Tác dụng có lợi của phần tổng số phenylethanoid Glycoside được phân lập từ Cistanche Deserticola lên vi cấu trúc xương ở chuột bị cắt bỏ buồng trứng Ⅰ

Nghiên cứu này được thiết kế để ước tính hoạt tính chống loãng xương của tổng phần phenylethanoid glycoside được phân lập từC. sa mạc(CDP) trên chuột gây ra bởi phẫu thuật cắt bỏ buồng trứng (OVX) cũng như các cơ chế liên quan. Sau 3 tháng dùng đường uống,giảm mật độ khoáng xương, Ca và P huyết thanh ở chuột OVX đã được phục hồi và cấu trúc phân tử bị thoái hóavi kiến ​​trúc xươngđược cải thiện một phần nhờ can thiệp CDP (60, 120 và 240 mg/kg), hoạt động của các dấu hiệu tiêu xương được điều chỉnh giảm và hoạt tính sinh học của chỉ số hình thành xương được điều chỉnh tăng; trong khi đó, hàm lượng MDA giảm và GSH tăng lên khi xử lý CDP. Về mặt thành phần, 8 hợp chất phenylethanoid glycoside đã được xác địnhFied trong CDP, với tổng số lượng nội dungFiđạt 50,3% khi sử dụng phương pháp HPLC. Về mặt cơ học, CDP đã giảm mức TRAF6, RANKL và RANK, do đó ngăn chặn RANKL/RANK/TRAF6-gây ra sự kích hoạt của NF- xuôi dòngκCác con đường truyền tín hiệu B và PI3K/AKT và cuối cùng là ngăn chặn hoạt động của các protein tạo cốt bào quan trọng của NFAT2 và c-Fos. Tất cả các dữ liệu trên ngụ ý rằng CDP thể hiện lợi íchFichính thứcFfảnh hưởng đến cấu trúc vi mô xương ở chuột bị cắt bỏ buồng trứng, và những tác động nàyFfvv có thể liên quan đến NF-κĐường dẫn tín hiệu B và PI3K/AKT được kích hoạt bởi sự liên kết của RANKL, RANK và TRAF6.

CISTANCHE HỮU CƠ TỰ NHIÊN CHO TĂNG TRƯỞNG XƯƠNG

1. Giới thiệu

Chứng loãng xương sau mãn kinh, căn bệnh mà cứ 3 phụ nữ trên 50 tuổi thì có 1 người mắc phải, đang trở thành mối nguy hiểm chính đối với sức khỏe của hơn 200 triệu phụ nữ trên toàn thế giới [1]. Ở thời kỳ mãn kinh, nồng độ estrogen giảm mạnh thường dẫn đến sự tiêu xương quá mức do tăng cường tạo xương; sau đó, sự cân bằng giữa sự hình thành xương do nguyên bào xương gây ra và sự tạo xương do hủy cốt bào gây ra.sự tiêu xươngbị gián đoạn, và quá trình tiêu xương tăng tốc cuối cùng gây ra chứng loãng xương và thậm chí gãy xương hông hoặc cột sống [2]. Người ta tin rằng sự biệt hóa của hủy cốt bào được kích hoạt khi chất kích hoạt thụ thể của yếu tố hạt nhân kappa B (RANK) liên kết với RANKL, phối tử của RANK. Tuy nhiên, sự kết hợp giữa RANK với RANKL không thể được kích hoạt trừ khi yếu tố liên quan đến thụ thể yếu tố hoại tử khối u protein 6 (TRAF6) được tham gia vào nó [3], sau đó là sự kích thích các đường truyền tín hiệu xuôi dòng bao gồm PI3K/AKT và NF-κB . Cuối cùng, các biểu hiện của yếu tố hạt nhân của tế bào T hoạt hóa c2 (NFAT2) và c-Fos đã được điều chỉnh [4] để điều chỉnh sự biệt hóa của tế bào hủy xương cũng như sự tiêu xương. Do đó, các yếu tố và chất điều hòa có liên quan trực tiếp hoặc gián tiếp đến sự kích hoạt và biệt hóa của hủy cốt bào được cho là mục tiêu quan trọng để ngăn ngừa mất xương.

