Thử nghiệm sinh học để theo dõi hiệu quả chống lão hóa của việc điều trị bằng máu cuống rốn

Liên hệ: jerry.he@wecistanche.com

Sang-Hun Bae1 *, Ala Jo1,2 *, Jae Hyun Park1, Chul-Woo Lim1, Yuri Choi1, Juhyun Oh2, Ji-Min Park1, TaeHo Kong1, Ralph Weissleder2,3, Hakho Lee2, Jisook Moon1

1. Khoa Công nghệ Sinh học, Trường Cao đẳng Khoa học Đời sống, Đại học CHA, Gyeonggi-do 13488, Hàn Quốc

2. Trung tâm Sinh học Hệ thống, Bệnh viện Đa khoa Massachusetts, Trường Y Harvard, Boston, MA 02114, Hoa Kỳ

3. Khoa Sinh học Hệ thống, Trường Y Harvard, Boston, MA 02115, Hoa Kỳ * Các tác giả này đã đóng góp như nhau.

Tác giả tương ứng: Hakho Lee, Tiến sĩ. Trung tâm Sinh học Hệ thống, Bệnh viện Đa khoa Massachusetts, 185 Cambridge St, CPZN 5206, Boston, MA 02114, Hoa Kỳ. 617-726-8226 hlee@mgh.harvard.edu Jisook Moon, Tiến sĩ. Khoa Công nghệ Sinh học, Trường Cao đẳng Khoa học Đời sống, Đại học CHA, Pangyo-ro 335, Bundang-gu, Seongnam-si, Gyeonggi-do 13488, Hàn Quốc. 82-31-881-7210 jmoon@cha.ac.kr

© Nhà xuất bản quốc tế Ivyspring. Đây là một bài viết truy cập mở được phân phối theo các điều khoản của giấy phép Creative Commons Attribution (CC BY-NC) (https://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0/). Xem http://ivyspring.com/terms để biết các điều khoản và điều kiện đầy đủ.

Đã nhận: 2018.10.04; Đã chấp nhận: 2018. 11. 18; Đã xuất bản: 2019.01.01

Cistanche có tác dụng chống lão hóa

trừu tượng

Tiểu sử: Điều trị động vật già bằng huyết tương của giai đoạn phát triển sớm (ví dụ, huyết tương dây rốn) cho thấy tiềm năng ấn tượng để làm chậm sự suy thoái liên quan đến tuổi của các chức năng thần kinh và nhận thức. Tuy nhiên, việc chuyển những phát hiện như vậy sang thực tế lâm sàng đòi hỏi những cách hiệu quả để đánh giá hiệu quả điều trị; các phương pháp lý tưởng nên xâm lấn tối thiểu, có thể thực hiện các xét nghiệm hàng loạt, hiệu quả về chi phí và định lượng.

Phương pháp: Chúng tôi đã phát triển một phương pháp cảm biến sinh học mới để theo dõichống lão hóaliệu pháp. Chúng tôi đã nâng cao hai thành phần cảm biến chính: i) chất chuyển hóa qua đường máu được xác định là dấu hiệu lão hóa thay thế; và ii) một hệ thống khảo nghiệm nhỏ gọn và hiệu quả về chi phí đã được phát triển cho các ứng dụng tại chỗ. Chúng tôi điều trị những con chuột già bằng huyết tương hoặc nước muối từ cuống rốn người; hồ sơ chất chuyển hóa không thiên vị trên huyết tương chuột tiết lộ axit arachidonic (AA) như một chất chỉ thị mạnh liên quan đếnchống lão hóahiệu ứng. Tiếp theo, chúng tôi triển khai một cảm biến điện từ hóa cạnh tranh (cMES) được tối ưu hóa để phát hiện AA trực tiếp từ plasma. Nền tảng được phát triển có thể phát hiện AA trực tiếp từ thể tích nhỏ của huyết tương (0. 5 µL) trong vòng 1,5 giờ.

Kết quả: Các xét nghiệm cMES xác nhận mối tương quan chặt chẽ giữa mức AA vàtác dụng chống lão hóa: Mức AA, trong khi giảm khi lão hóa, tăng lên ở những con chuột già được điều trị bằng huyết tương, điều này cũng cho thấy hiệu suất học tập và trí nhớ được cải thiện.

Kết luận: Nền tảng cMES sẽ trao quyền cho cả giai đoạn tiền lâm sàng và lâm sàngchống lão hóanghiên cứu bằng cách cho phép giám sát điều trị theo chiều dọc, xâm lấn tối thiểu; những năng lực này sẽ thúc đẩy sự phát triển củachống lão hóaliệu pháp, nâng cao chất lượng cuộc sống cá nhân.

Từ khóa: Chống lão hóa, Arachidonic acid, Metabolite profiling, Magneto-electrochemical sensor, Biosensor

Giới thiệu

Lão hóa ngày càng được công nhận là một yếu tố nguy cơ lâm sàng đối với thoái hóa nhận thức (ví dụ, thoái hóa thần kinh, sa sút trí tuệ) và các bệnh mãn tính khác (ví dụ, ung thư, bệnh tim mạch, thoái hóa cơ) [1]. Với việc mở rộng tuổi thọ con người và dân số già ngày càng tăng, những nỗ lực đáng kể đang được tiến hành để làm sáng tỏ các cơ chế lão hóa [1–3] và tìm ra các chiến lược điều trị để làm chậm hoặc thậm chí đảo ngược quá trình lão hóa [4]. Thật vậy, kết quả đầy hứa hẹn từ các nghiên cứu trên động vật đã được báo cáo; chuột trưởng thành được truyền huyết tương từ chuột non đã lấy lại được chức năng nhận thức, độ dẻo của khớp thần kinh và hoạt động của tế bào thần kinh [5]. Phát triển nhanh chóng trongchống lão hóacác phương pháp điều trị và việc dịch chúng thành các thử nghiệm trên người đã được dự đoán trước [6]. Tuy nhiên, các chỉ số đo lường hiện tại để theo dõi hiệu quả điều trị có tính thực tế hạn chế, vì các phương pháp thường khó áp dụng với con người (ví dụ: chụp ảnh não xâm lấn, quan sát hành vi có kiểm soát) và chủ quan (ví dụ: bảng câu hỏi về trải nghiệm của bệnh nhân). Một chìa khóa cần thiết để thăng tiếnchống lão hóaDo đó, liệu pháp nằm trong việc phát triển các xét nghiệm định lượng, xâm lấn tối thiểu để theo dõi điều trị.

