Tlr7 không có tác động tối thiểu đến sự biểu hiện cytokine được kích thích MVP. Mặt khác, Knockout of Mavs đã làm giảm đáng kể mức TNF-a trong các tế bào được xử lý chỉ bằng phương tiện hoặc MVP (Hình 4F). Kết quả chỉ ra rằng MAVS là yếu tố chính điều chỉnh biểu hiện TNF-a ở DC khi điều trị MVP.

3.5. MVP kích thích con đường STING và MAVS để thúc đẩy bài tiết IFN-I và các cytokine gây viêm

Để xác định các bộ phận trong xe chịu trách nhiệm kích thích tín hiệu STING và MAVS, chúng tôi đã chuẩn bị các phương tiện và MVP bằng cách thay thế hoặc loại bỏ các bộ phận chính và áp dụng chúng để xử lý BMDC. Chất chủ vận Sting theo chu kỳ GMP-AMP (cGAMP) đóng vai trò kiểm soát tích cực trong việc kích thích bài tiết IFN-b. Việc thay thế EDOPC lipid cation trong xe bằng một loại lipid tích điện dương khác, DOTAP, đã loại bỏ hoàn toàn sự bài tiết IFN-b. Để so sánh, tác dụng kích thích từ phương tiện và MVP vẫn được giữ lại dù có hoặc không có protamine, và hoạt động kích thích như vậy phụ thuộc vào gen Sting nguyên vẹn (Hình 4G). Điều thú vị là, BMDC được xử lý bằng các thành phần riêng lẻ của vỏ lipid bao gồm EDOPC không thúc đẩy sự bài tiết IFN-b mạnh mẽ (Thông tin hỗ trợ Hình S6). Do đó, EDOPC rất cần thiết để kích hoạt STING và hoạt động của nó phụ thuộc vào sự hình thành hạt nano lipid (tức là phương tiện hoặc MVP). Phương tiện và MVP được điều chế bằng EDOPC hoặc DOTAP cũng được áp dụng để xử lý BMDCS có nguồn gốc từ chuột hoang dã và chuột Mavs KO, đồng thời xác định mức TNF trong môi trường phát triển tế bào. Đúng như dự kiến, việc thay thế EDOPC bằng DOTAP hoặc DOPC đã loại bỏ nỗ lực kích thích khỏi phương tiện và MVP. Ngoài ra, mức TNF-a đã giảm đáng kể trong các tế bào Mavs KO so với các tế bào hoang dã, nhưng không giảm (Hình 4H), cho thấy các yếu tố bổ sung có thể liên quan đến việc điều hòa biểu hiện TNF-a được kích thích bằng MVP.

3.6. Con đường STING rất cần thiết cho phản ứng miễn dịch chống khối u qua trung gian MVP

Cả chuột hoang dã và chuột bị loại đều được điều trị bằng MVP đóng gói OVA mRNA, đồng thời kiểm tra sự trưởng thành của DC và sự tăng sinh tế bào T. Sting KO làm giảm đáng kể tỷ lệ tế bào CD80þ và CD86þ DC và tế bào T CD69þ (Hình 5AeD). Xét nghiệm ELISpot cho thấy các tế bào sản xuất IFN-g ở lá lách và hạch bạch huyết ở chuột Sting KO giảm đáng kể so với chuột hoang dã sau khi chúng được điều trị bằng cùng một liều MVP (Hình 5EeH). Tác động từ Mavs KO là rất nhỏ, vì không có sự khác biệt nào được theo dõi trên các tế bào T bộ nhớ CD44þCD8þ, tế bào T CD8þ T dương tính với OVA257e264-MHCI hoặc số lượng tế bào sản xuất IFN-g trong các hạch bạch huyết so với tế bào hoang dã- loại chuột (Hình 5IeL). Kết quả củng cố quan điểm cho rằng các yếu tố bổ sung ngoài MAVS có thể liên quan đến biểu hiện cytokine gây viêm do MVP kích thích. Cả chuột hoang dã và chuột Sting KO đều được sử dụng để cấy vào khối u B{20}}OVA và chuột được điều trị bằng phương pháp kiểm soát PBS hoặc MVP được bao bọc bởi OVA mRNA. Phân tích tế bào học dòng chảy trên các mẫu hạch và khối u được thu thập từ chuột đã được tiêm phòng cho thấy số lượng tế bào T CD8þ sản xuất IFN-g ở chuột Sting KO giảm đáng kể (Hình 6A và B). Kết quả là sự phát triển của khối u bị ức chế hoàn toàn ở chuột hoang dã được điều trị bằng MVP, so với chỉ ức chế một phần ở chuột Sting KO (Hình 6C).