Thực tế, có một số loại thuốc trị liệu thay thế hormone tổng hợp và lâm sàng như estradiol valerate có hiệu quả trong điều trị loãng xương sau mãn kinh. Thật không may, một số trong số này làm tăng nguy cơ mắc các bệnh ung thư nghiêm trọng bao gồm ung thư vú và nội mạc tử cung [5], khiến ứng dụng lâm sàng của chúng bị hạn chế. Vì vậy, cần phải lựa chọn các phương pháp thay thế khác vừa hiệu quả vừa ít tác dụng phụ. Các loại thuốc truyền thống của Trung Quốc (TCM), cũng như các hợp chất và phân đoạn có hoạt tính sinh học phân lập [6–9], đã được chứng minh là có hiệu quả đối với nhiều bệnh khác nhau bao gồm chứng loãng xương sau mãn kinh. Trong số các thành phần và phân đoạn có hoạt tính sinh học này, các hợp chất phenylethanoid glycoside (PhG) có hiệu quả tiềm năng được cho là tác nhân đầy hứa hẹn trong điều trị loãng xương [10–12]. Cấu trúc của PhG bao gồm axit cinnamic aglycone, một nhóm hydroxyl phenyl ethyl được kết hợp với -glucopyranose, apiose, galactose, rhamnose hoặc xyloza thông qua liên kết glycosid. Chúng tồn tại rộng rãi trong các loài dược liệu thuộc chi Cistanche [13]. Cistanche Deserticola YC Ma là một TCM chính thức được ghi nhận trong dược điển Trung Quốc, và bên cạnh việc là một TCM quan trọng [14], C Deserticola còn là một loại thảo mộc bổ dưỡng chống lão hóa với ít tác dụng phụ đã được phát triển thành rượu thuốc và chất lỏng dinh dưỡng được phê duyệt bởi Cục Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Nhà nước. Dựa trên hồ sơ của dược điển Trung Quốc, C. Deserticola theo truyền thống được người bản địa sử dụng để điều trị các vấn đề thiếu hụt tinh chất thận như suy nhược cơ và yếu thắt lưng, và các hợp chất phenylethanoid glycoside bao gồm echinacoside và acetonide là thành phần hoạt tính sinh học chính trong loại thảo mộc này. Theo thuyết TCM “thận-thận-xương”, hệ thống xương được chi phối bởi tinh chất thận [15], và các vấn đề liên quan đến xương như loãng xương có thể được phục hồi bằng các loại thảo mộc hoặc hợp chất có hoạt tính nuôi dưỡng tinh thận. Do đó, chúng tôi đưa ra giả thuyết rằng tổng phần phenylethanoid glycoside được phân lập từ C. Deserticola, ít nhất một phần, có lợi trong điều trị loãng xương. Do đó, thí nghiệm hiện tại đã được nghĩ ra để xác thực giả thuyết của chúng tôi bằng cách sử dụng mô hình chuột bị cắt bỏ buồng trứng (OVX); Bên cạnh các dấu hiệu hình thành và tiêu hủy xương phải được ước tính, chỉ số chống oxy hóa cũng như các đường dẫn tín hiệu RANKL/RANK/TRAF6- do PI3K/AKT và NF-κB tạo ra cũng được sử dụng để nghiên cứu các cơ chế chính của hoạt tính sinh học chống loãng xương .

