Hạt nhân đồi thị trước: Chất nền quan trọng cho trí nhớ liên kết cặp phi không gian ở chuột Phần 2

2|NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1|Động vật và điều kiện nhà ở

Chuột đực Long-Evans (12 tháng tuổi; nặng trung bình 630 g) được nhốt trong nhóm ba hoặc bốn con trong lồng Makrolon (48 x 28 x 22 cm) theo chu kỳ sáng-tối 12-h đảo ngược (sáng lúc 8 giờ tối ).

Thử nghiệm hành vi xảy ra trong giai đoạn tối của chu kỳ ánh sáng, năm buổi mỗi tuần; các quan sát xác nhận rằng chuột hoạt động tương đối nhiều hơn trong giai đoạn tối. Chuột được duy trì ở mức 85% trọng lượng cơ thể khi cho ăn tự do bằng nước tùy thích; thức ăn được cho ăn tự do trước và sau phẫu thuật để phục hồi sau phẫu thuật.

Phẫu thuật là quá trình điều trị bệnh và cải thiện sức khỏe thể chất. Quá trình phục hồi sau phẫu thuật đòi hỏi sự chú ý đặc biệt. Ngoài việc phục hồi thể chất, cảm giác dễ chịu cũng đòi hỏi phải tập trung vào việc phục hồi trí nhớ. Có một mối liên hệ chặt chẽ giữa phục hồi sau phẫu thuật và trí nhớ.

Trong quá trình phẫu thuật, các yếu tố như phản ứng nghịch cảnh của cơ thể và tác dụng của thuốc gây mê thường ảnh hưởng đến chức năng ghi nhớ của não. Sau khi cơ thể hồi phục, chú ý duy trì chế độ ăn uống tốt, tập luyện điều độ và ngủ đủ giấc. Trong thời gian hồi phục bên ngoài bệnh viện, bạn phải tiếp tục tránh các hoạt động quá sức và duy trì trạng thái cơ thể thoải mái.

Ngoài thói quen sinh hoạt, việc điều chỉnh tâm lý hợp lý cũng có ích trong việc phục hồi sức khỏe và trí nhớ. Hãy thư giãn bản thân, duy trì tâm trí bình yên và giúp bản thân điều chỉnh để phục hồi trí nhớ. Đồng thời, bạn nên tích cực tham gia các hoạt động giải trí và giao tiếp với người thân, bạn bè để não bộ luôn hoạt động và nâng cao khả năng nhận thức, trí nhớ. Hoạt động này có thể được tăng dần và về cơ bản có thể được thực hiện mỗi tuần một lần.

Nói tóm lại, quá trình phục hồi sau phẫu thuật đòi hỏi sự chú ý toàn diện. Việc duy trì thói quen sinh hoạt tốt và điều chỉnh tâm lý đóng vai trò rất quan trọng trong việc thúc đẩy quá trình phục hồi thể chất và phục hồi trí nhớ. Chúng ta hãy đối mặt với nó một cách tích cực, với lòng tin tưởng và hy vọng trọn vẹn. Chúng ta cần cải thiện trí nhớ và Cistanche Deserticola có thể cải thiện đáng kể trí nhớ vì Cistanche Deserticola cũng có thể điều chỉnh sự cân bằng của các chất dẫn truyền thần kinh, chẳng hạn như tăng mức độ acetylcholine và các yếu tố tăng trưởng. Những chất này rất quan trọng cho trí nhớ và học tập. Ngoài ra, Thịt còn có thể cải thiện lưu lượng máu và thúc đẩy quá trình cung cấp oxy, có thể đảm bảo não nhận đủ chất dinh dưỡng và năng lượng, từ đó cải thiện sức sống và sức bền của não.

Bấm vào biết cách cải thiện chức năng não

Tất cả các thủ tục đều tuân thủ các hướng dẫn đã được phê duyệt của Ủy ban đạo đức động vật của Đại học Canterbury. Bốn nhóm chuột được thành lập bằng cách phân công ngẫu nhiên sau khi làm quen trước phẫu thuật trong mê cung cánh tay xuyên tâm (RAM) và đường băng. Bốn nhóm là các tổn thương ATN hai bên không có hoặc không có dấu vết giữa mùi và kích thích vật thể khi được huấn luyện trong nhiệm vụ kết hợp theo cặp và hai nhóm tổn thương Sham tương ứng.

