Axit Aristolochic gây xơ hóa và phát quang thận ở chuột
Mar 23, 2022
Trừu tượng:Thận là một trong những cơ quan dễ bị tổn thương do tuổi tác. Nói chung, lão hóa thận đi kèm với xơ hóa thận, là con đường phổ biến cuối cùng của bệnh mãn tínhbệnh thận. Axit Aristolochic (AA), một tác nhân gây độc cho thận, gây ra bệnh thận AA (AAN), được đặc trưng bởi xơ hóa thận tiến triển và suy giảm chức năng. Mặc dù xơ hóa thận có liên quan đến lão hóa thận, liệu AA có gây lão hóa thận hay không vẫn chưa rõ ràng. Mục đích của nghiên cứu này là để điều tra khả năng sử dụng AAN như một mô hình lão hóa thận. Ở đây, chúng tôi đã kiểm tra các yếu tố liên quan đến sự lão hóa trong các mô hình AAN bằng cách sử dụng thường xuyên AA cho chuột C57BL / 6. So với nhóm chứng, nhóm AA đã chứng minh sự lão hóaquả thậnkiểu hình, chẳng hạn như teo thận, suy giảm chức năng thận và xơ hóa mô kẽ ống thận. Ngoài ra, AA thúc đẩy quá trình lão hóa tế bào đặc biệt trongthậnvà tăng biểu hiện mRNA p16 ở thận và hoạt động -galactosidase liên quan đến lão hóa. Hơn nữa, những con chuột được điều trị bằng AA có biểu hiện bất thường về ty thể ở ống gần, cũng như sự tích tụ oxy phản ứng. Klotho, một gen chống lão hóa, cũng bị giảm đáng kể trongthậncủa những con chuột được xử lý AA. Nói chung, kết quả của nghiên cứu này chỉ ra rằng AA làm thay đổi các yếu tố liên quan đến lão hóa, và xơ hóa thận có liên quan chặt chẽ đến lão hóa thận.
Từ khóa:bệnh thận mãn tính; xơ hóa thận; axit Aristolochic; sự lão hóa; sự già đi của tế bào
CISTANCHE SẼ CẢI THIỆN BỆNH KIDNEY / RENAL
Giới thiệuVới tuổi thọ liên tục tăng lên của con người, ngày càng có nhiều người bị suy giảm chức năng do tuổi tác.Thậnthường bị ảnh hưởng bởi tổn thương mô liên quan đến tuổi tác và tỷ lệ mắc bệnh mãn tínhbệnh thậntăng theo tuổi [1]. Lão hóa thận làm tăng tốc độ lão hóa tổng thể, dẫn đến tuổi thọ ngắn hơn. Do đó, nghiên cứu về lão hóa thận là cần thiết, mặc dù các mô hình động vật thích hợp vẫn chưa được phát triển đầy đủ. Lão hóa thận đi kèm với các thay đổi bệnh lý khác nhau, bao gồm teo thận, xơ cứng cầu thận và xơ hóa mô kẽ ống thận [2]. Bệnh xơ hóa mô kẽ ống thận là con đường phổ biến cuối cùng trong hầu hết các dạng bệnh thận tiến triển, điều này cho thấy xơ hóa thận có liên quan chặt chẽ với tuổi già.quả thận. Trong nghiên cứu về lão hóa, chuột là một công cụ đáng tin cậy vì tính chất di truyền gần gũi với con người, khả năng điều khiển bộ gen của chúng và thực tế là chúng biểu hiện các kiểu hình liên quan đến lão hóa tương tự như con người trong suốt thời gian sống của chúng [3]. Các quan sát dọc bằng cách sử dụng chuột lai là lý tưởng để làm mô hình lão hóa, mặc dù việc theo dõi chuột để đạt được tuổi thọ trọn vẹn của chúng sẽ tốn nhiều thời gian. Ngoài ra, có một số mô hình chuột bị biến đổi gen về lão hóa. Chuột thiếu Klotho là một mô hình lão hóa sớm được sử dụng trong nghiên cứu lão hóa. Tuy nhiên, trong mô hình này, chức năng thận không bị ảnh hưởng, và một số cơ quan khác ngoài thận bị suy giảm [4]. Do đó, mô hình chuột này có thể không thích hợp cho nghiên cứu về lão hóa thận.Sử dụng axit Aristolochic (AA) gây ra một loại tổn thương thận cụ thể được gọi là bệnh thận AA (AAN), được đặc trưng bởi xơ hóa mô kẽ rộng [5,6]. AA là chất độc đối với biểu mô ống thận vì nó thúc đẩy sự hình thành các chất bổ sung DNA trong các mô thận [7]. AA không có khả năng ảnh hưởng đến các cơ quan khác ngoài hệ tiết niệu và có thể hữu ích cho việc đánh giáquả thận-các thay đổi cụ thể. Do đó, AA thường được sử dụng để thiết lập mô hình xơ hóa thận ở chuột [8,9]. Tuy nhiên, vẫn chưa rõ liệu những thay đổi do AA gây ra có liên quan đến sự lão hóa ởthận. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã kiểm tra các kiểu hình liên quan đến tuổi và các yếu tố phân tử trong AAN ở chuột
