Các yếu tố chức năng chống lão hóa và cơ chế của Cistanche Deserticola

[Tóm tắt] Khách quan: Để khám pháyếu tố chức năng chống lão hóavà cơ chế của chất ăn được và dược chấtCistanche Deserticoladựa trên dược lý mạng vàtrong cơ thể sốngthí nghiệm của sinh vật mẫuCaenorhabd viêm Elegans. phương pháp: Mục tiêu tiềm năng của các thành phần chính trongC. sa mạc đã được dự đoán bởi Nền tảng phân tích và cơ sở dữ liệu dược lý của hệ thống y học cổ truyền Trung Quốc (TCMSP), SwissTargetPrediction, GeneCards, Di truyền Mendelian trực tuyến ở người (OMIM) và các cơ sở dữ liệu khác. Các mục tiêu dự đoán được đưa vào nền tảng phân tích mạng STRING để thu được mạng tương tác protein-protein (PPI) của các thành phần hoạt động và mục tiêu bệnh, nhằm sàng lọc các mục tiêu cốt lõi. Phân tích làm giàu con đường của bộ bách khoa toàn thư về bộ gen và bộ gen (KEGG) ở Kyoto đã được sử dụng để dự đoán và phân tích các con đường hoạt động, và mạng lưới con đường thành phần-mục tiêu-hoạt động y học được xây dựng bởi Cytoscape.C. thanh lịchđược chia thành một nhóm trống vàC. sa mạcnhóm có nồng độ khác nhau. Tuổi thọ, khả năng sinh sản và khả năng vận động củaC. thanh lịchđã được quan sát trực tiếp. Hoạt tính của superoxide effutase (SOD), catalase (CAT), glutathione peroxidase (GSH-Px) và hàm lượng malondialdehyd (MDA) và các loại oxy phản ứng (ROS) trongC. thanh lịchđược xác định bằng xét nghiệm kit. Phản ứng chuỗi polymerase định lượng thời gian thực (qRT PCR) được sử dụng để xác định biểu hiện của các gen liên quan đến tuổi thọ và sự thay đổi khả năng chịu stress trongC. thanh lịch. Kết quả: Các yếu tố chức năng tiềm năng có thể tác động lên75các mục tiêu liên quan đến lão hóa, và8protein mục tiêu cốt lõi, bao gồm protein sốc nhiệt HSP90- (HSP90AA1), thụ thể estrogen (ESR1), GTPase HRas (HRAS), protrombin (F2), ma trận metallicoproteinase-2 (MMP2), hexokinase-2 (HK2), sucrase-isomaltase (SI) và maltase-glucoamylase (MGAM), đã được sàng lọc bằng phân tích cấu trúc liên kết. Phân tích KEGG cho thấy Cistanche Deserticola có thể can thiệp vào27các con đường bao gồm con đường truyền tín hiệu estrogen, con đường truyền tín hiệu ung thư, con đường truyền tín hiệu GnRH và con đường truyền tín hiệu insulin để trì hoãn lão hóa.Cistanche Deserticolacó thể kéo dài đáng kể thời gian sống sót trung bình và cải thiện khả năng chống stress oxy hóa củaC. thanh lịch, tăng cường hoạt động của SOD, CAT và GSH-Px, đồng thời giảm sự tích lũy ROS và MDA cũng như biểu hiện củatuyệt vời-2Vàtuổi-1đã giảm đi, trong khi biểu hiện củatuyệt vời-16và các gen mục tiêu hạ nguồn của nó (cỏ dại-3, mtl-1, ý kiến-4,ctl-1Vàctl-2) cũng được tăng lênskn-1và các gen liên quan đến sốc nhiệt (hsf-1, hsp-16.1Vàhsp-16.2). Phần kết luận: Mạng lưới dược lý học được áp dụng để giải thích cơ chế có thể có củaC. sa mạctrong việc chống lão hóa, và nó đã chứng minh rằngC. sa mạccó thể kéo dài tuổi thọ củaC. thanh lịchvà tăng cường khả năng chống căng thẳng. Cơ chế này có thể liên quan đến sự ức chế con đường truyền tín hiệu insulin và kích hoạt các yếu tố phiên mã xuôi dòng của insulin.chết tiệt-16và các gen liên quan đến sốc nhiệt, do đó tăng cường khả năng chống stress oxy hóa củaC. sang trọng.