Kích thước mẫu cuối cùng là (1) Sham-No Trace=7 (tức là nhóm tổn thương Sham không có khoảng cách giữa mùi và kích thích đối tượng được sử dụng trong nhiệm vụ liên kết theo cặp); (2) Dấu vết giả tạo=7 (Nhóm xấu hổ có dấu vết 10- giữa sự xuất hiện của mùi và các kích thích đối tượng); (3) ATN-Không dấu vết=8;và (4) ATN-Không dấu vết=9. Một con chuột tổn thương ATN bổ sung đã bị loại trừ do không đáp ứng các tiêu chí tổn thương (xem bên dưới).

2.2|Ca phẫu thuật

Chuột được gây mê bằng isoflurane (cảm ứng 4%; duy trì 2,5%) và được đặt trong thiết bị định vị lập thể có thanh tai không gây chấn thương (Kopf, Tujunga, CA). Thanh răng cửa được đặt ở mức 7,5 mm dưới đường giữa các răng để giảm thiểu thiệt hại cho răng cửa.

Ở mỗi bán cầu, hai lần truyền được hướng vào nhân trước bụng (AV; trên và dưới) và một lần truyền vào nhân trước trong (AM). Mỗi cuộc phẫu thuật sử dụng một trong năm tọa độ trước-sau (AP) tương ứng với khoảng cách Bregma-Lambda của từng con chuột (tất cả các giá trị tính bằng mm). Đối với tổn thương AV, tọa độ AP là: 2,20 đối với B–L 6,9–7,2; 2,25 đối với B–L 7,3 đến 7,6; 2,30 cho B–L Lớn hơn hoặc bằng 7,7. Việc truyền AV được thực hiện ở vị trí 5,68 và 5,73 dưới màng cứng và 1,52 phía ngoài đường giữa.

Việc truyền AM được thực hiện ở phía trước {0}} ,1 mm so với tọa độ AV, ở mức 5,76 bên dưới màng cứng và 1,16 bên; tổn thương AM đầu tiên được thực hiện sau khi hoàn thành tất cả các lần truyền AV và bắt đầu đối diện với vị trí tổn thương AV cuối cùng. 0.15 M N-methyl-d-aspartate (NMDA; Sigma, CastleHill, NSW) trong 0.1 M dung dịch đệm photphat (pH 7,20) được truyền vào từng vị trí với tốc độ 0,04 ul mỗi phút thông qua một 2.5-ulHamilton ống tiêm (Reno, NV, USA) sử dụng bơm truyền siêu nhỏ (Stoelting, Wood Dale, IL).

Bán cầu trang web AV lần lượt nhận được {{0}}.12 và 0.10 ul cho các vị trí bụng ở vùng lưng; 0,06 ul đã được sử dụng cho mỗi trang AM. Kim tiêm vẫn ở nguyên vị trí trong 3 phút mỗi bên, sau khi truyền.
Các ca phẫu thuật tổn thương giả sử dụng quy trình tương tự, nhưng kim được hạ xuống 1 mm trên vị trí tổn thương AV trên và AM mà không được truyền dịch.

2.3|Nhiệm vụ hành vi

RAM tám cánh đã xác nhận tình trạng suy giảm trí nhớ không gian ở chuột bị tổn thương ATN sau phẫu thuật. Một thiết bị trên đường băng đã được sử dụng để huấn luyện chuột thực hiện tất cả các nhiệm vụ phi không gian, nghĩa là phân biệt mùi đơn giản và đối tượng đơn giản cũng như các nhiệm vụ liên kết đối tượng mùi và dấu vết của đối tượng.

Trước khi phẫu thuật, những con chuột bị hạn chế thực phẩm đã được làm quen với RAM tám cánh, được mô tả bên dưới, để lấy 0,1 g miếng sô cô la (Foodfirst LTD Auckland, New Zealand) và thích nghi với việc mở và đóng cửa cánh tay. Trong đường băng Perspex màu đỏ (Hình 1), chuột cũng được tạo hình để chọc vào mũi một nắp nhựa hình tròn màu trắng 2-cm cao hơn mặt sàn 10 cm và ở giữa một miếng bọt biển mỏng trên miếng chèn Perspex trong suốt được gắn vào bức tường cuối cùng.