Kết quả 2.1. Sử dụng AA gây giảm cân đáng kể, teo thận và suy giảm chức năng thậnTrọng lượng cơ thể ban đầu (BW) và huyết áp tâm thu (HA) giống hệt nhau giữa nhóm kiểm soát phương tiện và nhóm AA. BW trong nhóm điều khiển xe tăng liên tục trong 8 tuần. Tuy nhiên, tăng cân bị ức chế bởi sử dụng AA, và nhóm AA có BW thấp hơn đáng kể ở 4 và 8 tuần sau khi bắt đầu sử dụng AA (Hình 1A). Không có sự khác biệt đáng kể về HA tâm thu hoặc nhịp tim giữa nhóm kiểm soát phương tiện và nhóm AA (Hình 1B, C). Tỷ lệ trọng lượng tim / BW cho thấy không có sự khác biệt giữa các nhóm ở thời điểm 8 tuần sau khi bắt đầu sử dụng AA (Hình 1D), trong khiquả thậnTỷ lệ cân nặng / BW thấp hơn đáng kể ở nhóm AA vào thời điểm 8 tuần sau khi bắt đầu sử dụng AA (Hình 1E). Tiếp theo, chúng tôi kiểm tra chức năng thận ở nhóm kiểm soát phương tiện và nhóm AA. Nồng độ creatinine và urê nitơ trong huyết tương (UN) ở nhóm AA cao hơn đáng kể so với nhóm kiểm soát phương tiện vào thời điểm 8 tuần sau khi bắt đầu sử dụng AA. Ngoài ra, điều trị AA làm giảm đáng kể độ thanh thải creatinin so với nhóm kiểm soát phương tiện ở thời điểm 8 tuần sau khi bắt đầu sử dụng AA (Hình 1F – H).
2.2. Quản lý AA gây ra xơ hóa mô kẽ ống dẫn trứng quá mức và điều chỉnh đáng kể sự biểu hiện gen liên quan đến xơ hóa ở thậnKiểm tra mô học bằng phương pháp nhuộm axit-Schiff (PAS) định kỳ cho thấy diện tích cầu thận giảm đáng kể ở nhóm AA so với nhóm kiểm soát xe (Hình 2A). Bệnh xơ hóa mô kẽ rộng rãi, được đánh giá bằng phương pháp nhuộm Masson trichrome (MT), được quan sát thấy ở nhóm AA (Hình 2B), cũng như với sự điều chỉnh nồng độ mRNA của các gen liên quan đến xơ hóa thận, collagen I và III, và yếu tố tăng trưởng biến đổi ( TGF) - (Hình 2C – E).
2.3 Quản lý AA Tăng tốc độ phát triển tế bào, rối loạn chức năng ty thể và tích lũy phản ứng Oxy / gen Các loài (ROS) trong thậnĐể đánh giá sự lão hóa của tế bào, chúng tôi đã kiểm tra sự biểu hiện mRNA ở thận của p53, p21, p16 và glutaminase (GLS), Nhóm AA đã chứng minh mức mRNA cao hơn đáng kể của các gen liên quan đến sự lão hóa này trongthận(Hình 3A-D). Hơn nữa, cường độ nhuộm -galactosidase (SA - - gal) liên quan đến lão hóa trongthậnđược tăng lên ở nhóm AA và hầu như không có ở nhóm kiểm soát phương tiện (Hình 3E). Ở nhóm AA, kính hiển vi điện tử cho thấy sự biến mất của các vết nứt ty thể, phân mảnh ty thể, không bào tương bào và các tự phân bào trong tế bào ống gần, đồng thời với điều hòa giảm BCL2 / adenovirus E1B 19- kDa protein tương tác 3 (Bnip3), một gen liên quan đến ty thể (Hình 3FG). Biểu hiện mRNA ở thận của Nox2. một thành phần của nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADPH) oxidase, đã tăng lên đáng kể ở nhóm AA so với nhóm điều khiển xe (Hình 3H). Hơn nữa, phân tích Western blot cho thấy mức 4- hydroxy -2- danh nghĩa (4- HNE) trong thận đã tăng lên đáng kể ở nhóm AA (Hình 3I). Những kết quả này chỉ ra rằng việc sử dụng AA gây ra sự già đi của tế bào, rối loạn chức năng ti thể và tích tụ ROS trongthận.
