Màng Nanocellulose vi khuẩn có hoạt tính sinh học được làm giàu với Eucalyptus Globulus Labill. Chiết xuất nước lá cho các ứng dụng chăm sóc da chống lão hóa

Xin vui lòng liên hệoscar.xiao@wecistanche.comđể biết thêm thông tin

Trừu tượng:Màng nanocellulose (BNC) của vi khuẩn, với các đặc tính vật lý và cơ học đáng chú ý, nổi lên như một chất mang các hợp chất hoạt tính sinh học đa năng tạo thành hạt sinh học cho các ứng dụng chăm sóc da. Trong nghiên cứu này, BNCmembranes đã được nạp glycerol (như chất làm dẻo và giữ ẩm) và các liều lượng khác nhau (1-3 ug cm -2) của một chiết xuất dạng nước thu được từ quá trình chưng cất thủy phân của Eucalyptus globulus Labill. lá (HDE), để ứng dụng như mặt nạ dạng tấm. Tất cả các màng đều có khả năng chống chịu và rất dễ uốn ở trạng thái khô và ướt, với các đặc tính cơ học tương tự hoặc thậm chí tốt hơn so với mặt nạ BNC thương mại. Hơn nữa, HDE đã được tìm thấy để cung cấp hoạt động chống oxy hóa phụ thuộc vào liều lượng cho BNC tinh khiết. Ngoài ra, sau 3 tháng bảo quản ở 22-25 độ và độ ẩm tương đối 52 phần trăm (RH) hoặc ở 40C và 75 phần trăm RH, người ta đã xác nhận rằng hoạt động chống oxy hóa và khía cạnh vĩ mô của màng với 2 ug cm {{10 }} của HDE đã được duy trì. Màng cũng được chứng minh là không gây độc tế bào đối với tế bào HaCaT và NIH / 3T3, và màng với 2ug cm -2 HDE gây ra sự giảm đáng kể hoạt động -galactosidase liên quan đến lão hóa trong tế bào NIH / 3T3. Những phát hiện này cho thấy sự phù hợp và tiềm năng của các màng thu được làm mặt nạ hoạt tính sinh học cho các ứng dụng chống lão hóa.

Vui lòng bấm vào đây để biết thêm

Từ khóa:nanocellulose vi khuẩn; Bạch đàn Labill. lá; dung dịch nước; hoạt động chống oxy hóa; mặt nạ dạng tấm; chống lão hóa; ứng dụng chăm sóc da

1. Giới thiệu

Dân số thế giới đang già đi đáng kể do tỷ lệ sinh giảm và tỷ lệ sống được cải thiện, kéo theo sự gia tăng tuổi thọ trung bình, gắn liền với những phát triển về y tế và công nghệ đạt được trong những thập kỷ qua [1,2]. Dân số toàn cầu từ 60 tuổi trở lên dự kiến ​​sẽ đạt khoảng 2,1 tỷ người vào năm 2050, tăng gần gấp đôi so với năm 2017 và số người từ 80 tuổi trở lên dự kiến ​​sẽ tăng gần gấp ba lần trong cùng thời kỳ 3]. Tuy nhiên, mặc dù tuổi thọ được cải thiện, sự lão hóa của da là một quá trình không thể tránh khỏi, và do đó, nhu cầu ngày càng tăng đối với các sản phẩm chăm sóc da chống lão hóa được mong đợi.