cistanche thực vật tăng cường hệ thống miễn dịch

Nhấn vào đây để xem các sản phẩm Tăng cường miễn dịch Cistanche

【Hỏi thêm] Email:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

4. Thảo luận

Trong nghiên cứu hiện tại, chúng tôi đã kiểm tra một cách có hệ thống vai trò chức năng của từng thành phần riêng lẻ trong MVP đối với việc kích thích phản ứng miễn dịch chống khối u. Nghiên cứu dựa trên tế bào của chúng tôi đã chứng minh rõ ràng rằng cả phân tử mRNA và phương tiện không chứa RNA trong MVP đều cần thiết cho hoạt động đầy đủ của nó trong việc thúc đẩy sự biểu hiện của IFN-b và một số cytokine gây viêm bao gồm IL{4}}b và TNF -a trong tế bào đuôi gai. Các cytokine như vậy đã được chứng minh là đóng vai trò thiết yếu trong việc kích hoạt tế bào đuôi gai và khả năng miễn dịch chống khối u qua trung gian vắc-xin20. Nghiên cứu của chúng tôi cũng tiết lộ rằng việc kích thích sản xuất cytokine phụ thuộc vào một số con đường truyền tín hiệu quan trọng liên quan đến cảm giác miễn dịch bẩm sinh, bao gồm cả những con đường qua trung gian STING và MAVS. Trong khi STING cần thiết cho biểu hiện IFN-b, MAVS chủ yếu liên quan đến việc điều chỉnh biểu thức TNF-a (Hình 6D). Tầm quan trọng của tín hiệu STING đối với khả năng miễn dịch chống khối u qua trung gian MVP được thể hiện rõ hơn bằng hoạt động của tế bào T giảm và do đó làm ảnh hưởng đến khả năng ức chế tăng trưởng khối u ở chuột Sting KO. Kết quả này phù hợp với các báo cáo khác rằng kích hoạt STING xác định khả năng miễn dịch chống ung thư qua trung gian tế bào T gây độc tế bào32. MAVS là chất trung gian chính trong tín hiệu RIG-I-receptor (RLR) để đáp ứng với nhiễm virus. Kích hoạt con đường này dẫn đến một loạt các phản ứng viêm33. Điều thú vị là hoạt động của tế bào T không bị tổn hại ở chuột Mavs KO, vì tín hiệu MAVS rõ ràng đóng một vai trò lớn trong việc điều chỉnh sự biểu hiện của các cytokine gây viêm bao gồm TNF-a. Một lý do có thể là do việc kích thích các cytokine như vậy bằng MVP được thực hiện qua nhiều con đường và sự gián đoạn của con đường MAVS không làm giảm biểu hiện của cytokine xuống mức đủ thấp để gây ra tác động đáng kể. Ngoài ra, việc mất tín hiệu MAVS sẽ được bù đắp bằng các đường dẫn khác. Cần có những nghiên cứu sâu hơn để xác định những con đường này nhằm hiểu rõ hơn về cơ chế hoạt động của vắc xin MVP. Mặc dù TLR7 theo truyền thống được liên kết với phương pháp trị liệu bằng mRNA21, nhưng tín hiệu TLR7 dường như không đóng vai trò chính trong việc điều hòa hoạt động MVP. Việc áp dụng các phân tử mRNA được methyl hóa hoàn toàn trong nghiên cứu hiện tại có thể khiến tín hiệu TLR7 ít liên quan hơn. Người ta đã chứng minh rõ ràng rằng quá trình methyl hóa RNA ngăn chặn sự nhận biết của TLR23. TRIF là protein tiếp hợp chính cho tín hiệu TLR3/7/828. Knockout of Trif cũng không ảnh hưởng đến hoạt động MVP, củng cố quan điểm rằng các TLR ở trên bao gồm TLR7 không đóng vai trò chính trong việc điều hòa các phản ứng của tế bào đối với MVP. Nhiều chất chủ vận Sting đã được áp dụng trong phát triển vắc xin ung thư bao gồm dinucleotide tuần hoàn và các hợp chất phân tử lớn và nhỏ34e37. Các chất chủ vận Sting như vậy cần được thêm vào làm chất bổ trợ bên ngoài trong quá trình chuẩn bị vắc xin, điều này làm tăng thêm sự phức tạp khác cho thành phần vắc xin. Ngoài ra, chất chủ vận Sting được bổ sung từ bên ngoài có thể gây ra các tác dụng phụ không mong muốn khi nó tách khỏi phức hợp mRNA. Để so sánh, MVP của chúng tôi đóng vai trò như một chất tự bổ trợ và hoạt động trong bối cảnh vắc xin ung thư, vì không có thành phần riêng lẻ nào của vắc xin kể cả EDOPC có thể thúc đẩy biểu hiện cytokine. Điều thú vị là, EDOPC phospholipid cation không thể được thay thế bằng DOTAP không phospholipid cũng tích điện dương. Thật thú vị khi suy đoán cơ chế tiềm năng cho sự khác biệt giữa hai lipit cation này. Tuy nhiên, người ta đã ghi nhận rằng các đặc tính khác của thành phần phân tử lipid như tính kỵ nước có thể có tác động sâu sắc đến chức năng tổng thể của hạt nano và hiệu quả phân phối axit nucleic của nó38. Vì vậy, phải cẩn thận trong việc lựa chọn các phân tử thích hợp để điều chế vắc xin mRNA đầy đủ chức năng. Tóm lại, chúng tôi đã phát triển một loại vắc xin điều trị ung thư dựa trên mRNA mạnh mẽ và chỉ định chức năng của từng thành phần riêng lẻ trong vắc xin. Cơ chế hoạt động của nó khá khác biệt so với các nền tảng mRNA khác được sử dụng để can thiệp dự phòng và điều trị. Kiến thức thu được từ nghiên cứu hiện tại chắc chắn sẽ hướng dẫn sự phát triển của phương pháp trị liệu bằng mRNA bổ sung trong tương lai.