2.4. AA Giảm Biểu hiện Protein Klotho ở thậnChúng tôi đã kiểm tra biểu hiện thận của các protein chống lão hóa trong nhóm kiểm soát phương tiện và nhóm AA. Biểu hiện Klotho giảm đáng kể ở nhóm AA so với nhóm kiểm soát xe (Hình 4A), trong khi biểu hiện thận của nicotinamide phosphoribosyltransferase (NAMPT) và sirtuin1 (SIRT1) là tương tự giữa các nhóm (Hình 4B, C).
3. Thảo luậnTheo hiểu biết của chúng tôi, nghiên cứu này là nghiên cứu đầu tiên tập trung vào việc đánh giá các thay đổi liên quan đến lão hóa thận trong AAN bằng cách sử dụng các dấu hiệu lão hóa, chẳng hạn như hoạt động gal p16 và SA - -. Điều trị AA thúc đẩy teo thận, xơ hóa mô ống thận và suy giảm chức năng thận, đi kèm với việc điều chỉnh mRNA p16 ở thận và nhuộm SA - - gal dương tính. Hơn nữa, nhóm AA đã chứng minh các đặc điểm của các cơ chế liên quan đến lão hóa ở thận như bất thường ty thể, tăng stress oxy hóa và giảm điều hòa gen chống lão hóa, Klotho. Tổng hợp lại, các quan sát của chúng tôi cho thấy rằng việc sử dụng AA mãn tính một phần bắt chước sự lão hóa của thận.
Sự lão hóa của tế bào là sự ngừng lại vĩnh viễn của sự tăng sinh tế bào để phản ứng với các yếu tố gây căng thẳng khác nhau, chẳng hạn như tổn thương DNA, và góp phần vào quá trình lão hóa và các bệnh liên quan đến lão hóa. Sự biểu hiện của p16, một chất ức chế kinase phụ thuộc cyclin, có liên quan đến sự lão hóa ở các cơ quan khác nhau, bao gồm cả thận. Giới hạn calo làm tăng tuổi thọ bằng cách ức chế biểu hiện pl6 [1 0]. Ngoài ra, việc loại bỏ p 16- biểu hiện tế bào già ở chuột INK-ATTAC thông qua tiêm AP20187, một chất đồng phân protein liên kết FK 506- [11], gây ra sự suy giảm các kiểu hình lão hóa ở thận, chẳng hạn như xơ cứng cầu thận và thận suy giảm chức năng. Do đó, p16 là một trong những yếu tố quan trọng nhất liên quan đến lão hóa. Tế bào hình lưỡi liềm có thể được phát hiện bằng cách nhuộm SA - - gal, cho thấy hoạt tính -galactosidase tăng lên ở pH 6,0 [12] và là dấu ấn sinh học được sử dụng rộng rãi của các tế bào già và trung niên. Sự biểu hiện mRNA của pl16 trong thận tăng lên ở chuột giàthậnvà kèm theo tăng hoạt tính SA - - gal ở biểu mô thận [13I. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã chứng minh tăng biểu hiện mRNA p16 ở thận và nhuộm màu SA - -, chỉ ra rằng AA gây lão hóa thận. GLS gần đây đã được báo cáo là cần thiết cho sự tồn tại của các tế bào già thông qua tăng cường phân giải glutamino và trung hòa pH nội bào [14]. Việc ức chế quá trình phân giải glutamino phân giải phụ thuộc GLS ở chuột già đã được chứng minh là có thể loại bỏ các tế bào già và cải thiện các rối loạn chức năng cơ quan liên quan đến tuổi. Trong nghiên cứu này, việc điều chỉnh mRNA GLS ở thận cho thấy sự tích tụ tế bào tuổi già trong nhóm ở thận. Do đó, sử dụng AA mãn tính gây ra sự già đi của tế bào trong thận.
