Hít Sevoflurane trong thời gian ngắn có thể làm giảm sự hình thành sẹo thần kinh đệm sau chấn thương não do thiếu oxy-thiếu máu cục bộ ở chuột sơ sinh Phần 2

PCR thời gian thực

Tổng RNA được chiết xuất từ ​​​​các mô hồi hải mã của chuột con vào lúc 12, 24 và 48 giờ sau phẫu thuật bằng TRIzolreagent (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). DNA bổ sung được tổng hợp bằng bộ Superscript II RT-PCR tiên tiến (Invitrogen).

Chấn thương do thiếu oxy-thiếu máu cục bộ đề cập đến tình trạng bệnh lý do thiếu máu não, thiếu oxy, rối loạn chuyển hóa và tổn thương tế bào thần kinh do rối loạn hệ thống tim mạch và mạch máu não. Với tiến bộ xã hội và thay đổi lối sống, chấn thương do thiếu oxy-thiếu máu cục bộ ngày càng trở nên phổ biến. Tình trạng này có thể gây ra nhiều tác hại cho sức khỏe con người, trong đó có ảnh hưởng đến trí thông minh và trí nhớ của con người.

Mặc dù tình trạng thiếu oxy và thiếu máu cục bộ có thể gây suy giảm chức năng não nhưng điều đó không có nghĩa là trí nhớ sẽ bị ảnh hưởng tiêu cực. Ngược lại, chúng ta có thể cải thiện trí nhớ và tăng hiệu quả hoạt động của não thông qua các phương pháp phù hợp. Dưới đây là một số cách giúp cải thiện trí nhớ của bạn:

1. Chế độ ăn uống lành mạnh: Tác động của chế độ ăn uống đến trí nhớ là rất quan trọng. Thực phẩm giàu protein, vitamin và khoáng chất có thể giúp duy trì hệ thần kinh và chức năng tư duy khỏe mạnh.

2. Tập thể dục nhiều hơn: Tập thể dục có thể thúc đẩy tuần hoàn máu, tăng lưu lượng oxy, tăng cường khả năng miễn dịch của cơ thể và giảm nguy cơ mắc bệnh. Thông qua tập thể dục, bạn có thể cải thiện khả năng ghi nhớ của mình.

3. Tăng cường sự tự tin: Sự tự tin là yếu tố quan trọng trong trí nhớ của một người. Nếu bạn tin rằng mình có thể hoàn thành một nhiệm vụ nào đó, bạn sẽ dễ dàng đạt được kết quả như mong muốn, đồng thời bạn cũng có thể cải thiện trí nhớ của mình một cách hiệu quả.

Có thể thấy, chấn thương do thiếu oxy-thiếu máu cục bộ không phải là tình trạng chắc chắn sẽ gây tổn hại đến trí nhớ của con người. Chỉ cần nắm vững các phương pháp đúng và chăm sóc tốt bộ não của mình, chúng ta có thể đón nhận một tương lai khỏe mạnh với thái độ tích cực. Có thể thấy rằng chúng ta cần cải thiện trí nhớ, và Cistanche Deserticola có thể cải thiện đáng kể trí nhớ, bởi vì Cistanche Deserticola có tác dụng chống oxy hóa, chống viêm và chống lão hóa, có thể giúp làm giảm quá trình oxy hóa và các phản ứng viêm trong não, từ đó bảo vệ cơ thể. sức khỏe của hệ thần kinh. Ngoài ra, Cistanche Deserticola cũng có thể thúc đẩy sự phát triển và sửa chữa các tế bào thần kinh, do đó tăng cường khả năng kết nối và chức năng của mạng lưới thần kinh. Những tác động này có thể giúp cải thiện trí nhớ, tốc độ học tập và tư duy, đồng thời cũng có thể ngăn ngừa sự phát triển của rối loạn chức năng nhận thức và các bệnh thoái hóa thần kinh.

Bấm vào biết cách cải thiện chức năng não

Thuốc nhuộm huỳnh quang SYBR Green I (SYBR Green PCRMaster Mix, Hệ thống sinh học ứng dụng, Thành phố Foster, CA, Hoa Kỳ) và 1μL DNA bổ sung được phiên mã ngược đã được sử dụng để phát hiện sự tổng hợp DNA bằng PCR thời gian thực với các mồi đặc hiệu HIF{2}}.