Từ khóa:Cistanche Deserticola YC Ma; chống lão hóa; yếu tố chức năng; cơ chế; căng thẳng oxy hóa

CHIẾT XUẤT CISTANCHE VỚI 75% GLYCOSIDE

Cistanche Deserticola YC Malà dược liệu cổ truyền quý giá của nước ta. Nó được gọi là "Nhân sâm sa mạc". Nó lần đầu tiên được ghi lại trong "Thần Nông Materia Medica" và được xếp vào loại cao cấp. Nó có vị ngọt, mặn, tính ấm, tác dụng vào kinh thận và ruột già. Y học cổ truyền Trung Quốc cho rằng nó có tác dụng bổ thận dương, bổ sung tinh huyết, dưỡng ẩm cho ruột và nhuận tràng[1]

. Năm 2018, Cistanche Deserticola (sa mạc) đã được đưa vào "Danh mục các chất truyền thống cho cả thực phẩm và dược liệu Trung Quốc" [2], và giá trị của nó trong việc phát triển thành các sản phẩm y tế đã được công nhận. Theo thống kê, tần suất sử dụng Cistanche Deserticola trong các đơn thuốc chống lão hóa và kéo dài tuổi thọ chỉ đứng sau nhân sâm [3]. Nghiên cứu dược lý hiện đại cho thấy Cistanche Deserticola có chất chống oxy hóa, chống lão hóa, chống mệt mỏi, cải thiện trí nhớ và các tác dụng khác đáng kể [4], nhưng các yếu tố chức năng và cơ chế chống lão hóa của nó vẫn chưa rõ ràng. Caenorhabditis elegans (sau đây gọi tắt là tuyến trùng) là sinh vật đa bào có nền tảng di truyền rõ ràng, tuổi thọ tương đối ngắn, sinh sản nhanh, dễ nuôi. Khi tuổi thọ của nó tăng lên, nó biểu hiện kiểu hình lão hóa tương tự như kiểu hình của con người. Các gen, protein và đường truyền tín hiệu của C. Elegans được bảo tồn ở mức độ cao đối với con người.

Nó có sự tương đồng từ 60% đến 80% với gen của con người. Trong những năm gần đây, tuyến trùng đã được sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu chống lão hóa của y học cổ truyền Trung Quốc và y học tự nhiên [5]. Nghiên cứu này sử dụng các phương pháp dược lý mạng để dự đoán các thành phần hoạt tính, mục tiêu và đường truyền tín hiệu của Cistanche Deserticola trong việc trì hoãn lão hóa; sử dụng tuyến trùng làm sinh vật mẫu, bằng cách quan sát tuổi thọ, khả năng sinh sản và các chỉ số tổng thể khác của chúng, những thay đổi về stress oxy hóa, khả năng vận động và mối quan hệ của chúng với tuổi thọ được đo lường. Sự biểu hiện của các gen liên quan, khám phá cơ chế của Cistanche Deserticola trong việc trì hoãn lão hóa và cung cấp thông tin liên quan đến sức khỏe

Cung cấp tài liệu tham khảo cho việc phát triển và ứng dụng các sản phẩm y tế.

1 Chất liệu

1. 1 Dụng cụ

kính hiển vi soi nổi SMZ-168 (công ty Motic); Kính hiển vi huỳnh quang tương phản pha ngược CKX41 (công ty Olympus); Đầu đọc vi mạch Multiskan FC (công ty khoa học Thermo Fisher); Bộ khuếch đại gen phản ứng chuỗi polymerase (PCR) Mycycler, thiết bị PCR định lượng huỳnh quang MJ Mini™ (Công ty Bio-Rad).

