Hít Sevoflurane trong thời gian ngắn có thể làm giảm sự hình thành sẹo thần kinh đệm sau chấn thương não do thiếu oxy-thiếu máu cục bộ ở chuột sơ sinh Phần 1
May 13, 2024
trừu tượng
Các nghiên cứu trước đây đã chứng minh rằng điều hòa sau Sevoflurane có thể cung cấp khả năng bảo vệ thần kinh sau chấn thương do thiếu oxy-thiếu máu cục bộ và cải thiện chức năng học tập và trí nhớ trong việc phát triển não bộ của loài gặm nhấm.
Chấn thương do thiếu oxy-thiếu máu cục bộ đề cập đến tình trạng bệnh lý do thiếu máu não, thiếu oxy, rối loạn chuyển hóa và tổn thương tế bào thần kinh do rối loạn hệ thống tim mạch và mạch máu não. Với tiến bộ xã hội và thay đổi lối sống, chấn thương do thiếu oxy-thiếu máu cục bộ ngày càng trở nên phổ biến. Tình trạng này có thể gây ra nhiều tác hại cho sức khỏe con người, trong đó có ảnh hưởng đến trí thông minh và trí nhớ của con người.
Mặc dù tình trạng thiếu oxy và thiếu máu cục bộ có thể gây suy giảm chức năng não nhưng điều đó không có nghĩa là trí nhớ sẽ bị ảnh hưởng tiêu cực. Ngược lại, chúng ta có thể cải thiện trí nhớ và tăng hiệu quả hoạt động của não thông qua các phương pháp phù hợp. Dưới đây là một số cách giúp cải thiện trí nhớ của bạn:
1. Chế độ ăn uống lành mạnh: Tác động của chế độ ăn uống đến trí nhớ là rất quan trọng. Thực phẩm giàu protein, vitamin và khoáng chất có thể giúp duy trì hệ thần kinh và chức năng tư duy khỏe mạnh.
2. Tập thể dục nhiều hơn: Tập thể dục có thể thúc đẩy tuần hoàn máu, tăng lưu lượng oxy, tăng cường khả năng miễn dịch của cơ thể và giảm nguy cơ mắc bệnh. Thông qua tập thể dục, bạn có thể cải thiện khả năng ghi nhớ của mình.
3. Tăng cường sự tự tin: Sự tự tin là yếu tố quan trọng trong trí nhớ của một người. Nếu bạn tin rằng mình có thể hoàn thành một nhiệm vụ nào đó, bạn sẽ dễ dàng đạt được kết quả như mong muốn, đồng thời bạn cũng có thể cải thiện trí nhớ của mình một cách hiệu quả.
Có thể thấy, chấn thương do thiếu oxy-thiếu máu cục bộ không phải là tình trạng chắc chắn sẽ gây tổn hại đến trí nhớ của con người. Chỉ cần nắm vững các phương pháp đúng và chăm sóc tốt bộ não của mình, chúng ta có thể đón nhận một tương lai khỏe mạnh với thái độ tích cực. Có thể thấy, chúng ta cần cải thiện trí nhớ, và Cistanche Deserticola có thể cải thiện trí nhớ đáng kể vì Cistanche Deserticola là một dược liệu cổ truyền của Trung Quốc có nhiều tác dụng độc đáo, một trong số đó là cải thiện trí nhớ. Hiệu quả của Cistanche Deserticola đến từ nhiều thành phần hoạt chất có trong nó, bao gồm axit tannic, polysaccharides, flavonoid glycoside, v.v. Những thành phần này có thể tăng cường sức khỏe não bộ thông qua nhiều con đường khác nhau.
Bấm biết 10 cách cải thiện trí nhớ
Mô hình Rice-Vannucci cổ điển đã được sử dụng để gây ra tổn thương do thiếu oxy-thiếu máu cục bộ và chuột sơ sinh (ngày thứ 7 sau sinh) được điều trị bằng 2,4% Sevoflurane trong 30 phút sau khi bị tổn thương do thiếu oxy-thiếu máu cục bộ.
Kết quả của chúng tôi cho thấy rằng điều hòa hậu Sevoflurane đã cải thiện đáng kể chức năng học tập và trí nhớ của chuột, giảm sự hình thành astrogliosis và glialscar, tăng số lượng gai đuôi gai và bảo vệ mô hình học của vùng hải mã. Về mặt cơ học, điều hòa hậu Sevoflurane làm giảm biểu hiện của yếu tố thiếu oxy cảm ứng-1 của von Hippel-Lindau và tăng biểu hiện của DJ-1.