Lão hóa da là một quá trình sinh học phức tạp kết hợp giữa cơ chế nội sinh và ngoại sinh [4]. Lão hóa nội sinh chủ yếu được xác định bởi các yếu tố di truyền và sự thay đổi nội tiết tố xảy ra cùng với quá trình lão hóa thông thường [4]. Mặt khác, lão hóa ngoại sinh là trung gian của các yếu tố bên ngoài (ví dụ, tiếp xúc quá mức với bức xạ tia cực tím (chụp ảnh), trọng lực, hút thuốc, ô nhiễm và dinh dưỡng kém) [5]. Trong cả hai quá trình lão hóa, nhưng đặc biệt là quá trình ngoại sinh, người ta chấp nhận rõ ràng rằng sự gia tăng căng thẳng oxy hóa, gây ra bởi các loại oxy phản ứng (ROS) và do sự mất cân bằng giữa sản xuất ROS và khả năng bảo vệ chống oxy hóa, đóng một vai trò quan trọng [{{3} }]. Theo tuổi tác, khả năng sửa chữa DNA bị hư hỏng của các tế bào da người cũng bị suy giảm, điều này cũng góp phần vào quá trình lão hóa da [8].Chiết xuất Cistanche chống bức xạDo đó, quá trình lão hóa gây ra một số thay đổi sinh hóa trong thành phần da, ảnh hưởng đến cấu trúc và chức năng của da [9], dẫn đến các dấu hiệu dễ nhận thấy như nhăn, khô, mất độ đàn hồi, mỏng, kết cấu thô hoặc sắc tố không đều [7,10] . Do đó, với sự theo đuổi ngày càng tăng về sức khỏe và hạnh phúc, trong đó sức khỏe và thẩm mỹ làn da cũng được bao gồm, sự phát triển của mỹ phẩm tích hợp các hợp chất hoạt tính sinh học để ngăn ngừa hoặc làm giảm lão hóa da và các dấu hiệu bên ngoài của nó, do đó cải thiện vẻ ngoài của da, đã được đi đầu trong nghiên cứu và đổi mới trong ngành công nghiệp mỹ phẩm trong những thập kỷ qua. Trong bối cảnh này, và trong số các loại mỹ phẩm để điều trị tại chỗ, mặt nạ làm đẹp và đặc biệt là mặt nạ dạng tấm, là một thị trường đang phát triển, với tốc độ tăng trưởng kép hàng năm (CAGR) dự kiến ​​là 8,1% từ năm 2019 đến năm 2027 [11]. Loại mặt nạ này đặc biệt thu hút người tiêu dùng hiện đại, phần lớn là do ứng dụng đơn giản và dễ dàng, sử dụng nhanh và hiệu quả] 12. Một số vật liệu có thể được sử dụng làm ma trận hỗ trợ của những tấm mặt nạ này, cụ thể là polyme tổng hợp (ví dụ: poly (rượu vinyl) và silicone, vải (ví dụ: vải không dệt và bông), hydrogel (ví dụ: hydrogel dựa trên collagen và tơ tằm) ) hoặc sợi nano xenlulo, chẳng hạn như nanocellulose vi khuẩn (BNC) [13]. Với nhu cầu ngày càng tăng đối với các sản phẩm chăm sóc da có nguồn gốc tự nhiên, BNC đã trở nên thích hợp và giờ đây trở thành một vật liệu dựa trên sinh học cao cấp, đã được khám phá và thương mại hóa bởi một số các công ty mỹ phẩm hàng đầu (ví dụ, Lancome, Elizabeth Arden, và DHC) [14] đang theo xu hướng nhu cầu của người tiêu dùng theo định hướng xanh.

Bacterial nanocellulose is an extracellular polysaccharide produced by several non-pathogenic bacteria from different genera (e.g., Komagataeibacter (formerly Gluconacetobacter), Agrobacterium, Rhizobium, Escherichia, and Aerobacter), through fermentation in the presence of oxygen and carbon sources(e.g., glucose)[1516]. BNC is synthesized in the air-culture medium interface as an ultrafine 3D nanofiber network, showing high water content(>90%), tính ưa nước cao và cấu trúc dạng nanô [17]. Khi được sản xuất trong môi trường nuôi cấy tĩnh, BNC thu được dưới dạng màng giống như hydrogel sền sệt với độ dày thay đổi và hình dạng của bình nuôi cấy (viz. Tính khuôn in situ), đây là một lợi thế khi mong muốn có hình dạng xác định trước [18]. Tập hợp các đặc tính độc đáo của BNC cũng bao gồm độ kết tinh và độ tinh khiết cao, độ bền cơ học đáng kể và độ ổn định nhiệt [19]. Bên cạnh khả năng phân hủy sinh học, BNC cũng đã chứng minh khả năng chịu đựng tốt của da và khả năng tương thích sinh học trong một số nghiên cứu in vivo [20-22], khiến nó trở thành vật liệu lý tưởng cho các sản phẩm chăm sóc da. Về vấn đề này, và do cấu trúc nano xốp của nó, khả năng ứng dụng và hiệu quả của BNC như một chất mang để cung cấp các hợp chất có hoạt tính trên da đã là trọng tâm của một số công trình, ví dụ, để cung cấp caffeine [23], silk-sericin [24], retinol [25], hoặc rutin [26]. Để đọc thêm, một đánh giá gần đây cung cấp một cái nhìn tổng quan toàn diện về tính linh hoạt và khả năng ứng dụng của BNC trong mỹ phẩm xanh, bao gồm như một chất vận chuyển các chất hoạt động cho da [27].