Hình 4 Thúc đẩy phản ứng miễn dịch bẩm sinh của MVP. (AeD) BMDC được xử lý bằng imiquimod 1 mg/mL, lõi, phương tiện hoặc MVP tương đương mRNA 1 mg/mL trong 24 giờ. Mức IFN-b, TNF-a, IL{7}}b và CCL5 được đo bằng ELISA. (E và F) IFN-b và TNF-a biểu hiện của BMDC có nguồn gốc từ chuột hoang dã và chuột bị loại bỏ gen (KO). BMDC được xử lý bằng thuốc thử được chỉ định trong 24 giờ. IFN-b và TNF-a được đo bằng ELISA. (G) IFN-b trong BMDC có nguồn gốc từ chuột hoang dã và chuột nhắt Sting. BMDC được xử lý bằng 20 mg/mL cGAMP, lõi, phương tiện hoặc MVP tương đương 1 mg/mL mRNA trong 24 giờ. Phương tiện (DOTAP): được chuẩn bị bằng cách thay thế EDOPC bằng DOTAP; tá dược (không có protamine): được bào chế bằng cách loại bỏ protamine. ND: không thể phát hiện được. (H) TNF-a trong BMDC có nguồn gốc từ chuột hoang dã và chuột bị loại Mavs. BMDC được xử lý bằng lõi, phương tiện hoặc MVP tương đương 1 mg/mL mRNA trong 24 giờ. Phương tiện (DOTAP): được chuẩn bị bằng cách thay thế EDOPC bằng DOTAP; phương tiện (DOPC): được chuẩn bị bằng cách thay thế EDOPC bằng DOPC. Dữ liệu được trình bày dưới dạng SEM trung bình (n Z 3). ***P < 0.005; **** P < 0,001; ns, không đáng kể.