1. 2 Thuốc thử

Cistanche Deserticola được thu thập từ cơ sở trồng Cistanche Deserticola Thực hành nông nghiệp tốt (GAP) ở huyện Yutian, Tân Cương. Nó được nhà nghiên cứu Zhang Tiejun của Viện Nghiên cứu Dược phẩm Thiên Tân xác định là Cistanche Deserticola YC Ma; 2ʹ,7ʹ-dichlorodihydrofluorescein este axit dietyl (DCFH DA), 2% NaN3 (Công ty Sigma); Thuốc thử Trizol, bộ tổng hợp cDNA, SYBR Green Kit (Takara Bioengineering Co., Ltd.); bộ superoxide dismutase (SOD), bộ catalase (CAT), bộ glutathione peroxidase (GSH Px), bộ malondialdehyd (MDA) (Công ty TNHH Công nghệ sinh học JianThành Nam Kinh); phản ứng chuỗi polymerase định lượng huỳnh quang (qRT PCR) Các mồi cần thiết được tổng hợp bởi Shanghai Sangon Bioengineering Co., Ltd. và trình tự mồi được trình bày trong Bảng 1.

1.3 Tuyến trùng

10 loại tuyến trùng di truyền khác nhau được sử dụng trong thí nghiệm đều đến từ Trung tâm Di truyền Caenorhabditis. Thông tin chi tiết được thể hiện trong Bảng 2.

2 Phương pháp

2.1 Sàng lọc các yếu tố và mục tiêu chức năng của Cistanche Deserticola

Bằng cách xem xét tài liệu và kết hợp đặc tính trước đây của nhóm nghiên cứu này về nhóm nguyên liệu Cistanche Deserticola, các thành phần hóa học chính và thành phần máu đã được sàng lọc ra [{{0}}]. Vẽ cấu trúc phức hợp trong phần mềm ChemDraw 19.0, nhập cấu trúc đó vào cơ sở dữ liệu SwissTargetPrediction (http://new.swisstargetprediction.ch/) và sử dụng phương pháp so khớp dược điển ngược để thu được kết quả sàng lọc ảo. Đồng thời, Nền tảng phân tích và cơ sở dữ liệu dược lý của hệ thống y học cổ truyền Trung Quốc (TCMSP, https://tcmsp-e.com/tcmsp.php) đã được sử dụng. Sử dụng chức năng tìm kiếm UniProtKB trong cơ sở dữ liệu UniProt (http://www.uniprot.org/) và Đã đánh giá

Swiss-Prot lọc các protein, giới hạn loài là "con người" và sửa protein mục tiêu của hợp chất thành tên gen. Tích hợp các kết quả mục tiêu của hai cơ sở dữ liệu để có được thư viện hợp chất mục tiêu tiềm năng.

2.2 Phân tích dự đoán các mục tiêu liên quan đến lão hóa

Sử dụng cơ sở dữ liệu GeneCards (https://www.genecards.org/) và OMIM (https://omim.org/) để tìm kiếm với các từ khóa "cũ, già, suy đồi, lão hóa, yếu ớt, suy nhược", trong đó GeneCards Genes with điểm lớn hơn hoặc bằng 10% đã được sàng lọc, kết quả của hai cơ sở dữ liệu được hợp nhất, các gen trùng lặp được loại bỏ và cuối cùng đã đạt được các mục tiêu liên quan đến lão hóa. Sau đó kết hợp mục tiêu của các yếu tố chức năng ở mục 2.1 với các mục tiêu liên quan đến lão hóa nêu trên, lấy giao điểm và vẽ biểu đồ Venn.