2. Vật liệu và phương pháp

2.1. Nguyên liệu thực vật và chuẩn bị.

Tổng cộng 30 kg thân cây Cistanche Deserticola YC Ma đã được thu thập từ huyện Yongning vào ngày 2 tháng 9015 với tọa độ 106.026597 và 38.262816, Tỉnh Ninh Hạ, Trung Quốc. Loại thảo dược này đã được xác định bởi Tiến sĩ Lin Dong (Khoa Dược, Đại học Y Ninh Hạ) và một mẫu vật tương ứng (#20150901) đã được bảo quản tại Khoa của Phân tích Dược phẩm. Đầu tiên, 30.0 kg C. Deserticola dạng bột được chiết xuất bằng phương pháp hồi lưu với 70% etanol làm dung môi; tỷ lệ vật liệu và dung môi được đặt là 1:10 và thời gian hồi lưu là 2 giờ trong 3 lần. Sau đó, tất cả dịch lọc được gộp lại và cô đặc dưới áp suất giảm ở 60 độ C. Thứ hai, cột nhựa xốp lớn AB-8 được sử dụng để tách sơ bộ và sử dụng các tỷ lệ ethanol trong nước khác nhau (0%, 20%, 30%, 40%, 50% và 60%, mỗi loại 60 L) được sử dụng để rửa giải. Thứ ba, các dung dịch rửa giải 40% và 50% được kết hợp và tinh chế thêm bằng cách sử dụng các cột nhựa xốp AB-8 lặp lại với các dung dịch rửa giải 0%, 20%, 30%, 40% và 50% etanol trong nước, và mỗi dung dịch rửa giải là 12 L. Cuối cùng, phần 40% được thu lại và cô đặc dưới áp suất giảm để thu được 150 g phần cặn phenylethanoid glycoside màu vàng nhạt của C. Deserticola (CDP, hiệu suất là 0,5%). Đối với các thí nghiệm in vivo, dung môi CMC-Na 0,5% được sử dụng để hòa tan CDP; cho động vật uống bằng đường uống được ấn định là 1 mL/100 g trọng lượng cơ thể; để phân tích Western blot in vitro, CDP được hòa tan với DMSO và sau đó được pha loãng với DMEM để thu được nồng độ cuối cùng là 0,1 mg/mL, 0,01 mg/mL và 0,001 mg/mL.

2.2. Hóa chất và dung môi.

Estradiol valerate (EV) đến từ Delpharm Lille SAS, Pháp; phosphatase kiềm (ALP),gla-protein xương(BGP), bộ dụng cụ ELISA liên kết ngang axit kháng tartrate (TRAP) và deoxypyridinoline (DPD) từ Công ty TNHH Kỹ thuật sinh học Xinyu, Thượng Hải, Trung Quốc, 201605; malondialdehyd (MDA, 20181221), super oxit effutase (SOD, 20121218) và bộ thuốc thử glutathione (GSH, 20181221) từ Viện Kỹ thuật Sinh học Kiến Thành Nam Kinh, Nam Kinh, Trung Quốc; lntact parathormone (l-PTH, NEWASHE7UZ), calcitonin (2L9ISN7AIU) và bộ dụng cụ ELISA liên kết ngang thụ thể liên quan đến estrogen (ERR, Y3AY8QEWB3) từ Elabscience Biotechnology Co. Ltd., Vũ Hán, Trung Quốc; bộ thuốc thử ELISA cathepsin K của BioVision, Mỹ, 1l300141; kháng thể chính của RANKL (GR3193842-5), RANK (AA02113656), TRAF6 (2), c-Fos (AG12059411), NFAT2 (AO11015648), NF-κBp65 (AH04138226), PI3 kinase p85 alpha (AC09021266), AKT 1 (AF05173234), -actin (17AV0411) và kháng thể thứ cấp của IgG kháng dê kết hợp peroxidase với cải ngựa từ ZSGB-BIO, Trung Quốc, 136080; bộ xét nghiệm protein BCA tổng số và bộ dụng cụ thương mại để phát hiện sự hình thành tế bào xương và huyết thanh bào thai bò và môi trường Eagle's sửa đổi (DMEM) của Dulbecco từ HyClone, Logan, UT, Hoa Kỳ; màng polyvinylidene fluoride (PVDF) của Millipore Life Sciences, Billerica, MA, USA; penicillin và streptomycin từ Gibco, Rockville, MD, Hoa Kỳ. Tất cả các tác nhân hóa học khác được sử dụng đều thuộc loại AR.