Chúng tôi lý luận rằng các chất chuyển hóa sẽ là một nguồn mạnh chochống lão hóadấu ấn sinh học. Chất chuyển hóa là một kiểu hình thiết yếu trong một sinh vật và đang được nghiên cứu như là dấu ấn sinh học chẩn đoán cho các bệnh khác [7]. Đặc biệt, lão hóa thường liên quan đến những thay đổi hoặc rối loạn chức năng trao đổi chất, ảnh hưởng đến hồ sơ chất chuyển hóa tổng thể trong sinh vật. Do đó, có thể hình dung rằng việc truy tìm thành phần và / hoặc mức độ của các chất chuyển hóa sẽ thông báo về hiệu quả củachống lão hóasự đối đãi. Hơn nữa, xét nghiệm chất chuyển hóa, đặc biệt dưới dạng xét nghiệm máu, có thể định lượng và xâm lấn tối thiểu; những giá trị này sẽ tạo điều kiện thuận lợi cho việc đưa ra các phác đồ điều trị hoặc nhóm bệnh nhân khác nhau, và theo dõi (chống) động lực lão hóa thông qua lấy mẫu nối tiếp.

Chúng tôi ở đây mô tả một chiến lược cảm biến sinh học mới để giám sátchống lão hóasự đối đãi. Hai yếu tố chính đã được nâng cao: i) một chất chuyển hóa qua đường máu được xác định là một dấu hiệu lão hóa thay thế; và ii) một hệ thống xét nghiệm nhanh, hiệu quả về chi phí đã được phát triển để ứng dụng trong các cơ sở lâm sàng thường quy. Cụ thể, chúng tôi đã điều trị cho một nhóm chuột già (khoảng 2 tuổi) bằng huyết tương từ máu cuống rốn của con người. Các phân tích chuyển hóa toàn diện trên máu chuột cho thấy rằng axit arachidonic (AA), có mức độ giảm đáng kể khi lão hóa, tăng ngược lại ở nhóm được điều trị. Quan sát này đã khiến chúng tôi phát minh ra cảm biến điện hóa từ tính cho các mục tiêu phân tử nhỏ: chúng tôi tối ưu hóa phản ứng điện hóa cạnh tranh trong đó AA được bắt trên các hạt từ tính và tập trung để có độ nhạy cao hơn. Nền tảng được phát triển có thể phát hiện AA trực tiếp từ thể tích nhỏ của huyết tương (0. 5 µL) trong vòng 1,5 giờ. Sử dụng nền tảng này, chúng tôi có thể thiết lập thêm mối tương quan tích cực giữa mức AA trong máu và hiệu suất tốt hơn của động vật trong nhiệm vụ vận động.

Kết quả

Xử lý chuột trưởng thành bằng huyết tương cuống rốn Hình 1a cho thấy sơ đồ thí nghiệm tổng thể.

Với tư cách là một đại lý, chúng tôi đã sử dụng huyết tương lấy từ các mẫu máu cuống rốn của con người. Các nghiên cứu trước đây cho thấy những con chuột già được tiêm huyết tương chuột non đã phục hồi chức năng ghi nhớ không gian, và việc sử dụng toàn thân huyết tương dây rốn của người đã cải thiện nhận thức phụ thuộc vào hồi hải mã ở chuột già [5, 8]. Tiêm huyết tương, không có thành phần tế bào, giảm thiểu nguy cơ từ chối miễn dịch do không phù hợp loài. Những con chuột già (bắt đầu từ 18 tháng tuổi) được chọn ngẫu nhiên và nhận huyết tương (một nhóm điều trị) hoặc dung dịch đệm nước muối (một nhóm giả tạo) thông qua tiêm vào đuôi (130 µL; xem Hình S1 để biết chi tiết). Như một đối chứng tích cực, chuột non (3 tháng tuổi) được sử dụng. Huyết tương lấy từ máu dây rốn không được gộp chung và mỗi con chuột được truyền huyết tương nhiều lần từ cùng một người hiến tặng (Hình S1). Sau khi điều trị 4- tuần, chuột phải trải qua một bài kiểm tra hành vi (tức là rotarod) và máu được lấy để phân tích.

Hình 1. Thiết kế thí nghiệm. Huyết tương cuống rốn người được sử dụng cho nhóm trẻ (3- tháng tuổi), nhóm già (20- và 23- tháng tuổi) và nhóm già được xử lý bằng huyết tương (20- và 23- tháng tuổi). Ba nhóm đã phải trải qua 2- bài kiểm tra Rotarod thử nghiệm để đo khả năng phối hợp vận động và học tập. Việc thu thập chất chuyển hóa không mục tiêu được thực hiện trên máu của ba nhóm, và hầu hếtchống lão hóacon đường liên quan được xác định thông qua một phương pháp tiếp cận thông tin sinh học. Cảm biến sinh học được phát triển để phát hiện chất chuyển hóa quan trọng nhất của con đường.

Hình 2. Xác định các dấu ấn sinh học chất chuyển hóa liên quan đến điều trị huyết tương cuống rốn người. (A) Hồ sơ toàn cầu về nhiễu loạn chất chuyển hóa. Các hàng tương ứng với các tính năng (sự kết hợp duy nhất của giá trị m / z và thời gian lưu) từ LC / MS và cột đến mẫu. Các hàng được phân nhóm theo thứ bậc. (B) Biểu đồ điểm của PCA để giảm số chiều. Các mẫu được vẽ dựa trên thành phần chính (PC) 1 và 2. Các giá trị trong ngoặc đơn của chú giải trục là tỷ lệ phương sai được giải thích bởi các thành phần đó. PC1 rất có thể giải thích tác dụng chống lão hóa, vì nhóm được điều trị bằng huyết tương gần với nhóm trẻ hơn nhiều so với nhóm giả. (C) Phân tích làm giàu lộ trình. Các chất chuyển hóa được xác định bằng cách khớp các giá trị m / z đo được với thông tin về khối lượng phân tử. Mỗi vòng tròn đại diện cho một con đường cụ thể được tìm thấy. Đối với một con đường nhất định, vị trí hoặc kích thước x của vòng tròn tương ứng với trung tâm tương đối tốt (thước đo tác động của con đường) của các chất chuyển hóa và vị trí hoặc màu y (giá trị p thấp hơn cho màu đỏ và cao hơn cho màu xanh lam) trong phạm vi chất chuyển hóa nào được đại diện quá mức. Các đường dẫn ưu thế có giá trị x và y cao hơn. Theo đó, chuyển hóa axit arachidonic (AA) được xác định là con đường có khả năng xảy ra nhất để giải thíchtác dụng chống lão hóacủa huyết tương máu cuống rốn.