Trong hệ thống khuếch đại DNA thời gian thực gen rotor (Corbett Research, Sydney, Australia), PCR được thực hiện với các chu kỳ sau: biến tính ở 95 độ trong 15 phút; 40 chu kỳ 95 độ (20 giây), ủ ở 58 độ trong 25 giây. và kéo xuống ở góc 72 độ trong 35 giây. Việc giám sát sản phẩm huỳnh quang được thực hiện trong thời gian dài ở nhiệt độ 72 độ.

Phần mềm phân tích gen rôto (Corbett Research) đã được sử dụng để chuẩn hóa gen giữ nhà GAPDH và định lượng biểu hiện gen tương đối. Tất cả các trình tự mồi được thể hiện trong Bảng 1.

nhuộm Nissl
Não chuột được chuẩn bị thành từng lát 28 ngày sau phẫu thuật như mô tả ở trên để hóa mô miễn dịch. Mỗi bộ não được cắt liên tiếp và ba phần não tương tự được chọn để nhuộm Nissl.

Sử dụng máy ảnh kính hiển vi kỹ thuật số Nikon C1 (Nikon Corporation, Tokyo, Nhật Bản), các bức ảnh vi mô điển hình của vùng đồi thị CA1, CA3 và DGareas đã được chụp. Một số ô được tính trong mỗi phần trong số ba phần được thực hiện một cách mù quáng bằng phần mềm ImageJ.

Kiểm tra hành vi

Chuột được cai sữa sau 3 tuần, chia thành 3 đến 5 nhóm và được nhốt trong lồng theo sự phân công của nhóm. Các xét nghiệm hành vi được tiến hành trên chuột P28–P33 (tức là 21–26 ngày sau phẫu thuật), như đã mô tả trước đây (Wang và cộng sự, 2019a ) nhưng có sửa đổi một chút. Để loại trừ ảnh hưởng của chu kỳ động dục lên hành vi của loài gặm nhấm, chỉ có chuột đực được thử nghiệm.

Mê cung nước Morris

Thử nghiệm mê cung nước Morris được sử dụng để đánh giá khả năng học tập và ghi nhớ không gian của chuột P28–P33 (Wang và cộng sự, 2019a).

Kiểm tra bao gồm hai giai đoạn bao gồm phần đào tạo và kiểm tra tìm kiếm không gian. Trong 5 ngày liên tiếp, bốn phần huấn luyện được triển khai hàng ngày, bắt đầu lúc 8:00sáng. Để thử nghiệm phát hiện nền tảng, 10 con chuột từ mỗi nhóm được đặt riêng lẻ xuống nước ở nhiều địa điểm khác nhau, một cách ngẫu nhiên, đối diện với bức tường của hồ bơi.

Nếu một con chuột phát hiện thành công nền tảng trong vòng 90 giây, nó buộc phải ở lại nền tảng trong 20 giây và thời gian cần thiết để phát hiện nền tảng được ghi lại là độ trễ thoát. Mỗi vòng thử nghiệm kéo dài 90 giây và thời gian trốn thoát được đo bằng thời gian từ khi con chuột được thả xuống nước cho đến khi lên được bục thành công.

Nếu chuột không tìm thấy bệ trong vòng 90 giây, quá trình ghi sẽ dừng lại và thực hiện hướng dẫn học tập và ghi nhớ (người thí nghiệm sử dụng một cây gậy dài để dẫn chuột đến bệ và cho phép chúng ở lại trên bệ trong 20 giây để học). Trong quá trình thử nghiệm, độ trễ trốn thoát của những con chuột không vào được giai đoạn được ghi nhận là 90 giây.

Trong thử nghiệm thăm dò không gian được thực hiện vào ngày thử nghiệm thứ sáu, nền tảng đã được gỡ bỏ và con chuột được đặt ở góc phần tư đối diện và được phép bơi trong 90 giây. Tốc độ bơi, độ trễ thoát hiểm và số lần họ băng qua nơi đặt bệ trước đó đã được hệ thống theo dõi video (Shanghai MobileDatum Ltd., Thượng Hải, Trung Quốc) ghi lại.

Kiểm tra hệ thống treo

Thử nghiệm hệ thống treo được thực hiện trên chuột P28–P32 để đánh giá chức năng vận động của chúng, bắt đầu lúc 3 giờ chiều mỗi ngày. Dây nhựa có chiều ngang có đường kính 0,5 cm được đặt cách mặt đất 45 cm và chuột được hướng dẫn giữ dây nhựa bằng cả hai chi trên, tại thời điểm đó thời gian cho đến khi chuột rơi được đo bằng độ trễ tạm dừng. Thử nghiệm kết thúc nếu: (i) con chuột bị ngã; (ii) độ trễ tạm dừng lớn hơn 60 giây; hoặc (iii) sợi dây bị vướng vào chi sau.