Chúng cũng được tạo hình để đẩy (sử dụng mũi hoặc chân) một vật có bản lề ở phía sau đế của nó lên đỉnh giếng thực phẩm được lõm vào giữa một khối gỗ 5 x 8,5 x 3 cm. Thức ăn có chứa những miếng sô-cô-la (và đựng những thức ăn không thể tiếp cận được bên dưới hốc). Đối tượng dùng để huấn luyện trước không được sử dụng lại. Sau phẫu thuật, chuột phục hồi đã được làm quen lại với cả RAM và đường băng.

2.4|Bộ nhớ làm việc không gian trong RAM

Sau phẫu thuật, trí nhớ làm việc không gian đã được kiểm tra bằng cách sử dụng RAM đặt ở trung tâm một căn phòng không có cửa sổ (3,3 m). Mê cung có một trung tâm bằng gỗ sơn màu xám rộng 35 cm với tám cánh tay bằng nhôm (dài 65 cm, rộng 8,6 cm, có viền cao 4,5 cm), cao hơn sàn phòng 67,5 cm. Các bức tường Perspex trong suốt (dài 19 cm và cao 25 ​​cm) kéo dài dọc theo một bên của mỗi cánh tay từ trung tâm để ngăn chuột nhảy giữa các cánh tay.

Một giếng thực phẩm bằng gỗ màu đen (5 8,5 3 cm), với thức ăn không thể tiếp cận bên dưới, được đặt ở cuối mỗi cánh tay. Trong quá trình thử nghiệm, 2 0,1 g miếng sô cô la có mặt trong mỗi giếng thực phẩm khi bắt đầu mỗi giếng sự thử nghiệm. Các cửa máy chém Perspex trong suốt, có thể được nâng lên từ bên dưới trục bằng hệ thống ròng rọc, kiểm soát khả năng tiếp cận các cánh tay trục.

Mười ngày đào tạo chính thức liên tục về RAM được sử dụng để kiểm tra trí nhớ làm việc về không gian. Con chuột được đặt ở trung tâm trung tâm và 10 giây sau, tất cả tám cánh tay đều được mở ra và con chuột được phép đưa ra lựa chọn được xác định là cả hai chân sau đều vượt qua ngưỡng cánh tay. Khi con chuột đã chui vào một cánh tay, tất cả các cửa đều đóng lại và nó bị giam trong cánh tay đó trong 15 giây bất kể nó có lựa chọn đúng hay không.

Sau đó, con chuột được phép quay trở lại trung tâm trung tâm và giữ ở đó trong 10 giây trước khi tất cả các cửa được mở lại để cho phép lựa chọn cánh tay khác. Thử nghiệm kết thúc khi rathad đến thăm tất cả tám cánh tay, 20 lựa chọn cánh tay đã được thực hiện hoặc đã trôi qua 10 phút.

2,5|Nhiệm vụ phi không gian: Phân biệt đơn giản và học tập liên kết theo cặp

Cả nhiệm vụ phân biệt đơn giản và nhiệm vụ liên kết theo cặp đều sử dụng cùng một đường băng Perspex màu đỏ (93 26 26 cm) được đặt trên một chiếc bàn cao 75-cm (Hình 1). Đường băng có thể được chia thành ba cửa có thể tháo rời theo chiều dọc (Perspex màu đỏ, 26 x 26 cm) được chọn dựa trên nhiệm vụ hành vi cụ thể. Để làm quen, miếng bọt biển mỏng 6,5 6 8 mm có nắp ở giữa giữ phần thưởng là đồ ăn sô cô la (Hình 1).

Miếng bọt biển được gắn vào một cửa có thể tháo rời trên đường băng (đối với nhiệm vụ liên kết theo cặp) hoặc thành cuối đường băng (đối với nhiệm vụ phân biệt đơn giản). Một miếng bọt biển gắn cửa khác nhau được sử dụng cho mỗi mùi, được truyền vào cạnh thùng chứa 5 ml dầu hướng dương trộn với 20 ul Tinh dầu New Zealand.