Phân tích trao đổi chất trên mẫu máu chuột

Đầu tiên, chúng tôi thực hiện một chất chuyển hóa phân tử nhỏ không thiên vị trong huyết tương chuột. Các mẫu máu của cả ba nhóm chuột được phân tích bằng sắc ký lỏng và khối phổ (LC / MS). Chúng tôi đã xử lý dữ liệu m / z bằng MAIT (bộ công cụ nhận dạng tự động chất chuyển hóa) và xác định các đặc điểm có ý nghĩa thống kê thông qua ANOVA (8572 kết hợp duy nhất của m / z và thời gian lưu) (Hình 2a). Phân tích phân nhóm theo thứ bậc (HCA) của các chất chuyển hóa cho thấy hai mô hình chính: i) cấu hình chất chuyển hóa khác biệt rõ rệt giữa chuột già (không được điều trị) và chuột non; và ii) cấu hình của những con chuột già được xử lý bằng huyết tương gần hơn với những con chuột non.

Phân tích thành phần chính (PCA) tiết lộ cấu trúc vốn có của dữ liệu chuyển hóa (Hình 2b). Khoảng 50% tổng số biến thể có thể giải thích được bởi thành phần chính thứ nhất (PC1) và thứ hai (PC2). Tất cả ba nhóm thuần tập (tức là nhóm trẻ, được xử lý bằng huyết tương và nhóm giả tạo) định cư ở các vị trí riêng biệt, cho thấy rằng các đặc điểm liên quan về mặt sinh học để phân biệt các nhóm nhóm đã được xác định. Điều thú vị là nhóm người già được điều trị bằng huyết tương đã tránh xa sự giả tạo đối với nhóm trẻ. Để định lượng sự phân tách nhóm, chúng tôi đã tính toán phân cụm phân cấp trên hai thành phần chính. Trong biểu đồ dendrogram, nhóm trẻ và nhóm được xử lý huyết tương được tập hợp ở mức độ khác biệt thấp hơn (hoặc mức độ tương đồng cao hơn, 1120,9) so với nhóm không được điều trị (3162,5) (Hình S2). Những kết quả này chỉ ra rằng các đặc điểm đã chọn (các biến hoặc hàng trong Hình 2a) có thể được sử dụng để suy ra dấu ấn sinh học của chất chuyển hóa có liên quan đến sự lão hóa vàchống lão hóa. Chúng tôi đã chú thích các đặc điểm với các chất chuyển hóa đã biết bằng cách sử dụng cơ sở dữ liệu trong miền công cộng [9].

Chúng tôi đánh giá thêm các chức năng và sự kết nối lẫn nhau của các chất chuyển hóa đã được xác định, áp dụng bản đồ KEGG (Bách khoa toàn thư về gen và bộ gen của Kyoto) [10]. Đối với một con đường nhất định, chúng tôi đo i) sự đại diện quá mức của một chất chuyển hóa ứng cử viên và ii) tầm quan trọng của nó (tức là trung tâm giữa các chất) [11] như là một nút trung gian chính giữa các cặp chất chuyển hóa khác (xem Phương pháp để biết chi tiết). Chúng tôi nhận thấy rằng chuyển hóa axit arachidonic (AA) là con đường được đại diện nhiều nhất (giá trị y cao nhất trong Hình 2c) và các chất chuyển hóa trong con đường đó có xu hướng định vị tại các đường truyền thông tin (giá trị x cao hơn trong Hình 2c) và chi phối luồng thông tin. Trong số nhiều chất chuyển hóa trong quá trình chuyển hóa AA, chúng tôi đã chọn chính AA làm dấu ấn sinh học; như là một bước khởi đầu vào con đường, một mình AA có thể là đại diện của các chất chuyển hóa bị xáo trộn khác.

Cảm biến điện hóa từ tính cạnh tranh (cMES) để phát hiện AA trong plasma

Tiếp theo, chúng tôi bắt đầu cải tiến một hệ thống xét nghiệm nhanh, tại chỗ để phát hiện AA. Chúng tôi đã chọn sử dụng công nghệ cảm biến điện hóa từ [12–17]. Nó kết hợp việc làm giàu mục tiêu và phát hiện thành một nền tảng duy nhất: các hạt từ tính (MB) được sử dụng để nắm bắt và gắn nhãn các mục tiêu phân tử, và các mục tiêu liên kết với hạt được phát hiện thông qua cảm biến điện hóa. Cách tiếp cận này có nhiều ưu điểm thực tế: i) mẫu gốc (huyết tương hoặc máu) có thể được sử dụng trực tiếp mà không cần phải tinh chế mẫu; ii) xét nghiệm đạt được độ nhạy phát hiện cao thông qua việc làm giàu từ tính và khuếch đại tín hiệu enzym; iii) dựa trên sơ đồ phát hiện điện, các cảm biến có thể dễ dàng thu nhỏ như một thiết bị di động (Hình 3a).

Tuy nhiên, việc phát hiện AA thông qua cảm biến điện hóa từ đặt ra một thách thức kỹ thuật; vì AA là một phân tử nhỏ (~ 304,5 Da), các xét nghiệm miễn dịch sử dụng một cặp kháng thể AA rất khó áp dụng. Do đó, chúng tôi đã khám phá ra một định dạng xét nghiệm cạnh tranh (cMES; cảm biến điện hóa từ cạnh tranh) chỉ yêu cầu một kháng thể AA duy nhất (Hình 3b). Để bắt mục tiêu, chúng tôi phủ MBs bằng kháng thể AA (MBAb). Chúng tôi cũng chuẩn bị một tác nhân cạnh tranh (AA-HRP) bằng cách liên hợp AA với một enzym oxy hóa (peroxidase củ cải ngựa, HRP). Cụ thể, chúng tôi đã sử dụng một biểu mẫu hapten; AA liên hợp trên albumin huyết thanh bò (BSA), và HRP liên hợp thêm với chất mang BSA (Hình S3). Đối với xét nghiệm cMES, các mẫu máu được trộn với MBAb và AA-HRP. Lượng AA-HRP đủ để bão hòa các vị trí liên kết AA trong MBAb (Phương pháp). Điều này sẽ dẫn đến tải HRP khác nhau trên MB, tùy thuộc vào lượng AA nội sinh trong các mẫu. Việc thêm một cách tuần tự chất trung gian điện tử tạo màu (3,3 ', 5,5'-tetramethylbenzidine, TMB) tạo ra một dòng điện được đọc ra bởi một điện cực phẳng. Thời gian phản ứng để bắt AA và ủ TMB được tối ưu hóa để tối đa hóa mức tín hiệu (Hình S4).