2.3 Xây dựng mạng lưới tương tác protein-protein (PPI)

Nhập mục tiêu giao nhau thu được vào nền tảng dữ liệu STRING 11.5 (http://string-db.org/), giới hạn loài ở "Homo sapiens", mức độ tin cậy cao nhất của điểm tương tác là 0.900, và có được mạng PPI. Lưu dữ liệu ở định dạng .TSV và nhập vào Cytscope

3. 8.0 phần mềm, điều chỉnh kích thước nút và độ sâu màu với giá trị độ để có được mạng PPI của hoạt chất Cistanche Deserticola và mục tiêu bệnh. Các điểm có ba tham số về mức độ, độ giữa và độ gần đều lớn hơn mức trung bình được chọn làm mục tiêu cốt lõi và thu được tổng cộng 8 mục tiêu cốt lõi sau khi sàng lọc.

2. 4 Phân tích sinh học bản thể gen (GO) và gen và gen Kyoto

Phân tích làm giàu đường dẫn Encyclopedia of Groups (KEGG) sử dụng cơ sở dữ liệu OmicsBean (http://www.omicsbean.cn/login/) để thực hiện phân tích chức năng GO và phân tích làm giàu đường dẫn KEGG trên các mục tiêu giao lộ, sắp xếp theo giá trị P, và Phân tích các con đường kết quả.

2.5 Xây dựng mạng lưới dược liệu-thành phần-mục tiêu-lộ trình

Nhập dược liệu, thành phần, mục tiêu và con đường vào phần mềm Cytscope 3.8.0 để xây dựng mạng lưới con đường-thành phần-đích-mục tiêu-dược liệu Cistanche Deserticola.

2.6 Nuôi tuyến trùng

Tuyến trùng được nuôi cấy ở nhiệt độ 20 sử dụng môi trường NGM (chứa 0,750 g NaCl, 0,625 g tryptone và 4,250 g agar trong 250 mL nước cất hai lần). Escherichia coli OP50 đã tiệt trùng (65 độ, 45 phút) được sử dụng làm nguồn thực phẩm và trải đều trên bề mặt môi trường nuôi cấy NGM. Dùng dung dịch ly giải (5% NaClO, 5 mol·L–1 NaOH) để đồng bộ tuyến trùng và nuôi tuyến trùng đồng bộ đến giai đoạn L4 trong tủ ấm 20 độ. Tuyến trùng giai đoạn L4 được chọn ngẫu nhiên và chia thành nhóm đối chứng (môi trường NGM) và nhóm quản lý Cistanche Deserticola với nồng độ khối lượng khác nhau cho các thí nghiệm.

2.7 Pha chế thuốc

Lấy 10 g dược liệu Cistanche Deserticola, thêm nước cất theo tỷ lệ nguyên liệu-lỏng 1:10, hồi lưu và chiết hai lần, mỗi lần 2 giờ, gộp dịch chiết nước, lọc và cô đặc đến khô dưới giảm áp lực. Dùng nước cất vô trùng pha chế dung dịch mẹ có nồng độ khối lượng 50 mg·mL–1 (tính theo lượng thuốc thô). Sử dụng môi trường nuôi cấy NGM để chuẩn bị các dung dịch có nồng độ khối lượng cuối cùng là 0, 25, 50, 75, 100, 200 và 500 ug·mL–1 để sử dụng sau này.

2.8 Thử nghiệm độc tính

Tuyến trùng N2 được chuyển sang các đĩa petri chứa Cistanche Deserticola với nồng độ khối lượng khác nhau (0, 25, 50, 100, 200, 500 ug·mL–1), 100 trong mỗi nhóm. Ngày dùng thuốc được tính là ngày 0. Thay môi trường chứa thuốc tươi hàng ngày và ghi lại sự chết của tuyến trùng để đạt được phạm vi liều lượng an toàn của Cistanche Deserticola.

