Khả năng chống oxy hóa và chống lão hóa của công thức peptit (Gal2–Pep) kết hợp với axit galic

Da rất dễ bị lão hóa sớmdo áp lực bên ngoài, do đó, trong nghiên cứu này, công thức peptit, (galloyl)2–KTPPTTP (Gal2–Pep) được tổng hợp bằng cách kết hợp TPPTTP peptit và gallicaxit (GA). Tất cả các peptit được tổng hợp trên 2-nhựa chlorotrityl clorua sử dụng peptit pha rắntổng hợp (SPPS) và được phân tích trên phương pháp ion hóa phun điện tử (ESI)/quadrupole-time-of-flflhệ thống quang phổ khối song song (MS) ight (Q-TOF). Ban đầu, Gal2–Pep không có độc tính dưới nồng độ 100mM với tỷ lệ sống sót của tế bào là 88% đối với tế bào sừng vànguyên bào sợi. Cácloài oxy phản ứng(ROS) hoạt động nhặt rác của Gal2–Pep ổn định hơn so với GA một mình; và sau bốn tuần ở phòngnhiệt độ, nóHoạt động nhặt rác ROSvẫn cao hơn 50 phần trăm. Hơn nữa, công thức peptide,cô gái2–Pep cũng thể hiện tác dụng ức chế elastase trong CCD-1064Sknguyên bào sợitế bào. Dựa trên kết quả của RT-qPCR, nghiên cứu này đã chứng minh rằng Gal2–Pep đã tăng biểu thức của PGC-1a ĐẾNngăn chặnstress oxy hóa, và xác nhận tiềm năng của nó như là mộtchất chống lão hóaquatăng biểu hiện củacollagen loại Ivà bởigiảm biểu hiện của metallicoproteinase ma trận-1 (MMP1). Cácphát hiện thu được củng cố gợi ý rằng công thức peptide được tổng hợp trong nghiên cứu này có thể được sử dụng như mộtchất chống oxy hóa tự nhiênVàchất chống lão hóacho các ứng dụng mỹ phẩm của nó.

Bấm vào đây để biết thêm thông tin về các sản phẩm chống lão hóa Cistanche

1. Giới thiệu

Lão hóa daxảy ra do sự giảm dần và cuối cùng là ngừng phân chia tế bào của tế bào sừng và tế bàonổ bên trong da. Nếp nhăn trên da phát triển khi số lượng tế bào giảm, dẫn đến sự biến tính của ma trận ngoại bào dẫn đến khô và mất đàn hồi.độ nhạy cảm trong da.1 Tổn thương DNA ty thể nội bàovà giảm tốc độ tổng hợp protein cũng xảy ratrong quá trình lão hóa da.2 Lão hóa da có hai con đường chínhcác cách, bên trong và bên ngoài, với việc tiếp xúc với tia cực tím (UV)

một động lực chính củalão hóa bên ngoài. Tia UV phản ứng với các thành phần chính của da, bao gồm lipid, protein và axit nucleic, để tạo ra các loại oxy phản ứng (ROS) dẫn đến tế bàocái chết.3–5 Mức ROS quá mức cũng dẫn đến sự phân cắt vàliên kết bất thường của chuỗi collagen hoặc elastin và thúc đẩy sự biểu hiện của ma trận metallicoproteinase (MMP), chẳng hạn như MMP-1, phá vỡ collagen, dẫn đến nếp nhăn trên da vàđẩy nhanh quá trình lão hóa da.6,7 Do đó, liệu pháp chống oxy hóa để loại bỏROS và kích hoạt tiềm năng ty thể có công dụng bảo vệ da khỏi lão hóa.

Ngoài ROS, elastase có một vai trò quan trọng trong việc mấtđộ đàn hồi của da, phá vỡ elastin, một loại protein quan trọng củama trận ngoại bào.8 Elastin, do độ đàn hồi đáng kể của nóđặc tính, cung cấp độ đàn hồi cho da, trong khi elastase cókhả năng phân cắt elastin và các protein khác.8 Vì vậy, ức chếtion của enzyme elastase có thể là một chiến lược quan trọng cho chảy xệ da thông qua ngăn ngừa sự mất độ đàn hồi của da.

Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã thiết kế một loại vật liệu mới kết hợp cáchệ số kích hoạt gamma thụ thể kích hoạt peroxisome proliferator1-alpha (PGC-1a)-TPPTTP peptit dẫn xuất và axit galic (GA)để sử dụng trong mỹ phẩm chống lão hóa. GA là một chất hóa học thực vật được tìm thấy trong nhiều loại trái cây và rau quả, bao gồm nho, cà chua và trà xanh, được biết là có khả năng chống oxy hóa và kháng khuẩn cao. effv.v.9 Mặc dù GA được sử dụng trong công nghiệp mỹ phẩm và thực phẩm vì những tác dụng có lợi nàyffect, công thức của nó có xu hướng không ổn định.10 Do đó, chúng tôi đã phát triển (galloyl)2–KTPPTTP (Gal2–Pep) để tăng tính ổn định của GA bằng cách liên kết GA với PGC-1a-Dẫn xuất peptit TTPTTP.

Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã tổng hợp một (galloyl)2–KTPPTTP (Gal2– Pep) công thức peptit kết hợp với axit galic và đã được xác nhậntiềm năng của nó như là một chất chống oxy hóa và chống lão hóa.

2. Vật liệu và phương pháp

2.1. Nguyên vật liệu

Dulbecco đã sửa đổiEagle's Medium (DMEM), penicillin/streptomycin, huyết thanh bào thai bò (FBS), phosphate-buffednước muối sinh lý (PBS) và trypsin được mua từ Gibco (Carls

xấu, CA). Hydroxybenzotriazole (HOBt), diisopropyl carbodiimide (DIC), 1,8-diazabicyclo[5.4.0]undec-7-en (DBU),N, N-diisopropylethylamine (DIEA), axit galic vàN-succinyl-tri-alanyl-pnitroanilide được lấy từ Sigma-Aldrich (St. Louis, MO).L-Tạo thành axit amin (Fmoc-Lys (Boc)–OH, Fmoc-Thr (tb)–OH và Fmoc-Pro–OH) đã được mua từ Bead-Tech (Seoul,Hàn Quốc).

2.2. Tổng hợp peptide và peptide kết hợp axit gallic

Tất cả các peptit được tổng hợp trên 2-nhựa chlorotrityl clorua (200mthang đo mol, giá trị thay thế¼ 1,46 mmol gam 1) sử dụng HOBt–Tổng hợp peptide pha rắn qua trung gian DIC (SPPS).

Quá trình tổng hợp peptide bằng phương pháp SPPS được thực hiện với modi nhẹđề cập đến các nghiên cứu trước đây.11–13 2-nhựa chlorotrityl chloride (CTC) được trương nở trong dichloro

metan (DCM, 8 mL) trong 30 phút. Nhựa được rửa bằngdimetylformamit (DMF). Tất cả các phản ứng được thực hiện ở nhiệt độ phòng. Các dẫn xuất axit amin được bảo vệ bởi Fmoc (2 đương lượng(Tương đương), chofiaxit amin đính kèm đầu tiên hoặc 5 đương lượng, đối với các axit amin khác) được kết hợp với DIEA (5 đương lượng, đối với một axit amin đính kèm) hoặc HOBt/DIC (6 đương lượng/5 đương lượng) trong DMF aftơthực hiện bảo vệ Fmoc bằng cách sử dụng 2 phần trăm (v/v) DBU trong DMF (2 lần, 2 phút một lần, 8 mL). Và tất cả các bước được rửa 5 lần bằng DMF. Axit gallic cuối cùng được kết hợp với các peptit gắn với lysine.Sau khi ghép axit gallic, nhựa đượcalọc, rửa sạch,và sấy khô dưới chân không cao. Giải pháp phân tách (TFA:nước khử ion [DI]: TIS¼ 95 : 2,5 : 2,5, v/v/v phần trăm ) được xử lý trong 2 giờđể thu được peptit thô. Các peptit thô được kết tủa và rửa ba lần bằng ete dietyl lạnh.

Phân tích sắc ký lỏng hiệu năng cao pha đảo(RP-HPLC) được tiến hành trên Máy phân tách Waters 2695Mô-đun có cột Capcell Pak C18 (4,6 mm 250mm, 5mm, Shiseido). Pha động bao gồm 0.05% TFA trong H2O (pha động A) và 0.05 phần trăm TFA trong axetonitril (pha động B).

Quá trình rửa giải đạt được bằng cách sử dụng gradient tuyến tính cho thiết bị di độngpha B từ 5% đến 65% trong 30 phút với tốc độtốc độ dòng chảy là 1.0 mL tối thiểu 1. Các đỉnh peptide được phát hiện ở bước sóng 230nm. RP-HPLC bán chuẩn bị được tiến hành trên hệ thống Waters HPLC (Pump 600E, Detector UV-484) với Gemini RP-C18cột (21,2 mm 250mm, 5mm, Hiện tượng). Pha động bao gồm 0.05% TFA trong H2O (pha động A)và 0.05 phần trăm TFA trong axetonitril (pha động B). Quá trình rửa giải đạt được bằng cách sử dụng gradient tuyến tính cho pha động B của7 phần trăm đến 22 phần trăm trong 15 phút tại mộtltốc độ dòng chảy 10 mL tối thiểu 1. Cáccác đỉnh peptide được phát hiện bằng phương pháp trắc quang ở bước sóng 230nm.