Hình 3. Cảm biến điện hóa từ cạnh tranh (cMES) cho xét nghiệm AA. (A) Sơ đồ thiết bị. Thiết bị cMES có diện tích nhỏ và có

hoạt động tại chỗ. (B) Chúng tôi đã phát minh ra một thử nghiệm điện hóa cạnh tranh để phát hiện AA. Hạt từ tính (MBAb) được liên hợp với các kháng thể chống lại AA.

Các mẫu đối chứng chỉ chứa AA-HRP và được trộn với các hạt từ tính. Các mẫu thử nghiệm được trộn với hạt từ tính và AA-HRP. (C) Dòng điện

được đo bằng đầu đọc cMES di động. Trong xét nghiệm cMES, cường độ dòng điện giảm khi tăng nồng độ AA [AA]. Tín hiệu từ điều khiển

mẫu thiết lập đường cơ sở cho [AA]=0 ng / mL. Sự khác biệt hiện tại (∆I) giữa mẫu đối chứng và mẫu huyết tương mục tiêu được sử dụng làm thước đo phân tích. (D)

Một lượng AA đã biết đã được tăng đột biến trong huyết thanh và được đo bằng cMES. Giới hạn phát hiện là ~ 126 ng / mL. (E) cMES và ELISA được so sánh với

sự phù hợp. Kết quả từ cả hai phương thức cho thấy một sự thống nhất tốt (R 2=0. 959). Dữ liệu được hiển thị dưới dạng trung bình ± SEM từ các phép đo ba lần.

Hình 4. Các phép đo AA trong mẫu huyết tương. (A) Phân tích khóa học theo thời gian mức AA của chuột sau khi tiêm huyết tương. Chúng tôi đã tiêm 13 {{1 0}} μL huyết tương (nồng độ AA=7. 2 µg / mL) vào chuột (n=6) và thu thập máu chuột sau 3, 7 và 14 ngày. Nồng độ AA của máu chuột sau đó được theo dõi. Mức AA tăng đáng kể vào ngày thứ 3 và trở lại mức bình thường sau 7 ngày. * p <0. 0="" 5;="" **="" p=""><0. 0="" 1;="" ***="" p=""><0. 0="" 0="" 1.="" (b)="" các="" mẫu="" huyết="" tương="" chuột="" được="" thử="" nghiệm.="" trong="" nhóm="" đối="" chứng="" (n="5)," chuột="" non="" (tuổi,="" 5="" và="" 8="" tháng)="" có="" mức="" aa="" cao="" hơn="" chuột="" già="" được="" điều="" trị="" giả="" (tuổi,="" 20="" và="" 23="" tháng;="" n="8)." đối="" với="" nhóm="" được="" điều="" trị="" bằng="" huyết="" tương="" (n="5)," aa="" tăng="" bền="" vững="" đã="" được="" quan="" sát="" thấy.="" *="" p=""><0,05; **="" p=""><0,01; ***="" p=""><0,001. (c)="" các="" mẫu="" plasma="" từ="" cùng="" một="" nhóm="" như="" trong="" (b)="" được="" phân="" tích="" bằng="" phương="" pháp="" khối="" phổ.="" mức="" aa="" cho="" thấy="" một="" xu="" hướng="" tương="" tự="" như="" được="" đo="" bằng="" cmes.="" *="" p=""><0,05; **="" p=""><0,01; ***="" p=""><0,001. dữ="" liệu="" được="" hiển="" thị="" dưới="" dạng="" trung="" bình="" ±="">

Kết quả của thử nghiệm cạnh tranh, cường độ dòng điện giảm khi nồng độ AA trong huyết tương cao hơn ([AA]). Do đó, chúng tôi chuẩn bị mẫu đối chứng bằng cách ủ MBAb chỉ với AA-HRP. Mẫu đối chứng được sử dụng để đặt đường cơ sở trên (tức là [AA]=0 ng / mL) để tính toán sự khác biệt tín hiệu; Các dòng điện từ mẫu điều khiển và plasma được đo, và sự khác biệt thực|∆I |=| Icontrol - Iplasma|đã thu được (Hình 3c). Như là

phép đo vi phân cũng bù cho tín hiệu nền chung.

Thí nghiệm chuẩn độ (Hình 3d) sử dụng các mẫu có nhiều lượng AA khác nhau cho thấy giới hạn phát hiện (LOD) là ~ 125,9 ng / mL. LOD của xét nghiệm thấp hơn ~ 300- lần so với nồng độ AA điển hình là (38 µg / ml) trong huyết tương chuột non (5 tháng, n=2). Dựa trên những kết quả này, chúng tôi pha loãng các mẫu huyết tương ban đầu (100- lần) bằng cách thêm dung dịch đệm (xem Phương pháp). Tín hiệu từ liên kết không đặc hiệu gần với mức nền nội tại (~ 43 nA), có khả năng được hưởng lợi từ hệ số pha loãng cao. Chúng tôi cũng xác nhận rằng kết quả xét nghiệm khớp với kết quả từ ELISA thông thường (R 2=0. 961, Hình 3e). Tuy nhiên, xét nghiệm cMES nhanh hơn (1 giờ) so với ELISA (4 giờ), chủ yếu là do động học liên kết nhanh; trong cMES, MB bắt AA trong toàn bộ thể tích mẫu (khuếch tán 3- chiều), trong khi thu AA dựa vào khuếch tán chiều 1- trong ELISA dựa trên tấm.

Giám sát AA ở chuột được điều trị bằng huyết tương

Chúng tôi đã áp dụng cMES để phân tích mức AA ở chuột sau một lần điều trị huyết tương. Vì AA có tự nhiên trong máu cuống rốn của con người, việc tiêm huyết tương sẽ làm tăng thêm mức AA của chuột. Nồng độ AA trung bình từ sáu huyết tương dây rốn người khác nhau là 7,2 ± 0. 5 µg / mL (trung bình ± SEM). Chúng tôi đã tiêm 13 0 µL huyết tương dây rốn người cho chuột (n=6) và theo dõi mức AA của chúng (Hình 4a). Tiêm huyết tương ngay lập tức làm tăng mức AA trong máu (ngày thứ 3; p <0,01, so="" với="" tất="" cả="" các="" thời="" điểm="" khác),="" nhưng="" hiệu="" quả="" là="" tạm="" thời;="" mức="" aa="" trở="" lại="" bình="" thường="" 7="" ngày="" sau="" khi="" điều="" trị="" (p="0." 34,="" so="" với="" thời="" điểm="" trước="" khi="" tiêm="" huyết="">