cistanche có thể chống lão hóa

Các hợp chất hoạt tính sinh học tự nhiên được sử dụng rộng rãi trong mỹ phẩm chăm sóc da chống lão hóa [28].cistanche herbaĐặc biệt, chiết xuất thực vật là một nguồn phong phú các hợp chất hoạt tính sinh học (ví dụ, polyphenol, terpenoit, vitamin, trong số những chất khác) với nhiều tác dụng tiềm ẩn trên da, với các hoạt động chống oxy hóa và kháng khuẩn của tác dụng ức chế tyrosinase là những lợi ích chính được báo cáo cho đến nay [ 29]. Do đó, với xu hướng hiện nay đối với các sản phẩm tự nhiên trong mỹ phẩm, chiết xuất thực vật xuất hiện trong số các thành phần hứa hẹn nhất cho sự phát triển của các sản phẩm chăm sóc da. Hơn nữa, việc kết hợp các chiết xuất tự nhiên vào màng BNC cũng đã được nghiên cứu cho mục đích thẩm mỹ. Ví dụ như các công trình báo cáo sự kết hợp của chiết xuất keo ong, được biết là có hoạt tính khử trùng và làm se [13,30], chiết xuất từ ​​yến mạch và hương thảo có tác dụng dưỡng ẩm [13], hoặc công thức mỹ phẩm bao gồm quả Adansonia digitata, hoa Hibiscus sabdariffa, Coffea arabica seedcake, quả Kigelia Africana, và chiết xuất từ ​​cây Acacia và Crocus chrysanthus, có đặc tính chống lão hóa, cụ thể là làm mờ nếp nhăn [21]. Gần đây, một đánh giá đã đưa ra một cái nhìn sâu sắc về tầm quan trọng của việc kết hợp BNC với phenol thực vật để ngăn ngừa tổn thương da do tia UV gây ra [31].

Bạch đàn Labill. cây thường xanh là một nguồn nổi tiếng của các hợp chất hoạt tính sinh học, cụ thể là các hợp chất phenolic như axit phenolic, flavonoid hoặc tannin có thể thủy phân [32-36]. Các hoạt động chống oxy hóa và kháng khuẩn của chiết xuất E.globulus có chứa các hợp chất này đã được chứng minh trong một số nghiên cứu [34,35]. Liên quan đến ứng dụng trong lĩnh vực mỹ phẩm, một nghiên cứu gần đây đã chứng minh tác dụng bảo vệ, cả in vitro (ở nguyên bào sợi da của người) và in vivo (chuột không có lông), của chiết xuất etanolic 50% từ sinh khối E.globulus thương mại khô chống lại sự hình ảnh do tia UV gây ra. , với kết quả đầy hứa hẹn liên quan đến việc ngăn ngừa sự hình thành nếp nhăn và khô da [37]. Tuy nhiên, theo hiểu biết của chúng tôi, chiết xuất E.globulus chưa bao giờ được khám phá, kết hợp với chất nền cao phân tử, để sản xuất mặt nạ dưỡng da hoạt tính sinh học để chăm sóc da chống lão hóa.

Với quan điểm này, mục đích của công việc hiện tại là sản xuất các hạt nhớ BNC chứa một chất chiết xuất dạng nước có nguồn gốc từ quá trình chưng cất hydro (hydro-chưng cất chiết xuất, HDE) của lá E.globulus. Chưng cất bằng hydro là một phương pháp thường được ngành công nghiệp sử dụng để chiết xuất tinh dầu [38]. Ngoài ra, glycerol (G), một thành phần giữ ẩm được sử dụng rộng rãi trong mỹ phẩm [39], cũng được kết hợp vào màng BNC (7,5 mg cm -2) ​​để tăng tính linh hoạt và đồng thời, tính phù hợp của chúng đối với làn da. Vì vậy, mục tiêu của công việc này là thu được một vật liệu hoàn toàn dựa trên sinh học với các đặc tính chức năng để ứng dụng tiềm năng như một loại mặt nạ dạng tấm chống lão hóa. Màng BNC được nạp với các liều lượng khác nhau của chiết xuất chưng cất thủy được đặc trưng về hình thái, tính chất cơ học, độ ổn định nhiệt và khả năng hút ẩm. Hơn nữa, hoạt động chống oxy hóa hóa học của các màng khác nhau cũng được đánh giá, cũng như độc tính tế bào in vitro của chúng (trong tế bào sừng của người và các dòng tế bào nguyên bào sợi của chuột). Ngoài ra, tính ổn định hoạt động chống oxy hóa sau 3 tháng bảo quản, trong bóng tối, ở 22-25 độ và độ ẩm tương đối 52 phần trăm (RH) hoặc ở 40 độ và 75 phần trăm RH của màng với 2 ug cm {{19} } của HDE đã được đánh giá. Cuối cùng, hoạt động chống lão hóa trong ống nghiệm của màng BNC với 2 ug cm -2 HDE đã được nghiên cứu thêm.