CISTANCHE SẼ CẢI THIỆN CHỨC NĂNG KIDNEY / RENAL
Ngoài sự lão hóa của tế bào, rối loạn chức năng ty thể là một cơ chế thiết yếu cơ bản gây tổn thương mô liên quan đến tuổi tác và đi kèm với sự tích tụ ROS [15,16. Rối loạn chức năng ty thể thúc đẩy và duy trì sự lão hóa của tế bào [17] trong khi sự lão hóa của tế bào góp phần trực tiếp vào sự rối loạn chức năng của ty thể [18]. Bnip3, nằm chủ yếu ở màng ngoài ty thể, có thể đóng một vai trò trong việc điều hòa ty thể ở các tế bào ống thận nuôi cấy để đáp ứng với stress oxy hóa và tình trạng thiếu oxy. Ở những con chuột già, việc hạn chế calo làm tăng quá trình tự động ở các tế bào hình ống, thông qua việc điều chỉnh Bnip3, và cải thiện sự thoái hóa chức năng thận do tuổi tác [19]. Trong nghiên cứu này, kính hiển vi điện tử cho thấy các đặc điểm bất thường của ty thể có thể bị ảnh hưởng bởi sự giảm biểu hiện Bnip3 ở thận hoặc sự lão hóa của tế bào. Ti thể là nguồn nội bào chính của ROS. Để đánh giá tác động của các bất thường ty thể đối với ROS ở thận, chúng tôi đã kiểm tra sự tích tụ ở thận của 4- HINE và chứng minh sự tích tụ ROS do AA gây ra trongthận.NADPH oxidase là một nguồn chính của ROS. Trong giai đoạn cấp tính của AAN ở chuột, biểu hiện mRNA của Nox2 ở thận tăng lên, và sự sẵn có của oxit nitric bị giảm, dẫn đến tình trạng thiếu oxy và thiếu máu cục bộ kéo dài [20. Ở chuột giàthận, sự tích tụ ROS đi kèm với sự gia tăng biểu hiện của Nox2 [21]. Những phát hiện này cho thấy AA có thể tạo ra các loại pheno liên quan đến tuổi tác thông qua sự tích tụ ROS do rối loạn chức năng ti thể và điều hòa các oxy hóa NADPH.
Sự biểu hiện gen Klotho ở thận đã giảm ở nhóm AA, trong khi sự biểu hiện của NAMPT và SIRTl là tương tự giữa các nhóm. Klotho là một gen chống lão hóa mã hóa một protein xuyên màng một lần hoạt động như một chất ức chế lão hóa. Quá trình lão hóa ở chuột thiếu Klotho tương tự như ở người, bao gồm tuổi thọ ngắn hơn, vô sinh, xơ cứng động mạch, teo da, loãng xương và khí thũng [22]. Chuột Klotho đột biến dị hình cũng biểu hiện kiểu hình lão hóa nhanh, được phục hồi bằng cách cắt bỏ p16 [23]. Vì Klotho là một yếu tố quan trọng trong quá trình lão hóa, chuột biến đổi gen Klotho đã được sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu về lão hóa. Tuy nhiên, những con chuột biến đổi gen Klotho có thể không thích hợp cho nghiên cứu về lão hóa thận do những suy giảm liên quan đến lão hóa toàn thân của những con chuột này và thực tế là chức năng thận không được kiểm tra (tức là mức creatinin). Ngược lại, mô hình chuột AAN có thể được sử dụng như một mô hình lão hóa thận do thuốc cho mục đích nghiên cứu, vì nó có một số ưu điểm, chẳng hạn như tương đối dễ thực hiện và khả năng ước tính tác động của các can thiệp đối với sự suy giảm chức năng thận. .