Tiếp theo, chúng tôi theo dõi nồng độ AA trong huyết tương sau toàn bộ lịch trình điều trị (Hình S1). Ba nhóm chuột khác nhau đã được sử dụng: nhóm được xử lý plasma (n=8) và nhóm giả (n=8) tuổi (20-23 tháng tuổi) và nhóm kiểm soát trẻ (<8 months="" old,="" n="5)." we="" used="" 0.5="" µl="" of="" mouse="" plasma="" for="" each="" measurement.="" the="" sham="" group="" showed="" lower="" aa="" level="" compared="" to="" the="" young="" group="" (p="0.003," fig.="" 4b).="" the="" plasma="" treated="" group,="" however,="" showed="" increased="" aa="" levels="" even="" after="" 1="" month="" after="" the="" treatment.="" the="" effect="" was="" sustained="" up="" to="" 4="" months="" post="" treatment;="" the="" plasma-treated="" group="" had="" higher="" aa="" level="" than="" the="" sham="" group="" (p="0.0003)." we="" also="" analyzed="" aliquots="" of="" samples="" via="" lc/ms="" (fig.="" 4c).="" the="" results="" from="" both="" assays="" were="" concordant,="" corroborating="" aa's="" value="" as="" a="">

Điều trị huyết tương dẫn đến cải thiện nhận thức và hành vi ở chuột già

Chúng tôi đã đánh giá thêm các kiểu hình hành vi của các nhóm động vật, đặc biệt là đánh giá khả năng học vận động và chức năng ghi nhớ của chúng. Chúng tôi đã thực hiện {{{0}} thử nghiệm rotarod thử nghiệm vào 1 và 4 tháng sau khi điều trị huyết tương hoặc giả (Hình 5a); Độ trễ (thời gian chạy) của chuột trước khi rơi xuống thanh quay được sử dụng để đánh giá hoạt động vận động của động vật. Vào thời điểm 1 tháng sau khi điều trị (20- tháng tuổi), thời gian tiềm tàng của cả nhóm giả và nhóm được điều trị bằng huyết tương thấp hơn đáng kể (p <0,0001) so="" với="" trẻ="" (5-="" tháng="" tuổi)="" )="" nhóm="" (hình="" 5b).="" tuy="" nhiên,="" nhóm="" được="" điều="" trị="" bằng="" huyết="" tương="" cho="" thấy="" sự="" cải="" thiện="" dần="" dần="" về="" khả="" năng="" học="" tập="" vận="" động="" và="" trí="" nhớ,="" trong="" khi="" khả="" năng="" tương="" tự="" lại="" giảm="" ở="" nhóm="" giả.="" các="" thay="" đổi="" về="" mức="" aa="" đã="" tiến="" hành="" các="" thay="" đổi="" về="" hành="" vi,="" có="" thể="" đóng="" vai="" trò="" như="" một="" chỉ="" báo="" ban="" đầu="">chống lão hóahiệu quả điều trị (Hình 5c).

Phân tích mô não (Hình 5d, 5e) cho thấy những con chuột già (nhóm giả hình) có diện tích các tế bào dương tính với DCX trong vùng tiểu não thất nhỏ hơn so với những con chuột non. Ngược lại, diện tích các tế bào dương tính với DCX tăng lên ở động vật được xử lý huyết tương và không thay đổi (p=0. 04) cho thấy rằng huyết tương dây rốn được tiêm kích thích sự hình thành thần kinh của não già. Kết quả cho thấy lợi ích tiềm năng của điều trị huyết tương đối với sự hình thành thần kinh bền vững dẫn đến cải thiện chức năng vận động ở nhóm được điều trị.

Thảo luận

Những tiến bộ trong liệu pháp trẻ hóa đồng thời làm tăng nhu cầu về một thước đo khách quan và định lượng để đọc ra hiệu quả điều trị. Do đó, chúng tôi đã thiết kế nghiên cứu của mình để xác định các dấu ấn sinh học phân tử có thể giải thích tốt nhất các đặc điểm kiểu hình của quá trình lão hóa vàchống lão hóasự đối đãi. Các thí nghiệm trên động vật của chúng tôi đã dẫn đến những nhận xét sau: i) cấu hình chất chuyển hóa của các nhóm chuột trưởng thành và trẻ tuổi rõ ràng là khác nhau; và ii) tiêm huyết tương dây rốn người vào chuột già làm thay đổi mô hình chất chuyển hóa của chúng gần với mô hình chuyển hóa của chuột non. Thật thú vị, chúng tôi nhận thấy axit arachidonic (AA) là chất đánh dấu sinh học thay thế hiệu quả nhất chochống lão hóasự đối đãi; Sự trao đổi chất AA rất không được kiểm soát ở cả chuột trẻ và chuột được điều trị bằng huyết tương, và được phát hiện đóng vai trò quan trọng trong việc tương tác với các con đường trao đổi chất khác như chuyển hóa axit linoleic [10, 18].

Chúng tôi đã phát triển thêm một hệ thống cảm biến di động, nhanh (cMES) để tạo điều kiện thuận lợi cho việc phát hiện AA trong nghiên cứu thường quy và các cơ sở lâm sàng. Chúng tôi đặc biệt tích hợp một sơ đồ xét nghiệm cạnh tranh với làm giàu từ tính miễn dịch nhằm phát hiện các mục tiêu phân tử nhỏ (tức là các chất chuyển hóa) trực tiếp từ các mẫu huyết tương. Sự kết hợp này mang lại những ưu điểm sau. (i) Thử nghiệm được hưởng lợi từ động học liên kết nhanh, vì các hạt từ tính bắt AA trong toàn bộ thể tích mẫu (khuếch tán 3- chiều). (ii) Các quy trình khảo nghiệm (ví dụ, các bước rửa) được đơn giản hóa với các nam châm bên ngoài được sử dụng để thu thập hạt. (iii) Bằng cách tập trung từ tính các hạt liên kết AA gần điện cực phát hiện, tín hiệu phân tích tổng thể có thể được cải thiện (~ 72 phần trăm) [12]. Thật vậy, chúng tôi đã chỉ ra rằng xét nghiệm cMES sử dụng<1 µl="" of="" plasma="" with="" the="" total="" assay="" time="" within="" 1.5="" hour.="" both="" cmes="" and="" mass="" spectrometry="" consistently="" showed="" that="" plasma="" aa="" levels="" decrease="" with="" aging,="" but="" that="" they="" reversely="" increase="" with="" cord-plasma="" treatment.="" importantly,="" increases="" in="" aa="" levels="" could="" be="" an="" early="" indicator="" of="" improved="" cognitive="" functions="" in="" treated="" animals.="" these="" results="" highlight="" the="" utility="" of="" aa-cmes;="" with="" minimally="" invasive="" blood="" draw,="" individual="" patients="" can="" be="" monitored="" in="" a="" serial="" fashion="" to="" better="" assess="" treatment="">