Tiêm 1,52 ug yếu tố gây thiếu oxy-1 chất ức chế YC-1 (Lificiguat) vào tâm thất bên trái 30 phút trước khi tổn thương do thiếu oxy-thiếu máu cục bộ làm đảo ngược khả năng bảo vệ thần kinh do sevoflurane gây ra. Phát hiện này cho thấy rằng Sevoflurane có thể làm giảm bớt tình trạng astrogliosis ở vùng hải mã một cách hiệu quả và giảm suy giảm khả năng học tập và trí nhớ do hình thành sẹo thần kinh đệm sau chấn thương do thiếu oxy-thiếu máu cục bộ.
Cơ chế cơ bản có thể liên quan đến biểu hiện DJ{0}} được điều chỉnh tăng, giảm sự phổ biến của yếu tố gây thiếu oxy-1 và biểu hiện yếu tố gây thiếu oxy-1 được ổn định. Nghiên cứu này đã được phê duyệt bởi Ủy ban Chăm sóc Động vật Phòng thí nghiệm của Đại học Y Trung Quốc, Trung Quốc (số phê duyệt 2016PS337K) vào ngày 9 tháng 11 năm 2016.
Từ khóa: chấn thương sọ não; não; hệ thống thần kinh trung ương; in vivo; chấn thương; người mẫu; độ dẻo; con chuột; sự hồi phục; sự tái tạo; sửa chữa Thư viện Trung Quốc Phân loại số R453; R741; R614.2+1.
Giới thiệu
Bệnh não do thiếu oxy-thiếu máu cục bộ ở trẻ sơ sinh (HIE) là một biến chứng thường gặp trong thời kỳ sơ sinh do nhiều yếu tố gây ra, chẳng hạn như ngạt sơ sinh, suy trong tử cung và bệnh màng trong (Douglas-Escobar và Weiss, 2015; Barkhuizen và cộng sự, 2017).
HIE là nguyên nhân hàng đầu gây tử vong ở trẻ sơ sinh và là nguồn gốc chính gây ra di chứng thần kinh (Edwards và cộng sự, 2010; Descloux và cộng sự, 2015). Chín mươi phần trăm những người sống sót sau HIE bị rối loạn chức năng thần kinh lâu dài, chẳng hạn như rối loạn chức năng học tập, nhận thức và vận động, và động kinh (Doi và cộng sự, 2012; Davies và cộng sự, 2019). Việc điều trị HIE hiện nay chủ yếu tập trung vào điều trị triệu chứng, bao gồm thở máy, điều chỉnh tình trạng hạ huyết áp, bổ sung glucose và hạn chế lượng dịch đưa vào một cách thích hợp.
Tuy nhiên, cần phải có một phương pháp điều trị hiệu quả có khả năng đảo ngược hoặc giảm tổn thương não lâu dài (Stankowski và Gupta, 2011; Davidson và cộng sự, 2015). Là một phần quan trọng của quá trình học tập và nhận biết, hồi hải mã, bao gồm cả hồi răng (DG) , CA1 và CA3, tham gia chuyển đổi và tích hợp thông tin ngoại vi vào các trung tâm thần kinh (Morris và cộng sự, 2012; Jung và cộng sự, 2020).
Hồi hải mã rất nhạy cảm với tổn thương do thiếu oxy-thiếu máu cục bộ (HI), điều này có thể gây ra hiện tượng apoptosis của tế bào thần kinh vùng đồi thị, kích thích phản ứng thần kinh đệm quá mức và dẫn đến hình thành sẹo thần kinh đệm (Hopkins và Haaland, 2004; Wang và cộng sự, 2012). Sự tăng sinh của tế bào hình sao là rất quan trọng để bịt kín vị trí nhồi máu, tái cấu trúc vùng hải mã và kiểm soát tạm thời các phản ứng miễn dịch cục bộ trong giai đoạn cấp tính (Rolls và cộng sự, 2009).
Tuy nhiên, sự hình thành sẹo phì đại và sẹo thần kinh đệm góp phần tạo ra tế bào thần kinh bất thường, cản trở sự phát triển của đuôi gai và cản trở hình dạng khớp thần kinh, làm suy giảm thêm chức năng học tập và nhận biết (Yiuand He, 2006; Wanner và cộng sự, 2008; Burda và Sofroniew, 2014; Pekny và cộng sự. , 2014; Shi và cộng sự, 2017).