Hình 5 Phản ứng miễn dịch chống ung thư ở chuột bị loại trừ Sting và Mavs. (AeD) Giảm kích hoạt tế bào DC và T ở chuột bị loại bỏ Sting. Cả chuột hoang dã và chuột nhắt Sting đều được điều trị bằng MVP bọc OVA mRNA và các hạch bạch huyết được thu thập 48 giờ sau đó để đo tế bào DC và T. (EeH) Giảm tế bào T biểu hiện IFN-g ở lá lách và hạch bạch huyết từ chuột bị loại bỏ Sting. Cả hình ảnh của các điểm và phân tích định lượng đều được hiển thị. (IeL) Không ảnh hưởng đến hoạt động của tế bào T ở chuột bị loại trừ Mavs. Cả chuột hoang dã và chuột bị loại trừ Mavs đều được điều trị bằng kiểm soát PBS hoặc MVP được bọc OVA mRNA và các hạch bạch huyết được thu thập 48 giờ sau đó để đo tế bào T bộ nhớ CD44þCD8þ (I), OVA257e264-MHCI dương tính với dextramer CD8þ Tế bào T (J) và số lượng tế bào sản xuất IFN-g (K và L). Dữ liệu được trình bày dưới dạng SEM trung bình (n Z 3 hoặc 5). *P < 0.05; **P < 0.01; *** P < 0,005; **** P < 0,001; ns, không đáng kể.

Hình 6 Khả năng miễn dịch chống khối u phụ thuộc vào vết chích. (A và B) Phân tích các tế bào T biểu hiện IFN-g trong các hạch bạch huyết và mô khối u sau khi chuột hoang và chuột bị loại bỏ Sting mang khối u B16-OVA được điều trị bằng MVP bọc OVA mRNA. Chuột được điều trị vào Ngày 3 và 1{13}}, các hạch bạch huyết và khối u được thu thập vào Ngày 15. Các tế bào đơn lẻ được phân tích bằng phương pháp tế bào học dòng chảy. (C) Ức chế sự phát triển khối u ở chuột hoang loại và chuột bị loại bỏ Sting. Chuột được xử lý bằng chất kiểm soát PBS hoặc MVP vào Ngày 3 và 10. Dữ liệu được trình bày dưới dạng SEM trung bình (n Z 5). * P < 0,05; **** P < 0,001; ns, không đáng kể. (D) Sơ đồ kích thích MVP của đường dẫn truyền tín hiệu dẫn đến sản xuất cytokine ở DC. Mặc dù việc kích thích biểu hiện IFN-b chỉ được điều hòa bởi STING, nhưng có nhiều yếu tố bao gồm MAVS điều hòa biểu hiện TNF-a và IL{19}}b.

Người giới thiệu

1. El Sahly HM, Baden LR, Essink B, Doblecki-Lewis S, Martin JM, Anderson EJ, và những người khác. Hiệu quả của vắc xin mRNA-1273 SARS-CoV-2 khi hoàn thành giai đoạn làm mù. N Engl J Med 2021;385:1774e85.

2. Moreira Jr ED, Kitchin N, Xu X, Dychter SS, Lockhart S, Gurtman A, và những người khác. Tính an toàn và hiệu quả của liều vắc xin BNT162b2 Covid-19 thứ ba. N Engl J Med 2022;386:1910e21.

. Dowdy SF. Vượt qua các rào cản tế bào để điều trị bằng RNA. Công nghệ sinh học Nat 2017;35:222e9.

4. Cullis PR, Hope MJ. Hệ thống hạt nano lipid để hỗ trợ các liệu pháp gen. Mol Có 2017;25:1467e75.

5. Persano S, Guevara ML, Li Z, Mai J, Ferrari M, Pompa PP, và những người khác. Lipopolyplex tăng cường khả năng miễn dịch chống khối u khi tiêm chủng dựa trên mRNA. Vật liệu sinh học 2017;125:81e9.

6. Wang Y, Su HH, Yang Y, Hu Y, Zhang L, Blancafort P, et al. Cung cấp hệ thống mRNA đã biến đổi mã hóa virus herpes simplex 1 thymidine kinase cho liệu pháp gen ung thư nhắm mục tiêu. Mol Có 2013;21:358e67.

7. Kranz LM, Diken M, Haas H, Kreiter S, Loquai C, Reuter KC, et al. Việc cung cấp RNA hệ thống đến các tế bào đuôi gai khai thác khả năng phòng chống vi-rút cho liệu pháp miễn dịch ung thư. Thiên nhiên 2016;534:396e401.

8. Meng C, Chen Z, Mai J, Shi Q, Tian S, Hinkle L, et al. Vắc-xin mRNA bắt chước vi-rút để điều trị ung thư. Adv Ther 2021;4:2100144.

9. Pardi N, Hogan MJ, Porter FW, Weissman D. mRNA vắc xin kỷ nguyên mới trong vắc xin học. Nat Rev Drug Discov 2018;17:261e79.