Các peptit tổng hợp được hòa tan trong axit formic 5% trong nước và được phân tích trên phương pháp ion hóa phun điện tử (ESI)/tứ cực-thời-gian-của-lquang phổ khối song song ight (Q-TOF)(MS) (TripleTOF6600, ABSciex, Foster City, CA). Các mẫu được tiêm vào hệ thống Q-TOF được trang bịmột nguồn phun nano tại mộtllãi suất 1mtối thiểu 1. ion ESIcác thông số nguồn như sau: điện áp phun ion 1,5 kV, khí rèm ở 10 psi và khí vỏ bọc ở 5 psi. Quang phổ trongchế độ quét toàn bộ và MS/MS được thu thập trong phạm vim/z

100–1200 Da với thời gian tích lũy 25 ms trên mỗi phổ.Năng lượng va chạm tăng từ 10 lên 80. Kết quả làdữ liệu đã được thu thập bằng cách sử dụng Phân tích TF đểkho và tự độngđược chỉ định bởi centroid 80 phần trăm với đỉnh tối thiểu, giảm nhiễu 10 phần trăm , khử đồng vị trung bình với ngưỡng 3 phần trăm, không giảm nhiễu và không làm mịn. Các peptit tổng hợp được xác địnhvới dung sai khối lượng là 0.05 Da và giải trình tự theo cách thủ công sử dụng dung sai MS/MS là 0.01 Đà.

2.3. Nuôi cấy tế bào và xét nghiệm khả năng sống

Tế bào người, người lớn, canxi thấp, nhiệt độ cao (HaCaT)và CCD-1064Sk (da người bình thườngtế bào nguyên bào sợi) làđược nuôi cấy trong DMEM với 10% FBS và 1% penicillin/liên cầu khuẩn. Tế bào được ủ ở 37 C trong buồng không khí ẩm với 5% CO2.Đối với các thử nghiệm khả thi, bộ đếm tế bào-8 (CCK-8, Dojindo Co. Ltd. Bắc Kinh, Trung Quốc) đã được sử dụng. Các ô HaCaT và CCD-1064Skđã được cấy vào 96-các giếng vi đĩa (5 103 tế bào mỗi giếng) và ủ ở 37 C trong 5 phần trăm CO2 trong 24 giờ. Các mẫu nuôi cấy sau đó được tiếp xúc với các nồng độ khác nhau của các peptide hoặc GA đã tổng hợp và được ủ ở 37 C trong 5 phần trăm CO2 trong 24 giờ. Khả năng di độngsau đó được đo bằng CCK-8 theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

2.4. Xác định hoạt tính chống oxy hóa

2.4.1. xét nghiệm DPPH.Hoạt tính chống oxy hóa tổng hợp đượcpeptide và GA được đánh giá riêng lẻ bằng xét nghiệm DPPH. Các xét nghiệm DPPH đã được thực hiện sau một báo cáo trước đó

phương pháp với modi nhỏcation.12,14–16 Đầu tiên, một 0.12 mg mL 1 Dung dịch DPPH được chuẩn bị trong metanol, sau đó 100mL dung dịch DPPH và 100mL trong số các peptide hoặc GA tổng hợp được trộn ở các nồng độ khác nhau ({{0}}.1 mM, 0.05 mM, 0,01 mM và 1mM) trong 96-các giếng vi mạch. Trong một lồng ấp lắc quỹ đạo, cáchỗn hợp được phản ứng trong 30 phút ở 37 C và 100 vòng/phút không cóánh sáng. Độ hấp thụ sau đó được đo ở bước sóng 517 nm và khả năng chống oxy hóa đã được tính toán.

2.4.2. Hoạt động nhặt rác ROS.

Hoạt động nhặt rác ROS nội bào được đánh giá bằng cách sử dụng bộ 2070-dichlorofluorescein diacetate(DCF-DA, Abcam, Hoa Kỳ). Các tế bào HaCaT được cấy vào 96-các đĩa vi giếng (5 103 tế bào mỗi giếng) và ủ ở 37 C trong 24 giờ.After, các nền văn hóa đã được tiếp xúc với các peptide tổng hợp hoặc GA (100mM) và ủ ở 37 C trong 24 giờ. Các tế bào sau đó được tiếp xúc với 10mdung dịch M DCF-DA và ủ trong 30 phút. MỘTftủ, dung dịch được rửa bằng PBS. Cáccác tế bào được phân tích bằng đầu đọc vi bản khi kích thích và

bước sóng phát xạ lần lượt là 485 nm và 530 nm.