2. Vật liệu và phương pháp

2.1. Hóa chất và Vật liệu

Citric acid (≥99.5%), dimethyl sulfoxide (DMSO) (≥99.0%), disodium hydrogen phosphate(≥99.0%), glucose(≥99.5%), glycerol(≥99.5%), magnesium nitrate hexahydrate (≥99.0%), potassium chloride(≥99.0%), potassium dihydrogen phosphate (≥99.0%), potassium sulphate (>99.0%), sodium bicarbonate (>99.5%), sodium chloride (>99. 0 phần trăm) và 3- (4, 5- dimethylthiazol -2- yl) -2, 5- diphenyltetrazolium bromide (MTT) (Lớn hơn hơn hoặc bằng 97,5 phần trăm) được mua từ Sigma-Aldrich (Lisbon, Bồ Đào Nha). Tất cả các hóa chất khác đều thuộc loại phòng thí nghiệm.dương vật cistanche phát triểnCanxi clorua, Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), etoposide, thuốc thử phenol Folin-Ciocalteu, magie clorua, natri pyruvate, dung dịch trypsin-EDTA, N - (2- hydroxyetyl) piperazine-N '- ({{6} } axit etan sulfonic), 4- (2- hydroxyethyl piperazine -1- axit etan sulfonic (HEPES) và 2, 2- diphenyl -1- picrylhydrazyl (DPPH) là do Sigma-Aldrich (Lisbon, Bồ Đào Nha) cung cấp. Peptone và chiết xuất nấm men được mua từ Phòng thí nghiệm Himedia GmbH (Einhausen, Đức). Huyết thanh bò thai (FBS), penicillin và streptomycin được mua từ Gibco (Carlsbad, CA, USA).

Các mẫu từ mặt nạ giấy thương mại BNC được sử dụng trong các thử nghiệm cơ học và hấp thụ độ ẩm, nhằm mục đích so sánh. Mặt nạ giấy thương mại BNC (Superstart Probiotic Boost Skin Renewal Biocellulose Mask, Elizabeth Arden, New York, NY, USA) được mô tả là có nguồn gốc từ nước dừa tự nhiên và được nhúng trong một công thức mỹ phẩm với các đặc tính tái tạo da có chứa, trong số các thành phần khác, chế phẩm sinh học (Lactococcus lên men lysate, Lactobacillus), chiết xuất từ ​​thực vật (chiết xuất hoa hồng Althea, nước ép rễ Polymnia sonchifolia, chiết xuất Crithmum maritimum), caffein và chất giữ ẩm, chẳng hạn như glycerol, axit hyaluronic hoặc polyethylene glycol (PEG) -450 . Các mẫu của tờ BNC-thương mại được làm khô trong tủ sấy thông gió ở 358C trước khi sử dụng.lợi ích của cistanche salsaE.globulus Labill tươi. lá được thu thập từ những cây trưởng thành từ một đồn điền công nghiệp của Công ty Navigator gần Aveiro tại Sever do Vouga (Bracal) (Aveiro, Bồ Đào Nha) và được đưa vào quy trình chưng cất thủy lực cho đến khi chiết xuất hoàn toàn phần tinh dầu (2-3 h) sử dụng thiết bị loại Clevenger đã được sửa đổi. Cuối cùng, chiết xuất dạng nước, HDE, được thu hồi và đông khô, bảo quản và tránh ánh sáng trong bình hút ẩm, ở nhiệt độ phòng, cho đến khi sử dụng [40].