Mùi chanh và đinh hương dành cho các nhiệm vụ kết hợp theo cặp, mùi quế và chanh dành cho các nhiệm vụ phân biệt đơn giản hoặc ngược lại trong các nhóm đối trọng. Các vật thể nhẹ và dễ nhìn thấy (Hình 1) được gắn bằng một bản lề ở phía sau đế của nó với đỉnh giếng thức ăn để chuột có thể dễ dàng đẩy vật đó trở lại (mũi hoặc chân) để tìm kiếm phần thưởng thức ăn trong giếng.

Một khung gỗ (cao 1,8 m so với sàn rộng 1,3 m), được che bằng rèm đen, bao quanh tất cả các phía của khu vực thi để giảm bớt các tín hiệu không gian trong quá trình kiểm tra.

Sự phân biệt đơn giản (chỉ mùi; chỉ đối tượng) và các nhiệm vụ liên kết theo cặp sử dụng quy trình 'đi/không đi'.

Thử nghiệm đầu tiên cho mỗi phiên bắt đầu bằng cách nhốt chuột ở khu vực bắt đầu trong 120 giây để tái thích nghi với mê cung; các thử nghiệm tiếp theo sử dụng 20 giây ở khu vực bắt đầu này. Allrats đã nhận được 12 thử nghiệm hàng loạt mỗi phiên hàng ngày, với sáu thử nghiệm (có thưởng) và sáu thử nghiệm không được thực hiện (không có thưởng) theo thứ tự apseudo-ngẫu nhiên. Không quá ba lần thử hoặc ba lần thử không được thực hiện liên tiếp trong một phiên.

Không có cặp nào trong số bốn cặp kích thích mùi-vật thể khác nhau được lặp lại trong các thử nghiệm liên tiếp. Các mục chính xác trong các nhiệm vụ phân biệt đơn giản và các cặp kích thích chính xác trong các nhiệm vụ liên kết theo cặp là đối trọng giữa các con chuột.

Đối với việc phân biệt mùi đơn giản, phản ứng được xác định là việc mũi chọc vào nắp ở giữa miếng bọt biển đã được khử mùi; chỉ ngửi miếng bọt biển được coi là một phản ứng không được phép. Thức ăn luôn hiện diện trong phần nắp ở giữa miếng bọt biển để thực hiện các nhiệm vụ liên kết mùi-vật thể; Khía cạnh đi/không đi ở đây đề cập đến việc vật thể có được đẩy hay không để tiết lộ liệu phần thưởng đồ ăn có ở dưới nó hay không, ở cuối đường băng.

Đối với đồ vật, phản hồi được định nghĩa là bất kỳ cú đẩy nào bằng mũi hoặc chân làm nghiêng đồ vật về phía sau. Độ trễ tính từ thời điểm cánh cửa cuối cùng được nâng lên và khi con chuột tương tác với mùi (chọc mũi vào nắp; để phân biệt mùi đơn giản) hoặc với vật thể (đẩy lùi vào bản lề, để phân biệt vật thể đơn giản và các nhiệm vụ liên kết theo cặp) là được đo bằng đồng hồ bấm giờ yên tĩnh (Dick Smith, New Zealand).

Người quan sát ngồi trong rèm và cạnh đường băng để vận hành cửa và ghi lại hành vi. Một thử nghiệm được chỉ định là 'chính xác' nếu con chuột phản hồi trong vòng chưa đầy 8 giây trong các thử nghiệm đang thực hiện hoặc không phản hồi trước 8 giây trong các thử nghiệm không thực hiện.

2.6|Phân biệt đơn giản

Một nửa số chuột được huấn luyện nhiệm vụ phân biệt mùi đơn giản, sau đó là phân biệt đối tượng đơn giản và ngược lại đối với nửa còn lại. Độ trễ giữa Cửa X (Hình 1a) và tương tác với mùi hoặc vật thể ở cuối đường băng đã được ghi lại. Chuột được huấn luyện thực hiện nhiệm vụ phân biệt mùi đơn giản và đồ vật đơn giản cho đến khi đạt tiêu chí (chính xác 80% trong 2 ngày liên tiếp).