2.3. HPLC Định lượng CDP.

Một thiết bị HPLC Agilent 1220 đã được sử dụng để xác định và định lượng thành phần của CDP. Các điều kiện sắc ký như sau: cột C18 (TSK-GEL, 4 6 I d × 250 mm, 5 m); rửa giải gradient chứa dung môi A (acetonitril) và B (nước chứa 0,5% axit axetic) (0-10 phút: 17-20% A; 10-30 phút: 20-25% A; và 30-40 phút: 25-30% A); bước sóng phát hiện là 333 nm; nhiệt độ môi trường xung quanh; tốc độ dòng chảy là 1,0 mL/phút; thể tích tiêm mẫu là 5 μL. Tám hợp chất PhG, cụ thể là cistanoside F, echinacoside, 6′-acetylacteoside, cistanoside C, cistanoside A, Acteoside, 2′-acetylacteoside và isoacteoside, đã được xác định; bằng cách sử dụng các chất tham chiếu tương ứng và phương pháp tiêu chuẩn bên ngoài, hàm lượng của 8 PhG trên đã được định lượng bằng phân tích HPLC (Hình 1).

Hình 1: Dấu vân tay HPLC của CDP. Tám hợp chất phenylethanoid glycoside đã được tìm thấy trong phần này và tổng hàm lượng được định lượng là 50.7%. Các hợp chất và hàm lượng của chúng như sau: (1) Acteoside F (3,6%), (2) echinacoside (8,8%), (3) cistanoside A (5,0%), (4) Acteoside (13,3%), (5) isoacteoside (3,3%), (6) Acteoside C (3,6%), (7) 2′-acetylacteoside (9,9%) và (8) 6′-acetylacteoside (3,2%).

2.4. Nghị định thư thí nghiệm động vật.

Tổng cộng có 60 chuột cái Sprague-Dawley trưởng thành trong 3 tháng tuổi được chọn từ trung tâm thử nghiệm động vật của Đại học Y Ninh Hạ, với trọng lượng cơ thể ban đầu trung bình khoảng 234 ± 25 g. Những con chuột được nuôi trong một môi trường tiêu chuẩn cụ thể không có mầm bệnh nhằm thích nghi trong 1 tuần. Sau đó, tất cả chuột chỉ được gây mê (chloral hydrat, 100 mg/kg, ip) hoặc cắt bỏ buồng trứng giả (SHAM), hoặc cắt bỏ cả hai buồng trứng và sau đó chia ngẫu nhiên thành 5 nhóm nhỏ: điều trị bằng đường uống bằng tá dược (0,5% CMC-). Na) được đặt làm nhóm mẫu (OVX), estradiol valerate (1 mg/kg/ngày) là nhóm dương tính (EV), và CDP 60, 120 và 240 mg/kg/ngày là thấp (CDPL), nhóm liều trung bình (CDPM) và liều cao (CDPH). Tất cả chuột được cho uống hàng ngày và kéo dài trong 3 tháng với liều lượng được điều chỉnh 2 tuần một lần tùy thuộc vào sự thay đổi của trọng lượng toàn cơ thể. Vào ngày cuối cùng của thí nghiệm trên động vật, nước tiểu được lấy trong 24-giờ bằng cách sử dụng lồng trao đổi chất; huyết thanh được thu thập từ động mạch đùi của chuột được gây mê; xương đùi, xương chày bên phải và tất cả các cơ quan được mổ xẻ và bảo quản ở nhiệt độ -80 độ C để phân tích thêm. Các thí nghiệm trên động vật mà chúng tôi tiến hành đã được Ủy ban Chăm sóc và Sử dụng Động vật Thể chế của Đại học Y Ninh Hạ phê duyệt.