2.2. Tổng hàm lượng phenolic của HDE

Tổng hàm lượng phenolic (TPC) của HDE được xác định bằng phương pháp Folin-Ciocalteu, như được mô tả ở những nơi khác [41], với một số sửa đổi. Tóm lại, trong 96- đĩa giếng, 15 0 μL thuốc thử Folin-Ciocalteu đã được pha loãng trước đó （1∶10, o / ø） với nước và 120 L dung dịch natri cacbonat trong nước （75 g L- ） Được thêm vào 30 μL dung dịch HDE trong nước với nồng độ từ 1,95 ugs đến 500 ug mL -1 dịch chiết. Hỗn hợp phản ứng được ủ trong bóng tối ở nhiệt độ phòng trong 60 phút. Sau thời gian ủ, độ hấp thụ được đo ở bước sóng 760 nm trên mẫu trắng (nước thay vì dịch chiết) trong đầu đọc vi tấm Thermo Scientific MultiskanTM FC (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA). TPC được tính bằng đương lượng axit gallic (GAE) từ đường chuẩn của dung dịch chuẩn axit gallic (5. 13-205. 0 ug mL -1) và được biểu thị bằng mg GAE của dịch chiết đông khô. Thử nghiệm được thực hiện năm lần, và mỗi mẫu được phân tích ba lần.

2.3. Sản xuất màng BNC

Màng BNC được sản xuất trong phòng thí nghiệm của chúng tôi bằng cách sử dụng môi trường nuôi cấy lỏng Hestrin-Schramm (HS) (2 0 g L -1 glucose, 5g L -1 peptone, 5g Ll chiết xuất men, 2,7g L -1 dinatri hydro photphat, 1,15 g axit L-Citric, pH5) được cấy vi khuẩn axit axetic Gluconacetobacter sacchari trong điều kiện nuôi cấy tĩnh [42]. Sau 4-6 ngày nuôi cấy ở 30 độ, màng BNC được thu hoạch và xử lý hai lần với 0,5 M NaOH ở 80 độ trong 30 phút. Sau đó, màng lọc được rửa nhiều lần bằng nước cất để loại bỏ các thành phần môi trường còn sót lại và các tế bào vi khuẩn. Cuối cùng, màng BNC được làm trắng bằng dung dịch nước natri hypoclorit 1%, sau đó rửa nhiều lần bằng nước cất cho đến khi đạt được pH trung tính. Màng tinh khiết được bảo quản trong nước siêu tinh khiết ở nhiệt độ cộng thêm 4 cho đến khi sử dụng.

2.4. Chuẩn bị Màng BNC-G-HDE

BNCmembranes ướt （đường kính∶ khoảng 7. 0 ± 0. 5 cm; độ dày∶ 7000 ± 1000 μm） được nạp với các liều HDE khác nhau (được biểu thị bằng khối lượng HDE trên diện tích bề mặt của màng) và glycerol (7,5 mg cm -2) ​​(Bảng 1), sử dụng phương pháp ngâm tẩm. Màng BNC ướt được cân một cách gọn gàng (khoảng 180 mg BNC khô) và được làm ráo bằng cách ấn tay với giấy thấm cấp phòng thí nghiệm cho đến khi hàm lượng nước giảm xuống gần 40% (ước tính theo trọng lượng). Sau đó, các màng được ngâm trong 5 mL dung dịch nước có chứa các liều lượng tương ứng của cả HDE và glycerol và được duy trì ở nhiệt độ phòng cho đến khi hấp thụ hoàn toàn dung dịch HDE-G. Cuối cùng, màng BNC được làm khô (trong đĩa Petri) ở 35 độ trong tủ sấy thông gió (dòng Venticell Eco, tập đoàn MMM, Planegg, Đức) trong ít nhất 20 giờ. Màng khô được bảo quản và tránh ánh sáng trong bình hút ẩm ở nhiệt độ phòng cho đến khi sử dụng. Để so sánh, các màng BNC tinh khiết (không có chiết xuất và glycerol) đã được làm khô như đã mô tả trước đây và các màng chứa glycerol (BNC-G) được chuẩn bị theo cùng một quy trình.