Nghiên cứu hiện tại có một số hạn chế. Chúng tôi đánh giá quá trình lão hóa của thận, chủ yếu tập trung vào sự lão hóa của tế bào, hình thái ty thể và biểu hiện gen liên quan đến lão hóa. Tuy nhiên, các cơ chế của lão hóa rất phức tạp và vẫn còn chưa được hiểu rõ. Ngoài ra, mặc dù biểu hiện gen Klotho giảm khi phản ứng với AA, chúng tôi không thể chứng minh mối quan hệ nhân quả với những thay đổi bệnh lý trong AAN. Các nghiên cứu sâu hơn được yêu cầu để xác định vai trò của các phân tử khác nhau liên quan đến sự phát triển của AAN. Tuy nhiên, nghiên cứu này cung cấp những hiểu biết mới về việc sử dụng Avan như một mô hình lão hóa thận. Điều quan trọng cần lưu ý là những thay đổi kiểu hình trongquả thậncó liên quan chặt chẽ với tuổi thọ. Mặc dùquả thậndễ bị ảnh hưởng bởi những thay đổi liên quan đến lão hóa, ức chế lão hóa thận có thể kéo dài tuổi thọ tổng thể. Do đó, nghiên cứu sâu hơn về lão hóa thận bằng cách sử dụng các mô hình AAN có thể dẫn đến tăng tuổi thọ trong tương lai.
4. Vật liệu và Phương pháp4.1. Loài vậtNghiên cứu này được thực hiện theo hướng dẫn của Viện Y tế Quốc gia về việc sử dụng động vật thí nghiệm. Tất cả các thí nghiệm trên động vật đã được Ủy ban Nghiên cứu Động vật của Đại học Thành phố Yokohama phê duyệt (Số phê duyệt: FA 20-027) và được tiến hành tuân thủ các nguyên tắc ARRIVE. Các nỗ lực đã được thực hiện để giảm thiểu số lượng động vật được sử dụng và sự đau khổ của chúng. Chuột được nuôi trong môi trường được kiểm soát theo chu kỳ 12- h sáng / 12- h tối ở nhiệt độ 25 độ C. Chuột được tiếp cận tự do với thức ăn và nước uống.
CISTANCHE SẼ CẢI THIỆN NHIỄM SẮC KIDNEY / RENAL
Những con chuột đực C57BL / 6 tám tuần tuổi được mua từ Phòng thí nghiệm Charles River (Wilmington, MA, Hoa Kỳ) và được chỉ định cho nhóm điều khiển phương tiện hoặc nhóm AA sau 1 tuần làm quen, những con chuột được tiêm trong màng bụng bằng phương tiện hoặc AA (Sigma -Aldrich, St.Louis, MO, USA), được hòa tan trong một lượng nhỏ dimethyl sulfoxide. Trước nghiên cứu này, chúng tôi đã tiến hành một nghiên cứu sơ bộ bằng cách sử dụng một số giao thức. Quy trình đầu tiên bao gồm tiêm AA (3 mg / kg) cho chuột C57BL / 6 trong phúc mạc hai lần một tuần trong 4 tuần mà không cần thời gian tái tạo; trong phác đồ này, AA gây ra các tổn thương thận cấp tính rõ ràng, chẳng hạn như các ống lượn gần bị giãn và mất đường viền bàn chải (Hình S1 bổ sung). Trong phác đồ thứ hai, chuột C57BL / 6 được tiêm AA (2,5 mg / kg) trong phúc mạc mỗi tuần một lần trong 4 tuần, sau đó là thời gian tái tạo trong 4 tuần; creatinine huyết tương ở những con chuột này là 0. 19 ± {{2 0}}. 0 80 mg / dL so với 0,18 ± 0,010 mg / dL (điều khiển phương tiện so với AA, tương ứng; trung bình ± sai số chuẩn của giá trị trung bình (SEM), p=0. 86, thử nghiệm t của Sinh viên không được ghép nối, n=4 mỗi nhóm) và UN huyết tương là 31,3 ± 5,95 mg / dL so với 30,4 ± 3,87 mg / dL (điều khiển phương tiện so với AA, tương ứng; trung bình ± SEM, p=0. 90, thử nghiệm t của Học sinh không ghép đôi, n=4 cho mỗi nhóm). Do đó, chúng tôi xác định rằng phác đồ này không phù hợp với mô hình tổn thương thận vì AA không gây suy giảm chức năng thận đáng kể. Trong phác đồ thứ ba, chuột C57BL / 6 được tiêm AA (3 mg / kg) trong phúc mạc hai lần một tuần trong 10 tuần mà không cần thời gian tái tạo; ở những con chuột này, tỷ lệ tử vong ở nhóm AA là 83 phần trăm (n=6), trong khi không có con chuột nào trong nhóm điều khiển phương tiện bị chết (n=4). Trong quy trình này, chúng tôi không thể đánh giá thống kê kiểu hình thận do AA gây ra vì tỷ lệ tử vong cao. Trong phác đồ thứ tư, chuột C57BL / 6 được tiêm AA (3 mg / kg) trong phúc mạc hai lần một tuần trong 4 tuần, sau đó là thời gian tái tạo trong 4 tuần; Các tổn thương thận mãn tính, chẳng hạn như xơ hóa mô kẽ ống dẫn trứng, và suy giảm chức năng thận đã được quan sát thấy ở những con chuột này [9]. Do đó, dựa trên kết quả của những điều tra sơ bộ này, chúng tôi đã áp dụng quy trình thứ tư để thực hiện các thí nghiệm trong nghiên cứu này.