2.5. Xác định mật độ khoáng xương và phân tích Micro-CT.

Đầu tiên, người ta sử dụng máy đo hấp thụ tia X năng lượng kép (Lunar, Hoa Kỳ) để ước tính tổng mật độ khoáng xương ở xương đùi phải của mỗi con chuột; thứ hai, xương đùi tương tự đã được sử dụng để ước tính hình ảnh 3D của vi cấu trúc xương xốp bằng cách sử dụng thiết bị quét micro-CT (GE, Mỹ). Độ phân giải đẳng hướng được đặt là 14 μm để thu được hình ảnh 3D lý tưởng; vùng quan tâm (ROI) đã được chọn bằng cách đặt cùng tọa độ trong tấm tăng trưởng của xương đùi của mỗi mẫu; và các thông số hình thái xương bao gồm phân tách phân tử (Tb.Sp), số lượng phân tử (Tb.N), độ dày phân tử (Tb. Th), hàm lượng khoáng chất xương (BMC), mật độ khoáng mô (TMD) và hàm lượng khoáng chất mô (TMC) ) thu được bằng cách phân tích ROI.

2.6. Xét nghiệm sinh hóa huyết thanh và nước tiểu.

Hoạt tính của cathepsin K, TRAP, SOD và GSH trong huyết thanh, cũng như hàm lượng PTH, calcitonin, ERR, MDA, BGP và DPD trong nước tiểu trong huyết thanh, được xác định bằng cách sử dụng bộ thuốc thử tương ứng theo hướng dẫn của nhà sản xuất và mức độ phosphatase kiềm (ALP) và hàm lượng canxi (Ca) và phốt pho (P) trong huyết thanh và nước tiểu được ước tính bằng cách sử dụng máy tự động (Ciba-Corning 550 Diag nostics Corp., Oberlin, OH, USA).

2.7. Phân tích Western Blot.

Các tế bào hủy cốt bào được tạo ra bằng cách sử dụng tế bào RAW 264,7 được bổ sung yếu tố kích thích khuẩn lạc đại thực bào (MCSF) và RANKL. Tóm lại, 1 × 107 tế bào RAW 264,7 được nuôi cấy trong đĩa giếng 6-với sự có mặt của 30 ng/mL MCSF và 25 ng/mL RANKL. Sau 6 ngày cảm ứng, các tế bào hủy cốt bào trưởng thành được xác định bằng phương pháp nhuộm TRAP với bộ kit tương ứng, sau đó xử lý bằng CDP (0.1, 0.01 và 0,001 mg/mL tương ứng) trong 24 giờ; sau đó, tế bào được ly giải bằng dung dịch đệm ly giải chứa 0,5 mmol phenylmethylsulfonyl fluoride, chất ức chế protease và phosphatase. Sau đó, lysate được tách bằng cách sử dụng 10% SDS-PAGE và chuyển sang màng PVDF, được thử nghiệm với AKT1, NF-κB-p65, RANKL, PI3K p85 , RANK, NFAT2, TRAF6, c-Fos và -actin ( 1 : 400) sau khi chặn bằng sữa không béo 5% trong 2 giờ. Các màng tương tự được tách ra và thử lại lần lượt với 9 kháng thể tương ứng ở trên, sau đó được phần mềm Image Lab phát hiện ở cuối. Các thí nghiệm được lặp đi lặp lại ba lần.

2.8. Phân tích thống kê.

Tất cả dữ liệu thu được từ các thí nghiệm in vivo và in vitro, được mô tả là giá trị trung bình ± SD, được phân tích bằng cách sử dụng ANOVA một chiều, sau đó là thử nghiệm của Dunnett (phần mềm SPSS 22.0, SPSS, USA); p < 0 05 có ý nghĩa thống kê.

Dịch vụ hỗ trợ của Wecistanche

Email:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/Điện thoại:+86 15292862950

Mua sắm để biết thêm thông số kỹ thuật

https://www.xjcistanche.com/cistanche-cửa hàng