2.5. Đặc tính của màng

2.5.1 Độ dày

Độ dày của màng khô được đo tại năm vị trí ngẫu nhiên bằng cách sử dụng micromet kỹ thuật số cầm tay （Mitutoyo Corporation, Tokyo, Japan） với độ chính xác 1 μm

2.5.2. Hình thái học

Hình thái bề mặt và mặt cắt ngang (đứt gãy) của màng được phân tích bằng kính hiển vi điện tử quét (SEM). Ảnh hiển vi được thu bằng kính hiển vi điện áp cao (HR-FESEMSU 7 0 Hitachi, Tokyo, Nhật Bản) hoạt động ở 4,0 kV. Trước khi thu thập hình ảnh, các mẫu được đặt trên giá đỡ bằng thép và phủ carbon.

2.5.3. Hiệu suất cơ học

Hiệu suất cơ học của màng ở trạng thái khô và ướt (80% độ ẩm) được đánh giá bằng các thử nghiệm kéo. Độ ẩm của màng ướt được xác định theo độ ẩm được xác định trong BNC thương mại. Các thử nghiệm độ bền kéo được thực hiện trên máy thử nghiệm Instron 5564 một trục (Instron Corporation, Norwood, MA, USA) ở chế độ lực kéo ở vận tốc đầu 10 mm min-I bằng cách sử dụng cảm biến lực tĩnh 500 N. Tất cả các phép đo được thực hiện trong ít nhất năm lần lặp lại bằng cách sử dụng các mẫu thử hình chữ nhật （5 × 1 cm²） và chiều dài cữ là 30 mm. Các đường cong ứng suất （MPa） và biến dạng （phần trăm） được vẽ biểu đồ, và mô đun Young, độ bền kéo và độ giãn dài khi đứt được xác định bằng phần mềm Instron BlueHill 3. Trong các thử nghiệm này, các mẫu mặt nạ BNC thương mại cũng được thử nghiệm trong các điều kiện tương tự để so sánh.

2.5.4. Ổn định nhiệt

Phân tích nhiệt trọng lượng (TGA) được thực hiện bằng máy phân tích SETSYS Setaram TGA (SITARAM Instrumentation, Lyon, France) được trang bị một tế bào bạch kim. Các mẫu được làm nóng từ nhiệt độ phòng đến 800C với tốc độ không đổi là 10 độ min -1 trong môi trường nitơ.

2.5.5. Công suất hút ẩm

Khả năng hút ẩm của tất cả các màng được đánh giá bằng cách đặt các mẫu đã khô (2 × 2 cm-) của mỗi màng vào bình hút ẩm, ở nhiệt độ phòng, với độ ẩm tương đối là ca. 52 phần trăm sử dụng dung dịch nước magie nitrat bão hòa (52,89 ± 0. 22 phần trăm ở 25 độ) [43]. Các mẫu thử được lấy từ bình hút ẩm và cân sau 0. 5 giờ, 1 giờ, 2,5 giờ, 24 giờ và 48 giờ. Tất cả các màng đều được thử nghiệm ba lần. Độ ẩm hấp thụ được tính như sau:

Trong đó Trọng lượng ban đầu của mẫu vật là Ai và Là trọng lượng tại mỗi thời điểm.

2.6. Trong hoạt động chống oxy hóa Chermico

Hoạt động chống oxy hóa của màng chịu tải HDE được ước tính bằng cách sử dụng phương pháp quét gốc tự do DPPH, theo quy trình đã báo cáo trước đây [44], với một số sửa đổi. Phản ứng dựa trên sự giảm độ hấp thụ của dung dịch DPPH do các hợp chất chống oxy hóa loại bỏ gốc, với sự thay đổi màu sắc của dung dịch DPPH từ màu tím sang màu vàng nhạt [45]. Một cách ngắn gọn, các mẫu vật có kích thước 2 × 5 cm²） của mỗi màng được thêm vào 3,75 mL etanol （EtOH） và dung dịch muối đệm photphat （PBS） （6 0 ∶4 0; pH5,5）. Sau đó, 250 μL dung dịch DPPH （1 mM） trong etanol được thêm vào, và hỗn hợp thu được được ủ trong bóng tối với sự trộn nhẹ nhàng (100 vòng / phút) ở 22 độ trong 0,5 giờ, 1 giờ và 2,5 giờ, và sau đó độ hấp thụ ở 517nm được đọc trên mẫu trắng (EtOH: PBS1 × pH5,5) bằng đầu đọc vi tấm MultiskanTM FC (Thermo Scientific, Waltham, Massachusets, EUA). Để so sánh, các hỗn hợp phản ứng có chứa HDE được pha loãng trong EtOH: PBS1 × pH5,5 ở nồng độ cuối cùng tương đương với lượng HDE tối đa có thể được giải phóng từ mỗi màng (HDE 1: 2,5 ug mL -1; HDE1. 5∶3,75 ug mL -1; HDE 2∶5,0 ug mL -1; HDE 3∶7,5 ug mL-） cũng được đưa vào xét nghiệm. Một đối chứng bao gồm EtOH: PBS 1 × pH5,5 với DPPH và không có màng đã được sử dụng. Ba thử nghiệm độc lập được thực hiện cho mỗi mẫu. Hoạt động thu dọn gốc DPPH được tính toán từ độ hấp thụ của mỗi mẫu (Một mẫu) đối với độ hấp thụ DPPH đối chứng (ApppH) như sau:

2.7. Đánh giá tính ổn định của màng BNC-G-HDE2 trong quá trình lưu trữ

Dựa trên "Hướng dẫn kiểm tra độ ổn định cho các sản phẩm mỹ phẩm" [46], độ ổn định lưu trữ của BNC-G-HDE2 đã được đánh giá. Đối với điều này, các mẫu （14 cm²） của màng BNC-G （làm đối chứng） và BNC-G-HDE2 được đặt trong lọ thủy tinh và lưu trữ trong 3 tháng trong bóng tối ở điều kiện bảo quản bình thường dự kiến, ở nhiệt độ phòng ({{10 }} độ) và 52% RH (điều kiện I, sử dụng dung dịch bão hòa magie nitrat [43]) và ở điều kiện tăng tốc là 40 độ C và 75% RH (điều kiện I, sử dụng dung dịch bão hòa natri clorua [43] ). Độ ẩm tương đối được theo dõi định kỳ bằng cách sử dụng nhiệt kế để đảm bảo độ ẩm ổn định trong toàn bộ thời gian bảo quản. Tất cả các mẫu được phân tích trước và sau 1,2, và 3 tháng bảo quản về hoạt tính chống oxy hóa của chúng (như mô tả trong Phần 2.6). Các khía cạnh vĩ mô của màng cũng được ghi lại. Đối với mỗi điều kiện, tất cả các mẫu được phân tích ba lần.

2.8. Thử nghiệm sinh học trong ống nghiệm

2.8.1. Nuôi cấy tế bào

Tế bào sừng của người (HaCaT, từ CLS, Cell Lines Service, Eppelheim, Đức) và nguyên bào sợi của chuột (NIH / 3T3, ATCC CRL -1658, Manassas, VA, USA) được nuôi cấy bằng cách sử dụng phương pháp Modified Eagle's Medium (DMEM) của Dulbecco , ở 37 độ, trong bầu không khí được làm ẩm 5 phần trăm CO 2-95 phần trăm. Môi trường được bổ sung 10 phần trăm (o / v) huyết thanh bò thai bất hoạt nhiệt （FBS）, 1 phần trăm （o / ø） pen / strep, 3,7 g L-Natri bicarbonate, và 1 mM natri pyruvate. Tế bào được tách ra bằng dung dịch trypsin-EDTA 1 ×.

2.8.2. Thử nghiệm độc tính tế bào

Độc tính tế bào của màng được đánh giá bằng xét nghiệm giảm MTT. Các mẫu （2,5 cm²） của màng （BNC-G, BNC-G-HDE1, BNC-G-HDE1.5, BNC-G-HDE2, BNC-G-HDE3) được khử trùng hai lần bằng bức xạ UV mỗi bên trong 20 tối thiểu và được ủ tiếp, trong 24 giờ, trong 2,5 mL môi trường DMEM hoàn chỉnh ở 37 độ trong môi trường không khí 5% CO, -95% được làm ẩm, để chuẩn bị từng dịch chiết màng.