Hình 5. Các xét nghiệm hành vi và phân tử. (A) 2- thử nghiệm Rotarod thử nghiệm được tiến hành vào 1 và 4 tháng sau khi tiêm huyết tương. (B) Nhóm được xử lý bằng huyết tương

cho thấy sự cải thiện tiến bộ trong phối hợp vận động; kết quả cuối cùng đã gần bằng với nhóm trẻ (thử nghiệm lần thứ hai vào lúc 3 tháng). Thời gian chạy của nhóm giả giảm dần theo sự lão hóa. * p <0. 0="" 5;="" **="" p=""><0. 0="" 1.="" (c)="" đối="" với="" nhóm="" được="" điều="" trị="" bằng="" huyết="" tương,="" mức="" aa="" tăng="" lên="" trước="" khi="" cải="" thiện="" chức="" năng="" vận="" động.="" *="" p=""><0. 05;="" **="" p=""><0,01; ***="" p=""><0,001. (d)="" tế="" bào="" não="" trong="" vùng="" dưới="" não="" thất="" được="" miễn="" dịch="" đối="" với="" một="" chất="" đánh="" dấu="" hình="" thành="" thần="" kinh,="" doublecortin="">

Thanh tỷ lệ là 5 0 µm. Lưu ý rằng nhóm giả có diện tích tế bào dương tính với DCX trong vùng dưới não thất nhỏ hơn đáng kể so với chuột non, trong khi diện tích này tăng lên ở động vật được xử lý huyết tương và không thay đổi. (E) Diện tích của các tế bào dương tính với DCX trong hình ảnh (D) được đo. * p <0. 05;="" ***="" p=""><>

AA đã được chứng minh là có tác dụng thúc đẩy tăng trưởng cơ bắp và phát triển não bộ [19, 20]. Các báo cáo khác cũng nêu bật những lợi ích tiềm năng của AA trong việcchống lão hóa[21, 22]. Nghiên cứu hiện tại phù hợp với những phát hiện này, nhưng phạm vi của nó chỉ giới hạn trong việc thiết lập mối quan hệ tương quan giữa các mức AA vàchống lão hóacác kiểu hình. Tuy nhiên, việc theo dõi AA nối tiếp chỉ ra rằng sự gia tăng AA ở những con chuột được điều trị bằng huyết tương có thể là từ các nguồn nội sinh chứ không phải từ huyết tương được truyền. Hơn nữa, duy trìchống lão hóaCác hiệu ứng đã được quan sát thấy ở chuột nhận thậm chí 4 tháng sau khi kết thúc điều trị huyết tương. Việc học vận động và các chức năng ghi nhớ được cải thiện; và số lượng tế bào tiền thân tế bào thần kinh trong não tăng lên. Những quan sát này cho thấy những thay đổi sinh lý ở những con chuột được điều trị bằng huyết tương; cơ chế chính xác vẫn chưa được làm sáng tỏ.

Một số hạn chế khác của nghiên cứu này cần được giải quyết trong các nghiên cứu trong tương lai. Đầu tiên, xét nghiệm cMES cần được tinh chỉnh để có độ chính xác cao hơn. Đặc biệt, với việc thiếu các mẫu âm tính thực sự (tức là các mẫu máu không có AA nội sinh), rất khó để tính đến các tín hiệu từ liên kết không đặc hiệu. Có thể hình dung, ảnh hưởng của nền máu có thể không đáng kể khi chúng tôi pha loãng mẫu 100- lần. Tuy nhiên, giả định như vậy sẽ được xác thực bằng cách sử dụng các mẫu huyết tương đã xóa AA có thể được chuẩn bị từ mô hình chuột thiếu AA [23] hoặc thông qua quá trình khử miễn dịch của AA. Thứ hai, chúng tôi tập trung vào việc phát hiện một chất chuyển hóa đơn lẻ trong quá trình chuyển hóa AA để đơn giản hóa, nhưng cách tiếp cận này có thể bỏ qua bối cảnh sinh học như tương tác giữa các chất chuyển hóa trong một con đường nhất định. Bao gồm một nhóm các chất chuyển hóa sẽ nắm bắt tốt hơn các nhiễu loạn chuyển hóa và cũng tăng độ chính xác chẩn đoán. cMES có thể dễ dàng mở rộng quy mô để phát hiện các điểm đánh dấu đa dạng trong khi tiêu thụ lượng mẫu nhỏ. Thứ ba, nội suy những phát hiện hiện tại đối với con người sẽ là một thách thức. Mặc dù chuột và người có chung con đường trao đổi chất, nhưng chuột có tỷ lệ trao đổi chất cao hơn 7- lần so với con người [24]. Thử nghiệm trên người là cần thiết để xác định liều huyết tương tối ưu để tiêm truyền và thiết lập các đường cơ sở cho các dấu ấn sinh học; được thông báo bởi các nghiên cứu trên động vật, chúng tôi đang lên kế hoạch cho các nghiên cứu trên người như vậy. Những nỗ lực này sẽ thúc đẩy sự phát triển củachống lão hóaliệu pháp, cải thiện chất lượng cuộc sống cá nhân cũng như giảm gánh nặng xã hội.

Phương pháp

Thiết kế thử nghiệm

Huyết tương được tách ra từ máu cuống rốn của con người được thu thập khi sinh. Huyết tương cuống rốn được sử dụng bằng cách truyền tĩnh mạch cho chuột già (18- tháng tuổi) và đối chứng giả (18- tháng tuổi) và chuột non (3- tháng tuổi là dương tính) kiểm soát) đã được tiêm với nước muối. Vào 1 và 4 tháng sau khi cấy ghép, 2- thử nghiệm rotarod thử nghiệm đã được tiến hành để đánh giá khả năng phối hợp vận động và trí nhớ dài hạn (Hình S1). Việc phân tích chất chuyển hóa không được nhắm mục tiêu được thực hiện trên máu của ba nhóm và phân tích định dạng sinh học xác địnhchống lão hóacon đường liên quan (chuyển hóa axit arachidonic). Cảm biến sinh học được phát triển để phát hiện axit arachidonic lưu thông trong máu một cách dễ dàng và hiệu quả.