Hình 1Bước tổng hợp và xác nhận trình tự của peptide sử dụng thời gian tứ cực củachuyến bay(Q-TOF) khối phổ: (a) quy trình tổng hợp chi tiết (b) TPPTTP, (c) galloyl–TPPTTP, và (d) (galloyl)2–KTPPTTP.

2.5. Xét nghiệm tiềm năng màng ty thể

Thuốc nhuộm JC-1 (Thermo Fisher, Hoa Kỳ) đã được sử dụng cho ty thểxét nghiệm điện thế màng (MmP). Các tế bào CCD-1064Sk và HaCaT đã được gieo vào 96-các giếng vi bản (5 10 3tế bào mỗi giếng)

và ủ ở 37 C và trong 5 phần trăm CO2 trong 24 giờ. phía sauer ủ,các mẫu nuôi cấy được tiếp xúc với các nồng độ khác nhau của các peptit tổng hợp và được ủ ở 37 C trong 5 phần trăm CO2 trong 24 giờ.Thuốc nhuộm JC-1 đã được thêm vào các tế bào CCD-1064Sk và HaCaT đểsản xuất một nồng độ cuối cùng của 10mM. After 10 phút ủ, các tế bào được rửa hai lần với 37 C PBS. Xanh và đỏhuỳnh quangđược đo bằng Variokan LUXĐầu đọc vi bản đa chế độ (ThermoFisher, Hoa Kỳ) tại một cuộc triển lãmga (lBán tại)/khí thải (lem) của 475/530 nm và mộtlBán tại/lemcủa 475/590nm, tương ứng.

2.6. Xét nghiệm hoạt động ức chế Elastase

CCD-1064Tế bào Sk được cấy vào 6-các đĩa giếng và được ủ ở 37 C trong 5 phần trăm CO2 trong 24 giờ. Các mẫu nuôi cấy sau đó được tiếp xúc với nồng độ 100mM của các peptide hoặc GA được tổng hợp và ủ ở 37 C trong 5 phần trăm CO2 trong 24 giờ. Các tế bào được rửa bằng dPBS hai lần và chúng tôi đã thu thập từng tế bào bằng dụng cụ cạo tế bào. MỘTer thêm 0.2 M Tris–HCl (pH 8.0) với 0.1 phần trăm Triton-X vào dung dịch thu đượccác tế bào, các tế bào đã được đồng nhất hóa bằng máy siêu âm. Dung dịch đồng nhất được ly tâm trong 20 phút với tốc độ 3000 vòng / phútvà 4 C. Sau đó, mộtfter lấy phần nổi phía trên, định lượng protein-cation được thực hiện bằng cách sử dụng xét nghiệm protein BCA. Chất đạm cho mỗi ngườimẫu được phân phát tạifinồng độ cuối cùng của 100mgmL 1, VàN-succinyl-tri-alanyl-p-nitroanilide đã được thêm vào tạinồng độ cuối cùng là 1,6 mM và phản ứng ở 36 C trong 1 giờ.Sau đó, độ hấp thụ được đo ở bước sóng 405nm bằng đầu đọc vi bản.

2.7. RT-qPCR

Mức độ mRNA của các dấu hiệu chống lão hóa trong tế bào CCK-1064Skđược đánh giá bằng RT-qPCR. Tổng RNA được thu thập bằng thuốc thử TRIzol (Life Technologies, Carlsbad, CA) và đảo ngược

được sao chép bằng bộ thuốc thử PrimeScript RT (Takara BioInc., Kusatsu, Nhật Bản). Một hệ thống CFX96 (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) và iQ SYBR Green Supermix (Bio-Rad Labora

tories) đã được sử dụng cho RT-qPCR.b-Actin được sử dụng để bình thường hóa mức độ mRNA của collagen loại I, MMP-1 và PGC-1a. 

2.8. Phân tích thống kê

 Dữ liệu được trình bày dưới dạng trung bình độ lệch chuẩn từba phép đo độc lập và được phân tích bằng Student'st-kiểm tra, với mộtp < 0.05 considered to be a signikhông thể khác biệt.

Hỏi thêm:

Email:wallence.suen@wecistanche.com whatsapp: cộng với 86 15292862950