4.2.Đo lườngBPHA tâm thu và nhịp tim được đo bằng phương pháp đo vòng bít đuôi đã mô tả trước đây (BP-Monitor MK -2000; Muromachi Kikai Co., Tokyo, Japan) [24,25]. Tất cả các phép đo được thực hiện trong khoảng thời gian từ 9: 00 đến 14: 00. Ít nhất 10 phép đo đã được thực hiện trên mỗi con chuột và giá trị trung bình được sử dụng để phân tích.
4.3. Phân tích PCR phiên mã ngược lượng tử định lượng trong thời gian thực RNA tổng số được chiết xuất từ các mô thận bằng ISOGEN (Nippon Gene, Tokyo, Japan), và DNA bổ sung (cDNA) được tổng hợp bằng cách sử dụng SuperScript IⅢFirst-Strand System (Invitrogen, Waltham, MA, USA). Phân tích PCR phiên mã ngược định lượng theo thời gian thực được thực hiện bằng Hệ thống phát hiện PCR thời gian thực cảm ứng CFX96 (Phòng thí nghiệm Bio-Rad, Hercules, CA, Hoa Kỳ) và các sản phẩm phiên mã ngược được ủ với TaqMan PCR Master Mix và TaqMan tùy chỉnh thăm dò (Hệ thống sinh học ứng dụng, Waltham, MA, Hoa Kỳ), như đã mô tả trước đây [26]. Các đầu dò TaqMan chống lại các gen tiếp nối đã được sử dụng: collagen I (Mm 00801666_ g1), collagen II (Mm 01254476_ m1), TGF- (Mm01178819 m1), p53 (Mm00441964 g1), p21 ( Mm04205640 g1) .p16 (Mm00494449 m1) GLS (Mm 01257297_ m1), Bnip3 (Mm 01275600_ g1) và Nox2 (Mm 00627011_ m1) .mRNA đã chuẩn hóa các mức của ARN ribôxôm 18S.
4.4. Phân tích Western Blot Sự biểu hiện của protein được phân tích bằng phương pháp phân tích Western blot của các mô đồng nhất bằng phương pháp đã mô tả trước đây [27,28]. Tổng số chất chiết xuất protein được chuẩn bị từ các mô bằng cách sử dụng đệm mẫu có chứa natri dodecyl sulfat. Nồng độ protein của mỗi mẫu được đo bằng Bộ xét nghiệm protein tương thích với chất tẩy rửa (Phòng thí nghiệm Bio-Rad, Hercules, CA, Hoa Kỳ) và NanoDrop One (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, Hoa Kỳ), với albumin huyết thanh bò là Tiêu chuẩn. Một lượng bằng nhau của chiết xuất protein từ các mẫu mô đã được phân đoạn trên 5-20 phần trăm polyacrylamide gel (ATTO Corp., Tokyo, Japan). Các protein đã tách sau đó được chuyển sang màng polyvinylidene difluoride bằng Hệ thống chuyển bán khô (ATTO Corp., Tokyo, Japan). Các màng được chặn trong 1 giờ ở nhiệt độ phòng bằng dung dịch muối đệm phosphat có chứa 5% sữa bột gầy. Các màng được ủ với các kháng thể chính chống lại Klotho (ab 181373 1: 1000; Abcam, Cambridge, UK), NAMPT (sc -67020 1: 5000; Abcam), SIRT1 (07-131 1: 1000, MilliporeSigma , Burlington, MA, Hoa Kỳ), 4- HINE (MHN-100P 1: 1000; JaICA, Fukuroi, Nhật Bản) và glyceraldehyde -3- phosphate dehydrogenase (GAPDH) (2118, 1: 2000; Công nghệ tín hiệu tế bào, Danvers, MA, Hoa Kỳ). Màng được rửa sạch và ủ với kháng thể thứ cấp trong 60 phút ở nhiệt độ phòng. Các vị trí cho phản ứng kháng thể-kháng nguyên được hình dung bằng cách sử dụng chất nền phát quang hóa học tăng cường (Merck, Kenilworth, NJ, USA) .GAPDH được sử dụng làm chất kiểm soát tải lượng. Hình ảnh được phân tích định lượng bằng ChemiDoc Touch (Phòng thí nghiệm Bio-Rad, Hercules, CA, Hoa Kỳ).