Đối với nhiệm vụ phân biệt mùi đơn giản, mỗi thử nghiệm chỉ có một mùi duy nhất. Việc phân biệt mùi nào trong hai mùi được kết hợp với phần thưởng thức ăn được đặt trong miếng bọt biển ở cuối Ngăn B (Hình 1a).

Trong nhiệm vụ phân biệt đối tượng đơn giản, một đối tượng duy nhất được trình bày trong mỗi thử nghiệm ở cuối Ngăn B (không được hiển thị trong Hình 1). Therat phải tìm hiểu xem đồ vật nào trong số hai đồ vật đó được ghép nối với phần thưởng thức ăn được đặt dưới đồ vật đó.

2.7|Các tác vụ liên kết theo cặp (dấu vết và không dấu vết) Các tác vụ này sử dụng bố cục mới của các cửa có thể tháo rời theo chiều dọc (Hình 1). Những con chuột đã học được cặp nào trong số hai cặp mùi-vật thể sẽ được thưởng (ví dụ: Mùi 1 + Đối tượng A và Mùi 2 + Đối tượng B) và cặp nào không được thưởng (ví dụ: Mùi 1 + Đối tượng B và Mùi 2 + Đối tượng A).

Bất kể theo cặp nào, chuột luôn nhận được phần thưởng cho việc thể hiện mùi khi được phép vào ngăn thứ hai của đường băng. Đây là ngăn C vì tình trạng 'không dấu vết' trong đó Ngăn A không được sử dụng và Ngăn B là ngăn xuất phát. Mùi ở cuối Ngăn B dành cho tình trạng 'dấu vết', mà Ngăn A được sử dụng làm hộp khởi động.

Những con chuột ở trạng thái có dấu vết phải chịu một độ trễ 10- giây giữa sự xuất hiện của mùi và kích thích vật thể, bằng cách được giữ trong Ngăn C, trong khi những con chuột ở điều kiện không có dấu vết được tiếp xúc với vật thể ngay sau khi chúng tương tác với mùi (sau ăn phần thưởng). Trong cả điều kiện có dấu vết và không có dấu vết, chúng tôi đã ghi lại độ trễ để đi qua Ngăn D, kể từ thời điểm Cửa Z được nâng lên cho đến khi chuột tương tác với vật thể hoặc không được tương tác với vật thể đó trong 8 giây.

Hai nhóm chuột (tổn thương Sham và tổn thương ATN) đã được huấn luyện về các nhiệm vụ liên kết cặp đối tượng theodour–(nhóm Không có dấu vết) và hai nhóm tương ứng được huấn luyện về nhiệm vụ liên kết đối tượng theodour–dấu vết–(nhóm Dấu vết) cho đến khi chúng đạt tiêu chí (thử nghiệm đúng 80% trong 3 ngày) hoặc tối đa là 50 ngày.

2,8|Kiểm tra khả năng duy trì sau mua lại

Việc duy trì nhiệm vụ liên kết theo cặp cho bất kỳ con chuột nào được tiến hành 5 ngày sau khi đạt tiêu chí hoặc sau 50 ngày huấn luyện. Phiên này sử dụng 12 lần thử nghiệm có thưởng/không có thưởng hàng loạt trong một ngày theo cách giống hệt như được áp dụng trước đây cho con chuột đó.

2.9|mô học

2.9.1|Truyền dịch và thu thập mô

Vào 3 ngày trước cuộc kiểm tra khả năng lưu giữ, những con chuột đơn lẻ được làm quen với một chiếc lồng trống, sạch sẽ trong 90 phút trong phòng tối, yên tĩnh. Ngay sau thử nghiệm cuối cùng trong thử nghiệm lưu giữ, con chuột được đặt vào chuồng trong căn phòng tối yên tĩnh quen thuộc 90 phút trước khi truyền dịch.