Thử nghiệm hiện trường mở

Thử nghiệm ngoài trời được tiến hành trên chuột P28 bằng thiết bị ngoài trời bao gồm hộp Plexiglas (100 cm × 100 cm; Borj Sanat, Tehran, Iran) được bao quanh bởi bức tường cao 45-cm, có sàn được chia thành 16 ô vuông. Khu vực trung tâm là khu vực có kích thước 50 cm × 50 cm ở trung tâm của đấu trường. Mỗi con chuột được đặt riêng ở trung tâm của đấu trường và được phép khám phá không giới hạn trong 10 phút.

Hệ thống theo dõi video (Borj Sanat) đã được sử dụng để ghi lại và phân tích tổng hành trình (như một chỉ báo về hoạt động tập thể dục) và thời gian dành cho khu vực trung tâm (như một chỉ báo về hành vi lo lắng) (Zhai et al., 2019).

nhuộm Golgi

Sau khi hoàn thành kiểm tra hành vi (tức là 26 ngày sau phẫu thuật), năm con chuột được chọn ngẫu nhiên từ mỗi nhóm. Nhuộm Golgi được thực hiện trên các phần não đông lạnh dày 150-μm bằng cách sử dụng Bộ nhuộm Golgi nhanh FD (FDNeuroTechnology, Columbia, MD, USA) theo giao thức của nhà sản xuất.

Phần mềm ImageJ được sử dụng để phân tích mật độ cột sống (số cột sống trên 10 μm) của mỗi tế bào thần kinh. Các gai được tính trên hai hoặc ba đoạn nhánh thứ cấp.

Phân tích thống kê

SPSS 17.0 dành cho Windows (SPSS Inc., Chicago, IL, USA) đã được sử dụng để phân tích dữ liệu, được hiển thị dưới dạng trung bình ± sai số chuẩn của giá trị trung bình (SEM). Thử nghiệm Shapiro-Wilk được sử dụng để kiểm tra giả định về tính quy phạm giữa tất cả các biến liên tục. Ngoài ra, phân tích phương sai một chiều theo sau là các thử nghiệm so sánh đa biến hậu nghiệm của Tukey đã được tiếp cận trong một chuỗi các thí nghiệm.

Nếu dữ liệu không đáp ứng được giả định về tính chuẩn, bài kiểm tra Kruskal-Wallis H hoặc Mann-Whitney Utest sẽ được hoàn thành riêng biệt. Độ trễ thoát được phân tích dựa trên phân tích phương sai hai chiều cho các phép đo lặp lại. Giá trị P < 0,05 được coi là có ý nghĩa thống kê.

Kết quả

SPC cải thiện tình trạng mất tế bào thần kinh vùng đồi thị

Hồi hải mã, bao gồm ba vùng được kiểm tra, có liên quan đến khả năng học tập và trí nhớ (Jung và cộng sự, 2020). Sau thử nghiệm hành vi, nhuộm Nissl được thực hiện để kiểm tra kiến ​​trúc vùng đồi thị.

Trong nhóm HI, mật độ tế bào thần kinh khả thi đã giảm so với nhóm giả. Tuy nhiên, số lượng tế bào thần kinh đã tăng lên ở động vật tiếp xúc với SPC; hiệu ứng này bị đảo ngược bởi YC-1, làm giảm mật độ tế bào thần kinh (Hình 1A). Hiện tượng này được quan sát thấy ở vùng CA1, CA3 và DG của vùng hải mã (P< 0.05; Figure 1B–D).

SPC cải thiện và giảm mật độ gai cột sống ở vùng CA1 vùng đồi thị

Nhuộm Golgi được sử dụng để phát hiện mật độ cột sống thần kinh hình chóp CA1 (Hình 2A). Bởi vì kích thước của gai rất đa dạng (ví dụ: nhánh nhánh, mỏng hoặc hình nấm), chúng tôi chỉ xác định được rằng mật độ gai đuôi gai tăng đáng kể ở nhóm HIS so với nhóm HI (P < 0.{{6 }}5), trong khi mật độ gai đuôi gai giảm ở nhóm HIS + YC-1 so với nhóm HIS (P < 0,01; Hình 2B).
SPC cải thiện biểu hiện PSD95 và GAP43 ở vùng hải mã

Chúng tôi đã đánh giá sự biểu hiện của các protein liên quan đến khớp thần kinhGAP43 và PSD95 để xác định xem chúng có bị ức chế bởi sẹo thần kinh đệm hay không. HI làm giảm đáng kể biểu hiện protein PSD95 (P < 0.01) vàGAP43 (P <0,05) so với nhóm giả dược (Hình 2C–E). So với nhóm HIS, mức biểu hiện của PSD95 và GAP43 đã giảm đáng kể sau khi tiêm YC{12}}.