2.9 Thí nghiệm ứng suất

Tuyến trùng N2 được chuyển đến các tế bào chứa Cistanche Deserticola với nồng độ khối lượng khác nhau (0, 25, 50, 75 ug·mL–1

) trong đĩa petri, 100 trong mỗi nhóm. Ngày dùng thuốc được tính là ngày 0. Môi trường nuôi cấy chứa thuốc tươi được thay thế hàng ngày. Một thí nghiệm căng thẳng đã được tiến hành vào ngày thứ 7 dùng thuốc. Trong thí nghiệm stress oxy hóa, tuyến trùng từ mỗi nhóm được chuyển sang môi trường NGM (10 μL H2O2 30% được thêm vào mỗi 10 mL môi trường NGM) và tỷ lệ sống sót của tuyến trùng được ghi nhận sau mỗi 30 phút. Trong thí nghiệm stress nhiệt, tuyến trùng được tiếp xúc liên tục ở nhiệt độ 35 độ và được nuôi cấy, tình trạng sống sót của tuyến trùng được ghi lại sau mỗi 2 giờ.

2. 10 Thí nghiệm uốn cong cơ thể

Lấy tuyến trùng N2, nhóm chúng lại và thực hiện các biện pháp xử lý tương tự như trong 2.9. Vào ngày thứ 3 và thứ 7 sau khi dùng thuốc, thí nghiệm uốn cong cơ thể được tiến hành. 20 tuyến trùng được lấy từ mỗi nhóm và số lần uốn cong cơ thể của tuyến trùng trong vòng 30 giây đã được phát hiện và ghi lại.

2. 11 Thí nghiệm bơm họng

Lấy tuyến trùng N2, nhóm và quản lý chúng trong cùng điều kiện như 2.9, đặt 1 tuyến trùng vào mỗi đĩa petri và đặt 5 ống song song cho mỗi nồng độ khối lượng. Quan sát dưới kính hiển vi soi nổi vào các ngày 0, 3 và 7 sau khi dùng. Tần số nuốt của tuyến trùng được quan sát trong 60 giây mỗi lần và số lần bơm hầu họng được ghi lại.

2.12 Thí nghiệm sinh sản

Lấy tuyến trùng N2 giai đoạn L1 và đặt chúng vào môi trường thuốc-thuốc và nuôi cấy chúng đến giai đoạn L4. Sau đó, chuyển chúng sang môi trường chứa thuốc mới mỗi ngày với nồng độ khối lượng khác nhau và đo số lượng trứng tuyến trùng đẻ. Các đĩa cũ chứa trứng được đặt lên. Sau khi nuôi cấy trong 48 giờ ở 20 độ, số lượng con cháu đã được xác định. Mỗi đĩa petri chứa 1 tuyến trùng và 5 ống song song được đặt cho mỗi nồng độ khối lượng.

2.13 Xác định sự tích lũy lipofuscin

Lấy tuyến trùng N2, nhóm lại và tiến hành xử lý tương tự như trong 2.9, mỗi nhóm 100 tuyến trùng. Các thí nghiệm đo lipofuscin được thực hiện vào ngày thứ 7 và 11 sau khi dùng thuốc. 35 tuyến trùng được chọn ngẫu nhiên và đặt trên các tấm agarose 2%, được gây mê bằng 2% NaN3 và sử dụng kính hiển vi huỳnh quang (bước sóng ánh sáng kích thích là 360 ~ 370 nm và ánh sáng phát ra (Bước sóng: 420 ~ 460 nm) Quan sát màu xanh lam tự phát huỳnh quang ở tuyến trùng và sử dụng phần mềm imageJ 1.51 để định lượng cường độ huỳnh quang.