Chuột được gây mê sâu bằng natri pentobarbital (125 mg/kg) và được tưới máu qua tim bằng nước muối, sau đó là paraformaldehyde [4% PFA trong đệm 0.1 M phosphate (PB)] để cố định não. Não được cố định sau trong 4% PFA, sau đó tối thiểu 48 giờ trong dung dịch dài hạn (20% glycerol trong 0.1 M PB). Các phần vành 40-μm được thu thập bằng máy cắt vi mô đông lạnh (Thermo Fisher, Vương quốc Anh) và được bảo quản trong dung dịch bảo quản lạnh (30% glycerol, 30% ethylene glycol trong 0,1 M PB) ở 20 C cho đến khi được xử lý hóa mô miễn dịch.

Các phần vành được thu thập thành hai loạt riêng biệt. Loạt phim đầu tiên chụp các phần liên tiếp trong năm mẫu lạnh cho hóa mô miễn dịch (tức là một phần năm). Loạt bài này bao gồm một khối phía trước gồm các phần từ vỏ não trước trán đến vùng vách ngăn (khoảng {{0}},7 đến 0,6 mm từ Bregma) và một khối phía sau từ đồi thị giữa (khoảng 3,5 mm từ Bregma) đến đuôi vỏ não sau lách.

Loạt ảnh thứ hai chụp các phần liên tiếp để xác minh tổn thương. Các phần này được thu thập thành bốn phần lạnh từ ngay trước ATN đến đồi thị trung gian sau (khoảng 0,6 đến 3,5 mm tính từ Bregma).

2.9.2|Nhuộm Neu-N và xác minh tổn thương ATN

Các phần nổi tự do trên toàn khu vực ATN được rửa sạch (3 10 phút) trong dung dịch muối đệm photphat 0,1 M với Triton-X (0,2%; PBSTx) trước khi ủ trong dung dịch đệm chặn peroxidase nội sinh trong 30 phút [1% hydro peroxide (H2O2), 50% metanol (CH3OH) trong 2%PBSTx].

Các phần được ủ qua đêm ở kháng thể chính inanti-NeuN 4 C (1:5000; monoclonal-MouseCat# MAB377; Millipore, California USA) trong PBSTx với huyết thanh dê bình thường 1% (NGS; Life Technologies, New Zealand).

Dung dịch đệm kháng thể dư thừa được loại bỏ bằng PBSTx và sau đó ủ trong kháng thể thứ cấp chống chuột đánh dấu biotin của dê (1:1000 Cat# BP-9200-50: VectorLaboratories, California USA) qua đêm ở 4 C trong PBSTx và 1% NGS. Các phần được đặt trong ExtrAvidin (liên hợp peroxidase; 1:1000; Sigma, NSW Australia), PBSTxand 1% NGS trong 2 giờ ở nhiệt độ phòng.

Để loại bỏ ExtrAvidin và Triton X{0}} dư thừa, các phần được rửa trong PBS, PB, sau đó là dung dịch đệm Tris (pH 7,4 trong H2 chưng cất0) để chuẩn bị cho việc hiển thị các phần bằng diaminobenzidine mới được chuẩn bị ( DAB 0,05%; Sigma, trong H2O2 0,01% trong đệm Tris).

Phản ứng DAB (khoảng 5 phút) đã được dừng bằng cách sử dụng dung dịch đệm Tris (rửa 1-10 phút) và các phần được đặt trong PB ở 4 C qua đêm trước khi gắn lên các phiến đã hồ hóa và để khô. Các phiến kính được khử nước bằng cồn đã qua phân loại (70%–100%) trước khi được làm sạch bằng inxylene và gắn với DPX (06522; Sigma-Aldrich) và một lớp phủ.

Số lượng tế bào dương tính với Neu-N trong ATN được sử dụng để xác định mức độ tổn thương. Điều này sử dụng các phần từ cả bán cầu trái và bán cầu phải cho mỗi phần trong bốn phần40-μm trên khắp ATN và khu vực được định lượng bằng ImageJ (NIH, Hoa Kỳ). Nhuộm tế bào dương tính với NeuN được chụp ảnh ở 5 vật kính trên kính hiển vi thẳng đứng LeicaDM6 B và máy ảnh DFC7000T (Leica Microsystems, Đức).