4.5. Phân tích mô học đã được thực hiện như đã mô tả trước đây [29]. Các mô thận của chuột được cố định bằng 4% paraformaldehyde và sau đó được nhúng vào parafin. Các phần (dày 4 um) được nhuộm bằng các vết PAS và MT. Để đánh giá diện tích cầu thận, 50 cầu thận trên mỗi con chuột được đo và lấy trung bình. Tất cả hình ảnh được thu thập bằng kính hiển vi BZ -9000 (Keyence Corp., Osaka, Nhật Bản).
CISTANCHE SẼ CẢI THIỆN PHÂN TÍCH KIDNEY / RENAL
4.6. SA - - al Nhuộm Các mô thận của chuột được đông lạnh nhanh chóng và gắn kết trong một hợp chất có nhiệt độ cắt tối ưu （Sakura FinetekJapan, Co., Ltd., Tokyo, Japan）. Phần dày （4 μm） được chuẩn bị bằng cách sử dụng máy lạnh (HM 550- VPD; Thermo Fisher Scientific) và được gắn vào các lam kính. Hoạt động gal - - SA được đo bằng bộ công cụ phát hiện tuổi già (Bio Vision Inc., Milpitas, CA, Hoa Kỳ) theo các giao thức của nhà sản xuất. Các mẫu được xem dưới trường sáng ở độ phóng đại × 100 bằng kính hiển vi BZ -9000 (Keyence Corp .. 4.7. Kính hiển vi điện tửPhân tích bằng kính hiển vi điện tử được thực hiện như đã mô tả trước đây [3 0]. Những con chuột được gây mê bằng isoflurane và được truyền dịch qua vòm động mạch chủ bên phải với nước muối sinh lý đã được gan hóa (5 U / mL) và 2,5% glutaraldehyde trong dung dịch đệm phosphat 0,1 mol / L ở pH 7,4. Các mẫu vật dùng cho kính hiển vi điện tử truyền qua được ngâm trong 1 phần trăm osmium tetroxide trong 2 giờ, khử nước lần lượt trong etanol, và nhúng vào hỗn hợp Epon. Các phần UlItrathin được nhuộm bằng uranyl axetat và xitrat chì và được kiểm tra bằng kính hiển vi điện tử truyền qua Hitachi H -7500 hoạt động ở 80 kV (Hitachi, Ltd., Tokyo, Nhật Bản). Các phần được quan sát ở độ phóng đại × 5000 và được chụp ảnh bằng camera của thiết bị tích điện.
4.8 Phân tích Hóa sinhCác mẫu máu được thu thập bằng cách chọc thủng tim ở trạng thái được cho ăn. Các mẫu máu toàn phần được ly tâm ở tốc độ 3.000 vòng / phút (MR -150; Tomy Seiko Co., Ltd., Tokyo, Nhật Bản) trong 10 phút ở 4 độ để tách huyết tương. Các mẫu huyết tương kết quả được lưu trữ ở -80 độ. Nồng độ creatinin huyết tương, UN và creatinin niệu được đo bằng máy phân tích tự động Hitachi 7180 (Hitachi, Ltd., Tokyo, Nhật Bản).
4.9. Phân tích thống kê Các phân tích thống kê được thực hiện bằng phần mềm GraphPad Prism (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA). Dữ liệu được trình bày dưới dạng trung bình ± SEM. Bài kiểm tra f của Học sinh không ghép đôi được sử dụng để so sánh sự khác biệt giữa nhóm điều khiển phương tiện và nhóm AA.p<0.05 was="" considered="" statistically="">
5. Kết LuậnNguyên nhân quản lý AAquả thậnlão hóa, cùng với xơ hóa mô kẽ và teo thận. Các kết quả cho thấy xơ hóa thận có liên quan chặt chẽ đến lão hóa thận và AAN có thể hữu ích như mộtquả thận-mô hình lão hóa cụ thể.