Chuẩn bị mẫu máu cuống rốn

Máu dây rốn của con người được thu thập bởi Ban Đánh giá Tổ chức của Bệnh viện Đa khoa CHA (Seoul, Hàn Quốc, IRB No. CHAMC -2015- 08-130-009). Máu dây rốn của người được hiến tặng từ 4 người hiến và được điều trị bằng citrate-phasphate-dextrose với chất chống đông máu adenine (CPDA -1). Huyết tương máu cuống rốn người được phân lập bằng cách ly tâm ở 2, 000 g trong 15 phút ở nhiệt độ phòng. Các mẫu huyết tương cô lập được bảo quản ở -80 độ và được sử dụng với một chu kỳ đông lạnh-rã đông duy nhất ở nhiệt độ phòng.

Thí nghiệm động vật

Các quy trình dành cho động vật đã được phê duyệt bởi Ủy ban chăm sóc và sử dụng động vật của Đại học CHA (IACUC). Chúng tôi đã sử dụng 18- chuột cái C57BL / 6 tháng tuổi để đánh giá các rối loạn chuyển hóa và kiểu hình hành vi tương quan với sự lão hóa vàchống lão hóa. Các đối chứng dương tính là 3- chuột cái C57BL / 6 tháng tuổi. Tất cả những con chuột được nuôi ở nhiệt độ phòng trong chu kỳ sáng-tối tiêu chuẩn 12 giờ. Đối với chuột trưởng thành, huyết tương hoặc dung dịch muối trong máu cuống rốn (130 µL) được tiêm vào tĩnh mạch 12 lần trong 4 tuần. Huyết tương máu cuống rốn của người bị cô lập không được gộp chung và một con vật đã cho nhận được huyết tương dây rốn từ cùng một người hiến tặng. Số lượng động vật được sử dụng trong mỗi thí nghiệm được mô tả trong các phần phương pháp tương ứng. Huyết tương được thu thập qua ly tâm (3, 000 g, 15 phút ở nhiệt độ phòng).

Thu nhận chuyển hóa và phân tích dữ liệu

Để lập hồ sơ các chất chuyển hóa qua đường máu, máu được thu thập từ những con chuột bằng cách chọc thủng tim vào những thời điểm được chỉ định: nhóm trẻ (3- tháng tuổi, n=10), nhóm giả tạo ({{ 4}} tháng tuổi, n=10; 23- tháng tuổi, n=12), nhóm được xử lý huyết tương (20- tháng tuổi, n {{13 }}; 23- tháng tuổi, n=5). Các mẫu máu được phân tích bằng hệ thống sắc ký lỏng-khối phổ (LC-MS) (Agilent). Chúng tôi đã chuyển đổi các tệp LC / MS thành định dạng mzXML chuẩn (ProteoWizard) [25] và sau đó xử lý chúng bằng MAIT (bộ công cụ nhận dạng tự động chất chuyển hóa) [26] để phát hiện tính năng, phân tích thống kê và nhận dạng chất chuyển hóa. Các đặc điểm có ý nghĩa thống kê (tức là các chất chuyển hóa ion hóa và / hoặc phân mảnh) được xác định thông qua phân tích phương sai (ANOVA). Các tính năng này phù hợp với tất cả các chất chuyển hóa giả định có thể có trong cơ sở dữ liệu của cơ sở chuyển hóa [9] dựa trên tỷ lệ khối lượng / điện tích của ion phổ khối (dung sai m / z là 0. 0 05). Chúng tôi đặc trưng cho sự thay đổi chất chuyển hóa toàn cầu thông qua phân tích phân nhóm theo thứ bậc và cấu trúc vốn có của dữ liệu chuyển hóa thông qua phân tích thành phần chính (PCA). Hai hoặc ba lần lặp lại kỹ thuật (đảm bảo rằng biến thể kỹ thuật nhỏ hơn nhiều so với biến thể sinh học) trên mỗi con chuột được đưa vào học tập không giám sát như PCA và phân cụm phân cấp. Phân cụm phân cấp trên các thành phần chính (HCPC) được thực hiện bởi FactoMineR, một gói R [27]. Đối với phân tích chức năng, các con đường chuyển hóa có nhiều khả năng bị xáo trộn bởi quá trình lão hóa và xử lý huyết tương được xác định thông qua phân tích con đường KEGG (MetaboAnalyst 3.0) [28]. Phân bố siêu đo được sử dụng để đo lường sự đại diện quá mức của các chất chuyển hóa phù hợp trong các con đường KEGG cụ thể.

Chuẩn bị hạt từ tính miễn dịch

Các hạt từ tính (5 mg) được phủ bằng nhóm epoxy (Dynabeads M -270 Epoxy, Invitrogen) được lơ lửng trong 1 0 0 µL dung dịch natri photphat 0,1 M. Một trăm microgam kháng thể chống lại axit arachidonic (Biomatik) đã được thêm vào và trộn đều. Thêm một trăm microlit dung dịch amoni sulfat 3 M, và ủ hỗn hợp ở nhiệt độ phòng trong 2 giờ và sau đó được ủ tiếp ở 4 độ trong đêm với quay nghiêng chậm. Phản ứng cộng hợp được thực hiện ở pH=7. 4. Các quá trình này gây ra sự hình thành liên kết cộng hóa trị giữa các nhóm epoxy (hạt) và amin (kháng thể), mà chúng tôi đã xác nhận trước đây bằng cách đưa các liên hợp hạt kháng thể vào thử thách pH [29]. Trung bình 2,4 × 104 kháng thể được cố định trên mỗi hạt. Các hạt từ tính liên hợp kháng thể được tách bằng nam châm vĩnh cửu, rửa hai lần bằng dung dịch PBS, và tiếp tục lại trong 200 µL PBS với 1% BSA. Hạt được lưu trữ trong 4 độ lên đến một tháng.

HRP liên hợp với axit arachidonic

HRP sau đó được liên hợp với BSA thông qua hóa học khử amin. Cụ thể, 1 0 0 µg AA liên hợp BSA (RPU51089, Biomatik) được hòa tan trong 0,5 mL dung dịch đệm cacbonat-biocacbonat 0,2 M (pH 9,4), được thêm vào một miligam liên kết EZ đông khô Cộng với Peroxidase hoạt hóa (Thermo Scientific), và ủ trong 1 giờ ở nhiệt độ phòng. Tiếp theo, 10 µL natri cyanoborohydride (Thermo Scientific) được thêm vào và hỗn hợp này được ủ trong 15 phút ở nhiệt độ phòng. Cuối cùng, 20 µL đệm Quenching (Thermo Scientific) được thêm vào, sau đó ủ trong 15 phút ở nhiệt độ phòng. Điện di trên gel và phân tích dải protein đã xác nhận sự liên hợp HPR với BSA-AA (Hình S3a). AA liên hợp HRP được thu thập và cô đặc bằng bộ lọc ly tâm Amicon Ultra 100K (Millipore). Peroxidase còn lại và BSA-AA được rửa sạch bằng PBS trong bốn lần.