Số lượng tế bào tự động được lấy thông qua ImageJ (phần mềm phân tích hình ảnh, Viện Y tế Quốc gia, NIH, Hoa Kỳ). Vùng xung quanh các nơ-ron thần kinh trong vùng ATN đã được chọn thủ công và hình ảnh được chuyển đổi sang thang độ bit xám {{0}}, nền bị trừ (cuộn=40), chuyển đổi thành mặt nạ và áp dụng chức năng lưu vực, và tất cả các tế bào thần kinh trên ngưỡng (ngưỡng 'MaxEntropy', độ tròn 0.5–1.0) đều được tính.

Ngưỡng phát hiện là như nhau đối với tất cả các phần. Các hạt nhân tế bào được nhuộm NeuN tự động được đếm ở chín con chuột giả (năm con trong nhóm Sham-Trace và bốn con trong nhóm Sham-No Trace) để biểu thị số lượng tế bào trong ATN.

Số lượng tự động của các hạt nhân nhuộm NeuN của các tế bào được bảo vệ ở tất cả các con chuột bị tổn thương ATN được so sánh tương đối với số lượng tế bào NeuN trung bình được quan sát thấy ở những con chuột giả. Các tổn thương có thể chấp nhận được xác định là đạt tiêu chí mất 50% tế bào trong ATN, với mức tối thiểu là 25% trên mỗi bán cầu. Điều này phù hợp với tiêu chí tổn thương ATN trong các nghiên cứu trước đây (Mitchell & Dalrymple-Alford, 2005, 2006; Perryet al., 2018).

2.9.3|Hóa mô miễn dịch Zif268

Các phần nổi tự do được xử lý theo cách tương tự như đối với NeuN, nhưng được ủ trong kháng thể chính Zif268 đa dòng của thỏ (Egr-1; 1:1000 Cat# sc-110; Santa CruzBiotechnology, USA) trong 72 giờ tại 4 C trong PBSTx với 1%NGS, sau đó ủ trong kháng thể thứ cấp kháng thỏ đánh dấu biotin của dê (1:1000: Vector LaboratoriesBA{11}}) qua đêm trong PBSTx và 1% NGS.

Sau khi hiển thị DAB (18 phút), nhuộm tế bào dương tính Zif268-trong từng vùng quan tâm được chụp bằng vật kính 10 bằng kính hiển vi ánh sáng (Leica, Đức). Số lượng tế bào tự động thu được thông quaImageJ ( NIH, USA) theo cách tương tự như các tế bào NeuNposit, ngoại trừ độ tuần hoàn được đặt ở mức 0.65–1.0.

Số lượng tế bào dương tính Zif268-cho tất cả các vùng sử dụng cùng một thuật toán ngưỡng, với từ hai đến sáu phần trên mỗi vùng quan tâm ở mỗi con chuột được định lượng. Số lượng tế bào dương tính Zif268-trung bình trên mm2 trên các phần (từ cả hai bán cầu) trong vùng quan tâm đã được sử dụng.

2.10|Phân tích dữ liệu

ANOVA sử dụng Statistica (v13; Dell Inc.) đã được tiến hành để kiểm tra sự khác biệt trung bình giữa bốn nhóm chuột (Sham-No Trace, Sham-Trace, ATN-No Trace và ATNTrace). Các yếu tố đo lường lặp đi lặp lại đã được thêm vào trong nhiều ngày (RAM và phân biệt đối xử đơn giản), các khối thử nghiệm (nhiệm vụ liên kết theo cặp) và số lượng Zif268 trên các khu vực hoặc tiểu khu vực quan tâm liên quan.

ANOVA cho cả nhiệm vụ phân biệt đối xử đơn giản và RAM đã so sánh bốn nhóm để xác nhận rằng hai nhóm tổn thương Sham và hai nhóm tổn thương ATN phù hợp với nhau, nhưng lưu ý rằng không có thành phần dấu vết nào trong RAM hoặc các nhiệm vụ phân biệt đối xử đơn giản. Đối với cả nhiệm vụ phân biệt đơn giản và nhiệm vụ liên kết theo cặp trên đường băng, việc chuyển đổi đối ứng dữ liệu độ trễ trong các thử nghiệm riêng lẻ đã được sử dụng để đảm bảo tính đồng nhất của phương sai.