2. 14 Xác định hàm lượng MDA, ROS và hoạt tính enzyme chống oxy hóa

Lấy tuyến trùng N2, nhóm lại và thực hiện các biện pháp xử lý tương tự như trong 2.9, với 100 tuyến trùng trong mỗi nhóm. Vào ngày thứ 7 sau khi dùng, tuyến trùng trên môi trường nuôi cấy của mỗi nhóm được rửa bằng dung dịch natri clorua 0,9% và thu vào ống ly tâm 1,5 mL, đồng nhất trên đá và ly tâm ở tốc độ 3000 r·min{{ 10}} trong 10 phút (bán kính ly tâm 42,5 mm), lấy phần nổi phía trên sau khi ly tâm và sử dụng bộ dụng cụ để đo hoạt độ của hàm lượng SOD, CAT, GSH-Px và MDA. Trong thí nghiệm xác định ROS, tuyến trùng được rửa ba lần bằng dung dịch đệm M9, đặt vào dung dịch DCFH-DA với nồng độ cuối cùng là 10 μmol·L–1 và ủ ở 37 độ trong bóng tối trong 20 phút, lắc 5 phút một lần. phút. Sau đó rửa hai lần bằng đệm M9 và đặt tuyến trùng lên phiến kính. Chụp ảnh bằng kính hiển vi huỳnh quang (bước sóng ánh sáng kích thích 485 nm, bước sóng ánh sáng phát xạ 520 nm) và sử dụng phần mềm ImageJ 1.51 để đánh giá cường độ huỳnh quang tương đối.

2. 15 Hệ số tăng tốc phân rã-16 (DAF-16), sự chuyển vị hạt nhân của SKN-1 và SOD-3, glutathione S-transferase-4 (GST{{ 8}}), protein sốc nhiệt-16. 2 (HSP -16. 2) Trực quan hóa bằng cách sử dụng tuyến trùng chuyển gen TJ356 và LG333 tương ứng cho các thí nghiệm chuyển vị hạt nhân protein DAF-16 và SKN-1.

Tuyến trùng chuyển gen CF1553, CL2166 và TJ375 được sử dụng để xác định sự biểu hiện của protein SOD-3, GST-4 và HSP-16.2. Việc phân nhóm và quản lý cũng giống như ở phần 2.9. Vào ngày thứ 7 sau khi dùng thuốc, kính hiển vi huỳnh quang được sử dụng để chụp ảnh tuyến trùng trong mỗi nhóm và phần mềm ImageJ 1.51 được sử dụng để định lượng cường độ huỳnh quang GFP.

2. 16 Xác định tuổi thọ của tuyến trùng đột biến

Các thí nghiệm được tiến hành bằng cách sử dụng tuyến trùng CF1{13}}38, EU1, PS3551 và DA1116 tương ứng và được chia thành nhóm đối chứng và nhóm quản lý Cistanche Deserticola 75 ug·mL–1. Tỷ lệ sống sót của tuyến trùng ở mỗi nhóm được đếm hàng ngày. 2. 17 Thí nghiệm qRT-PCR: Tuyến trùng N2 giai đoạn L4 được chuyển sang môi trường nuôi cấy NGM (chứa 150 µmol·L–1 pentfluorouracil) chứa Cistanche Deserticola với nồng độ khối lượng khác nhau (0, 25, 50, 75 ug·mL–1), 20 Ủ ở nhiệt độ này trong 6 ngày. Tổng số RNA từ tuyến trùng được chiết xuất bằng phương pháp Trizol và sao chép ngược thành cDNA để định lượng mRNA. Dữ liệu được xử lý bằng phương pháp 2–ΔΔCt và hành động-1 được sử dụng làm gen tham chiếu nội bộ.

2. 18 Phân tích dữ liệu

Phần mềm SPSS 19.{1}} được sử dụng để phân tích thống kê và dữ liệu được biểu thị dưới dạng (-x ± s). Sự khác biệt giữa các nhóm được phân tích bằng ANOVA một chiều và P<0.05 was considered a statistically significant difference.

3. Kết quả

3.1 Các hoạt chất và mục tiêu tiềm năng của Cistanche Deserticola

Bằng cách xem xét tài liệu và kết hợp với nghiên cứu trước đây của nhóm nghiên cứu này, 12 thành phần hóa học bao gồm phenylethanoid glycoside, iridoids và lignan đã được chọn làm hợp chất mục tiêu cho nghiên cứu dược lý mạng. Thông tin cụ thể được hiển thị trong Bảng 3. Sau khi loại bỏ các mục trùng lặp khỏi cơ sở dữ liệu, đã thu được tổng cộng 86 mục tiêu cho 12 hoạt chất tiềm năng.