Điện hóa phát hiện AA trong các mẫu plasma

Để phát hiện AA bằng điện hóa, máu được thu thập từ nhóm trẻ (n {{0}}), nhóm giả (n=8) và được xử lý bằng huyết tương (n=5 trong 1 tháng và n=5 trong 3 tháng). Các mẫu huyết tương chuột (0. 5 µL) được pha loãng trong 50 µL 1 phần trăm BSA trong PBS (× 100- độ pha loãng gấp) và trộn với dung dịch hạt từ tính miễn dịch (50 µL) và dung dịch AA liên hợp HRP (50 µL). Lượng AA-HRP đủ lớn để bão hòa các vị trí liên kết trong hạt từ tính. Chúng tôi sử dụng khoảng 8,4 × 107 hạt cho mỗi thử nghiệm, tạo ra các vị trí gắn kết AA 2.0 × 1012. Lượng AA-HRP là ~ 1,7 × 1013; tỷ lệ giữa AA-HRP và các vị trí gắn kết là ~ 8: 1. Hỗn hợp được ủ ở nhiệt độ phòng trong 1 giờ với chuyển động quay nghiêng chậm. Hạt đối chứng được chuẩn bị bằng cách trộn 1 phần trăm BSA trong PBS (50 µL) với dung dịch hạt từ tính miễn dịch (50 µL) và dung dịch AA liên hợp HRP (50 µL). Tất cả các hạt phản ứng được tách bằng nam châm vĩnh cửu và rửa hai lần với 80 µL PBS (1% BSA). Cuối cùng, các hạt được gắn lại trong 7 µL PBS. Dung dịch hạt đã chuẩn bị và 20 µL dung dịch TMB (Biomatik) được nạp lên trên điện cực. Sau 6 phút, phép đo chronoamperometry được bắt đầu. Chúng tôi đã sử dụng một cảm biến điện hóa thu nhỏ (một hệ thống nguyên mẫu do AcurreHealth Inc. phát triển). Các mức hiện tại trong phạm vi 40-45 được tính trung bình. Chúng tôi đã sử dụng hệ số chuyển đổi (× 100) để báo cáo nồng độ AA gốc ước tính trong huyết tương.

Xét nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết với enzym (ELISA)

Các thí nghiệm ELISA được thực hiện bằng cách sử dụng kit ELISA axit arachidonic (AA) trên chuột (Biomatik) theo hướng dẫn sản xuất. AA pha loãng lần lượt được thêm vào mỗi giếng, và ủ với AA liên hợp HRP ở 37 độ trong 40 phút. Sau khi rửa bằng đệm rửa bốn lần, dung dịch TMB được thêm vào và ủ trong 20 phút. Sự phát triển màu đã bị dừng lại bằng cách thêm dung dịch dừng. Độ hấp thụ được đọc ở bước sóng 450 nm bằng đầu đọc vi tấm (Tecan).

Kiểm tra Rotarod

Chúng tôi đã sửa đổi thử nghiệm Rotarod của Kong et al. [30] để đánh giá sự phối hợp vận động cơ địa. Rotarod có thanh đường kính 3- cm khởi động ở tốc độ 4 vòng / phút và tăng tốc 4 vòng / phút trong 30 giây trong 5 phút. Các con chuột được đặt trên thanh, và thời gian để chuột rơi khỏi thanh được đo. Mỗi con chuột được cho thử nghiệm 3 lần mỗi ngày, và thời gian chạy mỗi ngày được tính là trung bình của số lần huấn luyện. Thử nghiệm rotarod đầu tiên được tiến hành vào 1- tháng sau khi điều trị bằng huyết tương: nhóm trẻ (n=29), nhóm giả (n=17), nhóm được điều trị bằng huyết tương (n {{ 11}}). Một khóa đào tạo lại đã được bắt đầu sau 4- tháng sau khi điều trị bằng huyết tương. Để tránh tình trạng đào tạo quá tải, việc đào tạo lại được tiến hành trong 2 ngày. Các thủ tục khác giống như phiên đầu tiên.

Hình ảnh mô não

Vào 1 tháng (n=4) và 4 tháng (n=3) sau khi tiêm huyết tương cuống rốn người hoặc tiêm nước muối, động vật được gây tử vong và sau đó được truyền 4 phần trăm paraformaldehyde (PFA) và PBS thông qua tâm thất trái. Nhóm trẻ (n=5) và nhóm giả tạo (n=4) được sử dụng làm đối tượng kiểm soát. Bộ não của họ đã

chiết xuất và bảo vệ lạnh. Mỗi bộ não được cắt trên một cryotome có độ dày 30 μm. Đến

thực hiện hóa mô miễn dịch, liên kết không đặc hiệu đã bị chặn với 5 phần trăm huyết thanh dê bình thường trong 0. 3 phần trăm Triton X -100 trong 40 phút. Kháng thể chính chống lại Doublecortin (DCX; 1: 400, Cell Signaling, # 4604S) được sử dụng qua đêm ở 4 độ, và sau đó PBS được sử dụng để rửa [31]. Kháng thể thứ cấp Alexa Fluor 488 (1: 2000, Invitrogen, # A11008) được sử dụng để phát hiện DCX. Hình ảnh được chụp bằng kính hiển vi huỳnh quang (Nikon Eclipse 80i) và được phân tích bằng Hình ảnh J [32].

Phân tích thống kê

Phân tích thống kê được thực hiện bằng cách sử dụng các hàm cơ bản R và lme4, một gói R cho một trong hai tuyến tính

Mô hình hiệu ứng hỗn hợp hoặc mô hình tuyến tính tổng quát

(GLM) sau đó là một bài kiểm tra LSD sau giờ học [33]. Dữ liệu được trình bày dưới dạng giá trị trung bình ± sai số chuẩn và giá trị ap của <0. 05="" được="" coi="" là="" quan="">

Vật liệu bổ sung

Số liệu bổ sung.

http://www.thno.org/v09p0001s1.pdf

Sự nhìn nhận

Chúng tôi cảm ơn AccureHealth Inc. đã cung cấp cảm biến điện hóa thu nhỏ. Nghiên cứu này được hỗ trợ một phần bởi khoản tài trợ của Viện Xúc tiến Công nghệ Thông tin và Truyền thông (IITP) do Chính phủ Hàn Quốc (MSIT) tài trợ (2017M3A9B4025699).

Lợi ích cạnh tranh

Các tác giả đã tuyên bố rằng không tồn tại lợi ích cạnh tranh.