Vào bất kỳ ngày thử nghiệm nào, độ trễ được chuyển đổi đã tạo ra độ trễ trung bình cho mỗi lần trong số sáu lần thử không có thưởng và sáu lần thử có thưởng. Đối với các nhiệm vụ phân biệt đơn giản, chúng tôi đã phân tích điểm chênh lệch độ trễ trung bình (trung bình của các thử nghiệm có thưởng trừ đi mức trung bình của các thử nghiệm không có thưởng) nhưng không phân tích riêng các thử nghiệm có thưởng và không có thưởng do lỗi lưu trữ dữ liệu.

Tất cả ba thước đo độ trễ đều có sẵn cho các tác vụ bộ nhớ liên kết theo cặp (thử nghiệm không có phần thưởng, thử nghiệm có thưởng và chênh lệch độ trễ). Để giải thích cho nhiều so sánh và để cân bằng các lỗi Loại I và Loại II, chúng tôi đã sử dụng mức ý nghĩa p < 0.02 cho phân tích hành vi vì có ba thước đo liên quan trong nhiệm vụ liên kết theo cặp (thử nghiệm không có phần thưởng, thử nghiệm có thưởng và chênh lệch độ trễ trung bình).

Có sáu phân tích chính cho các vùng quan tâm đối với biểu thức Zif268, tầm quan trọng trong các phân tích này được đặt ở p < 0.01. Các bài kiểm tra Posthoc Newman–Keuls (NK) đã đánh giá sự khác biệt theo nhóm theo cặp. Phân tích tác động chính đơn giản được sử dụng khi có sự tương tác đáng kể liên quan đến các yếu tố đo lường lặp đi lặp lại.

3|KẾT QUẢ

3.1|Xác minh tổn thương

Tất cả trừ một trong số 18 con chuột bị tổn thương ATN đều đáp ứng tiêu chí apriori là thiệt hại hai bên là 50% đối với ATN và tối thiểu là 25% trên mỗi bán cầu. Thiệt hại hai bên trung bình là 76% trên cả hai nhóm tổn thương ATN (phạm vi: ATN-No Trace, 61%–93%; ATN-Trace, 63%–93%;Hình 2). Con chuột bị loại trừ chỉ có tổn thương thỏa đáng ở một bán cầu (tổng cộng 48%, 75% bên trái và 20% bên phải).

Hình 2d cho thấy số lượng NeuN đối với tế bào thần kinh ATN ở chuột bị tổn thương ATN (M=3388, SD=2024) đều thấp hơn các giá trị được tìm thấy ở chuột bị tổn thương giả (M=15, 339, SD=1065; con số này tương tự với con số được báo cáo bởi Frost và cộng sự, 2020). Tám trong số 17 con chuột bị tổn thương (bốn con ở nhóm Dấu vết và bốn con ở nhóm Không dấu vết) không bị tổn thương ở nhân đồi thị trung gian (MD) hoặc nhân đoàn tụ/rhomboid (Re/Rh), và có tương đối ít thiệt hại đối với những cấu trúc này trong chín con chuột bị tổn thương.

Khi tổn thương MD xảy ra, các mặt trước nằm liền kề với ATN. Vì vậy, thiệt hại MD được đánh giá từ khoảng {{0}},72 đến +2.10 mm từ Bregma, trong đó tỷ lệ mất tế bào dao động từ 0% đến 41% trên toàn bộ nhóm (trung vị=21%). Khi thiệt hại Re/Rh xảy ra, nó cũng nằm gần khu vực ATN, do đó, nó được đánh giá là khoảng 1,08 đến 2,04 mm tính từ Bregma, trong đó nó dao động từ 0% đến 33% (trung vị=6%). Lưu ý rằng các giá trị phần trăm tổn thương này không đại diện cho toàn bộ vùng MD và Re/Rh, vì vùng sau của cả hai hạt nhân đều không bị ảnh hưởng ở tất cả chuột bị tổn thương ATN.

For more information:1950477648nn@gmail.com