Sự hình thành astrogliosis và sẹo thần kinh đệm làm tổn thương cấu trúc vùng đồi thị sau HI

Tiếp theo, chúng tôi cố gắng xác minh xem liệu Sevoflurane có cải thiện chức năng học tập và trí nhớ hay không bằng cách bảo vệ cấu trúc hồi hải mã và làm giảm chứng astrogliosis. HIE sơ sinh gây ra apoptosis thần kinh ở vùng hải mã, cũng như bệnh astrogliosis phản ứng ở vùng nhồi máu mà sau đó phát triển thành sẹo thần kinh đệm (Rolls và cộng sự, 2009).

Trong nhóm HI, các lớp hình chóp CA1 và CA3 cũng như vùng DG cho thấy số lượng tế bào thần kinh giảm rõ rệt (P < 0.01, P < 0.001; Hình3E và 4C), cũng như số lượng tế bào hình sao tăng lên với những thay đổi hình thái rõ rệt (P <0,001; Hình 3C và 4B). Chúng tôi đã đánh giá biểu hiện của GFAP và NeuN ở ba khu vực của đồi hải mã bên trái bằng cách sử dụng hóa mô miễn dịch và phân tích vết rạn da phương Tây.

Kết quả của chúng tôi cho thấy rằng so với nhóm giả, tế bào hình sao được kích hoạt trong nhóm HI, được đưa vào lớp kim tự tháp CA1 (Hình 4A) và CA3 (Hình 3A) và các nơ-ron bao quanh trong DG (Hình 3B). Chứng astrogliosis quá mức dẫn đến sự mở rộng hơn nữa của các quá trình thần kinh đệm hướng tới các cấu trúc thần kinh bình thường, hình thành một mạng lưới tế bào hình sao giống như bức tường bất thường (Hình 3A, B và 4A).

Hơn nữa, khả năng phản ứng miễn dịch của GFAP (Hình 3C, D và 4B, E) và mức protein đã tăng lên (P < 0.01; Hình 4E), trong khi khả năng phản ứng miễn dịch NeuN giảm (P < {{7} },01 orP < 0,001; Hình 3E, F và 4C). Để xác minh thêm sự hình thành sẹo thần kinh đệm, chúng tôi đã đánh giá mức độ biểu hiện protein thần kinh và khả năng phản ứng miễn dịch ở vùng hải mã (Hình 5A, B và 6A).

Kết quả của phương pháp miễn dịch huỳnh quang đánh dấu kép cho thấy sự khác biệt đáng chú ý về cường độ huỳnh quang của chất tạo miễn dịch tế bào thần kinh+/GFAP+ giữa nhóm HI và nhóm giả (P < 0.001, P < 0,05, P < 0,01; Hình 5G, H và 6D), phù hợp với kết quả Western blot (P< 0.01; Figure 6F).

SPC làm giảm sự hình thành astrogliosis và sẹo thần kinh đệm ở vùng hải mã

Tiếp theo, nghiên cứu của chúng tôi đã điều tra xem liệu SPC có làm giảm sẹo thần kinh đệm hay không. So với nhóm HI, khả năng phản ứng miễn dịch của GFAP (Hình 5C, D và 6C) và thuốc thần kinh (Hình 5E, F và 6B) trong nhóm HIS được điều hòa giảm rõ rệt ở vùng hải mã (P < 0.{{6} }1 hoặc P < 0,001).

Ngược lại, biểu hiện GFAP và thần kinh trong nhóm HIS + YC-1 tăng đáng kể so với nhóm HIS và không khác biệt so với nhóm HIS + YC-1 và HI (P > 0.05; Hình 6E và F).

Ngoài ra, khả năng dương tính miễn dịch NeuN được điều chỉnh tăng và các cấu trúc xuất hiện có trật tự hơn trong nhóm HIS so với nhóm HI, bị đảo ngược bởi YC-1 (Hình 3E, F và 4C).

For more information:1950477648nn@gmail.com