10. Rurik JG, Tombacz I, Yadegari A, Mendez Fernandez PO, Shewale SV, Li L, và những người khác. Tế bào CAR T được sản xuất in vivo để điều trị chấn thương tim. Khoa học 2022;375:91e6.

11. Esteban I, Pastor-Quinones C, Usero L, Plana M, Garcia F, Leal L. Trong kỷ nguyên của vắc xin mRNA, Có hy vọng nào về phương pháp chữa khỏi HIV theo chức năng không? Virus 2021;13:501.

12. Krienke C, Kolb L, Diken E, Streuber M, Kirchhoff S, Bukur T, và những người khác. Vắc xin mRNA không gây viêm để điều trị bệnh viêm não tủy tự miễn thực nghiệm. Khoa học 2021;371:145e53.

13. Vắc xin Miao L, Zhang Y, Huang L. mRNA dùng cho liệu pháp miễn dịch ung thư. Ung thư Mol 2021;20:41.

14. Van Hoecke L, Verbeke R, Dewitte H, Lentacker I, Vermaelen K, Breckpot K, et al. mRNA trong liệu pháp miễn dịch ung thư: vượt ra ngoài nguồn kháng nguyên. Ung thư Mol 2021;20:48.

15. Sahin U, Derhovanessian E, Miller M, Kloke BP, Simon P, Lower M, et al. Vắc-xin đột biến RNA được cá nhân hóa huy động khả năng miễn dịch trị liệu đa đặc hiệu chống lại bệnh ung thư. Thiên nhiên 2017;547:222e6.

16. Sahin U, Oehm P, Derhovanessian E, Jabulowsky RA, Vormehr M, Gold M, et al. Vắc-xin RNA thúc đẩy khả năng miễn dịch trong khối u ác tính được điều trị bằng chất ức chế điểm kiểm tra Thiên nhiên 2020;585:107e12.

17. Hilf N, Kuttruff-Coqui S, Frenzel K, Bukur V, Stevanovic S, Gouttefangeas C, và những người khác. Thử nghiệm tiêm chủng được cá nhân hóa tích cực cho bệnh u nguyên bào thần kinh đệm mới được chẩn đoán. Thiên nhiên 2019;565:240e5.

18. Carreno BM, Magrini V, Becker-Hapak M, Kaabinejadian S, Hundal J, Petti AA, et al. Liệu pháp miễn dịch ung thư. Vắc-xin tế bào đuôi gai làm tăng bề rộng và tính đa dạng của các tế bào T đặc hiệu cho khối u ác tính. Khoa học 2015;348:803e8.

19. Keskin DB, Anandappa AJ, Sun J, Tirosh I, Mathewson ND, Li S, et al. Vắc xin Neoantigen tạo ra phản ứng tế bào T trong khối u trong thử nghiệm u nguyên bào thần kinh giai đoạn Ib. Thiên nhiên 2019;565:234e9.

20. Mai J, Li Z, Xia X, Zhang J, Li J, Liu H, et al. Kích hoạt hiệp đồng khả năng miễn dịch chống ung thư bằng vắc-xin điều trị dạng hạt. Adv Sci 2021;8:2100166.

21. Kobiyama K, Ishii KJ. Tạo ý nghĩa bẩm sinh về tính bổ trợ của vắc xin mRNA. Nat Immunol 2022;23:474e6.

22. Fotin-Mleczek M, Duchardt KM, Lorenz C, Pfeiffer R, Ojkic-Zrna S, Probst J, và những người khác. Vắc xin dựa trên RNA Messenger có hoạt tính kép tạo ra các phản ứng miễn dịch thích ứng phụ thuộc TLR cân bằng-7-và cung cấp hoạt động chống ung thư. J Chất miễn dịch 2011;34:1e15.

23. Kariko K, Buckstein M, Ni H, Weissman D. Ngăn chặn sự nhận biết RNA bằng các thụ thể giống Toll: tác động của việc biến đổi nucleoside và nguồn gốc tiến hóa của RNA. Miễn dịch 2005;23:165e75.

24. Tahtinen S, Tong AJ, Himmels P, Oh J, Paler-Martinez A, Kim L, và cộng sự. IL-1 và IL-1ra là những chất điều chỉnh chính phản ứng viêm đối với vắc xin RNA. Nat Immunol 2022;23:532e42.