Trong khi đó, 2 × 1 0 và 1 × 1 0 4 ô / giếng được gieo vào 96- đĩa giếng tương ứng cho các ô HaCaT và NIH / 3T3. Sau 24 giờ, cùng một thể tích dịch chiết màng được sử dụng để thay thế môi trường nuôi cấy, và các tế bào được ủ tiếp trong 24 giờ ở 37 độ. Như một đối chứng, các tế bào được xử lý theo cách tương tự như mô tả đối với các mẫu nhưng chỉ tiếp xúc với môi trường DMEM. Sau 24 giờ, môi trường được loại bỏ, và độc tính tế bào được xác định như đã mô tả trước đây [47]. Một cách ngắn gọn, một dung dịch MTT (0,5 mg L -1) mới được chuẩn bị trong môi trường Krebs (pH 7,4) được thêm vào và ủ ở 37 độ trong 2 giờ (tế bào HaCaT) hoặc 4 giờ (tế bào NIH / 3T3). Sau đó, dung dịch MTT được thay thế bằng DMSO và ủ trong l0 phút, có lắc, để hòa tan hoàn toàn các tinh thể formazan. Sau khi ủ, độ hấp thụ được đo ở bước sóng 570 nm trong máy quang phổ (SLT spectra I). Kết quả của 3 thí nghiệm độc lập, với 3 lần lặp lại, được biểu thị bằng phần trăm (phần trăm) của giá trị độ hấp thụ thu được trong đối chứng và được trình bày dưới dạng đồ thị phần trăm giảm MTT.

2.8.3. Hoạt động chống phát quang

Hoạt động chống lão hóa của màng BNC-G-HDE2 được đánh giá bằng cách sử dụng xét nghiệm nhuộm -galactosidase (-gal). Màng BNC-G được sử dụng như một đối chứng. Để chuẩn bị dịch chiết màng, các mẫu đã khử trùng (10 cm-) được ủ trong 10 mL môi trường DMEM hoàn chỉnh như đã mô tả trước đây cho xét nghiệm độc tính tế bào.

Tế bào NIH / 3T3 được gieo vào 12- đĩa giếng với mật độ 2,5 × 104 tế bào / giếng và để ổn định trong 24 giờ. Sau đó, etoposide 12,5 μM được sử dụng để tạo ra sự lão hóa tế bào trong NIH / 3T3 trong 24 giờ. Sau đó, các tế bào được kích thích bởi etoposide được xử lý bằng chiết xuất màng BNC-G-HDE2 trong 24 giờ nữa.cistanche tubulosa liều lượng redditĐối chứng, các tế bào không được xử lý được ủ với môi trường DMEM hoặc với chất chiết xuất từ ​​màng BNC-G và BNC-G-HDE. Sau khi ủ, môi trường nuôi cấy được lấy ra, và các tế bào được rửa sạch bằng PBS và được đánh dấu bằng dung dịch -gal được chuẩn bị như mô tả của nhà sản xuất (Công nghệ Tín hiệu Tế bào, Danvers, MA, USA). Việc phân tích các tế bào dương tính với sự lão hóa được thực hiện ở độ phóng đại 20 lần bằng kính hiển vi trường rộng (Carl Zeiss, Oberkochen, Đức). Ít nhất 3 thí nghiệm độc lập đã được thực hiện lặp lại và tỷ lệ phần trăm tế bào dương tính được xác định bằng cách sử dụng bốn hình ảnh hiển vi.

2.9. Phân tích thống kê

Trong việc xử lý các kết quả từ thử nghiệm mô tả đặc tính, hoạt tính chống oxy hóa và độ ổn định lưu trữ của màng, phân tích phương sai một chiều (ANOVA) theo sau thử nghiệm Tukey đã được sử dụng để đánh giá mức độ ý nghĩa. Kết quả được biểu thị bằng giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn của giá trị trung bình. Đối với các xét nghiệm in vitro, tính chuẩn mực của phân bố dữ liệu được đánh giá bằng các bài kiểm tra tính chuẩn mực của D'Agostino-Pearson và Shapiro-Wilk. So sánh thống kê giữa các nhóm được thực hiện bởi ANOVA, sau đó là bài kiểm tra sau giờ học của Dunnett hoặc bài kiểm tra t của học sinh không ghép đôi. Kết quả được trình bày dưới dạng sai số trung bình ± tiêu chuẩn của giá trị trung bình của số lượng thí nghiệm được chỉ định.

Ý nghĩa được chấp nhận ở các giá trị p<0.05. all="" statistical="" calculations="" were="" performed="" using="" graphpad="" prism="" software(8.0.2,="" graphpad="" software="" inc.,="" san="" diego,="" ca,="">

Bài viết này được trích từ Tài liệu 2022, 15, 1982. https://doi.org/10.3390/ma15051982 https://www.mdpi.com/journal/materials