25. Li C, Lee A, Grigoryan L, Arunachalam PS, Scott MKD, Trisal M, et al. Cơ chế miễn dịch bẩm sinh và thích nghi đối với vắc xin PfizerBioNTech BNT162b2. Nat Immunol 2022;23:543e55.

26. LoPresti ST, Arral ML, Chaudhary N, Whitehead KA. Việc thay thế lipid trợ giúp bằng các chất thay thế tích điện trong hạt nano lipid tạo điều kiện thuận lợi cho việc vận chuyển mRNA có mục tiêu đến lá lách và phổi. Bản phát hành kiểm soát J 2022;345:819e31.

27. Charbe NB, Amnerkar ND, Ramesh B, Tambuwala MM, Bakshi HA, Aljabali AAA, et al. RNA can thiệp nhỏ để điều trị ung thư: vượt qua những trở ngại trong quá trình sinh nở. Acta Pharm Sin B 2020;10:2075e109.

28. Fuertes MB, Woo SR, Burnett B, Fu YX, Gajewski TF. Phản ứng interferon loại I và cảm giác miễn dịch bẩm sinh của bệnh ung thư. Xu hướng Miễn dịch 2013;34:67e73.

29. Harding SM, Benci JL, Irianto J, Discher DE, Minn AJ, Greenberg RA. Tiến trình phân bào sau tổn thương DNA cho phép nhận dạng mẫu trong micronuclei. Thiên nhiên 2017;548:466e70.

30. Hartlova A, Erttmann SF, Raffi FA, Schmalz AM, Resch U, Anugula S, và cộng sự. Tổn thương DNA kích hoạt hệ thống interferon loại I thông qua cảm biến DNA tế bào STING để thúc đẩy khả năng miễn dịch bẩm sinh chống vi khuẩn. Miễn dịch 2015;42:332e43.

31. Zhang Z, Yuan B, Bao M, Lu N, Kim T, Liu YJ. Helicase DDX41 cảm nhận DNA nội bào qua trung gian STING trong tế bào đuôi gai. Nat Immunol 2011;12:959e65.

32. Sivick KE, Desbien AL, Glickman LH, Reiner GL, Corrales L, Surh NH, và cộng sự. Mức độ kích hoạt STING trị liệu quyết định khả năng miễn dịch chống khối u qua trung gian tế bào CD8þ T. Đại diện di động 2018;25: 3074e3085 e5.

33. Reikine S, Nguyen JB, Modis Y. Cơ chế nhận dạng mẫu và báo hiệu của RIG-I và MDA5. Mặt trận miễn dịch 2014;5:342.

34. Fu J, Kanne DB, Leong M, Glickman LH, McWhirter SM, Lemmens E, và cộng sự. Vắc-xin ung thư được điều chế bằng chất chủ vận STING có thể chữa khỏi các khối u đã hình thành kháng lại sự phong tỏa PD{2}}. Khoa học dịch thuật Med 2015;7: 283ra52.

35. Corrales L, Glickman LH, McWhirter SM, Kanne DB, Sivick KE, Katibah GE, và những người khác. Kích hoạt trực tiếp STING trong môi trường vi mô khối u dẫn đến hồi quy và miễn dịch khối u mạnh mẽ và mang tính hệ thống. Đại diện tế bào 2015;11:1018e30.

36. Miao L, Li L, Huang Y, Delcassian D, Chahal J, Han J, et al. Cung cấp vắc xin mRNA bằng lipid dị vòng làm tăng hiệu quả chống khối u bằng cách kích hoạt tế bào miễn dịch qua trung gian STING. Công nghệ sinh học Nat 2019;37:1174e85.

37. Luo M, Wang H, Wang Z, Cai H, Lu Z, Li Y, et al. Vắc-xin nano kích hoạt STING cho liệu pháp miễn dịch ung thư. Công nghệ nano Nat 2017;12:648e54.

38. Wang L, Koynova R, Parikh H, MacDonald RC. Hoạt động chuyển hóa của các hỗn hợp nhị phân của các dẫn xuất phosphatidylcholine thay thế cation o: lõi kỵ nước điều chỉnh mạnh mẽ các tính chất vật lý và hiệu quả phân phối DNA. Sinh lý học J 2006;91:3692e706.