Protein axit fibrillary thần kinh đệm (GFAP) và chondroitin sulfate proteoglycan, chẳng hạn như Neurocan, là các dấu hiệu bệnh lý của bệnh astrogliosis và sẹo thần kinh đệm mà biểu hiện của chúng có thể được điều chỉnh bởi các tế bào hình sao được kích hoạt cao (Pekny và Nilsson, 2005; Choudhuryand Ding, 2016). Do đó, việc ức chế bệnh astrogliosis và sẹo thần kinh đệm có thể là mục tiêu điều trị cho HIE và các di chứng thần kinh lâu dài của nó.
Việc sử dụng Sevoflurane đã được chứng minh là có thể giảm thiểu tổn thương HI ở loài gặm nhấm. Các nghiên cứu điều tra tầm quan trọng của hậu điều hòa Sevoflurane (SPC) để giảm bớt tổn thương HI bằng cách điều chỉnh tăng yếu tố gây thiếu oxy-1 (HIF-1 ) ở loài gặm nhấm trưởng thành và chuột sơ sinh đã xác định được một số cơ chế tiềm năng (Wang và cộng sự, 2019b; Yanget cộng sự, 2019; Du và cộng sự, 2020; Liu và Gong, 2020).
Là cảm biến sinh lý quan trọng của tình trạng thiếu oxy, HIF{0}} là yếu tố phiên mã với hàng trăm phân tử xuôi dòng liên quan đến cơ chế dung nạp thiếu máu cục bộ, chẳng hạn như yếu tố tăng trưởng nội mô mạch máu và erythropoietin (Na và cộng sự, 2015). Tình trạng thiếu oxy sau điều hòa đã được xác minh là làm giảm sự kích hoạt tế bào hình sao và vi mô sau HI trong não chuột sơ sinh (Teo và cộng sự, 2015).
Do đó, chúng tôi đã đưa ra giả thuyết rằng HIF-1 có thể góp phần làm giảm sự hình thành sẹo thần kinh đệm và bệnh astrogliosis.HIF-1 có thể tồn tại một cách cơ bản trong tế bào thần kinh, nhờ đó nó nhanh chóng tăng biểu hiện và tích tụ trong điều kiện thiếu oxy. Tuy nhiên, khi oxy trở lại bình thường, sự biểu hiện HIF1 không thể được duy trì ở mức đủ cao để liên tục phát huy tác dụng bảo vệ thần kinh do sự thoái hóa phụ thuộc oxy bởi các protein prolyl-hydroxylase và sau đó là sự phổ biến khắp nơi của các protein von Hippel-Lindau (VHL) (Berra và cộng sự, 2003; Zhang và cộng sự, 2018).
DJ-1 (được mã hóa bởi Park7) được cho là một loại protein bảo vệ thần kinh, đặc biệt là trong điều kiện oxy hóa (Aleyasin và cộng sự, 2007, 2010). Protein VHL tương tác vật lý với DJ-1, được xác định bằng màn hình khối phổ không thiên vị và được xác nhận trong mô hình bệnh aParkinson (PD). Ngoài ra, Parsanejad và cộng sự (2014) đã chỉ ra rằng DJ-1 ức chế sự phổ biến phụ thuộc vào VHL và ổn định biểu hiện HIF-1.
Do đó, chúng tôi đã đưa ra giả thuyết rằng Sevoflurane ổn định protein HIF-1 ở vùng hải mã bằng cách điều chỉnh tăng DJ-1 để ức chế sự phổ biến của HIF-1, từ đó cải thiện chức năng ghi nhớ và học tập lâu dài.
Để nghiên cứu vai trò của HIF-1 trong mối quan hệ giữa sevoflurane và bệnh astrogliosis, chúng tôi đã sử dụng YC-1 (Lificiguat), chất đối kháng chọn lọc của HIF-1 , để ức chế hoàn toàn biểu hiện HIF-1 ở mức độ sau phiên mã. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã nghiên cứu vai trò của HIF-1a trong việc bảo vệ thần kinh của chuột sơ sinh HIE được điều trị bằng SPC.
Nguyên liệu và phương pháp
Động vật
Nghiên cứu trên động vật được thực hiện ở giai đoạn phát triển khớp thần kinh của chuột, bắt đầu vào ngày thứ 7 sau sinh (P7), tương ứng với giai đoạn tăng trưởng của trẻ sơ sinh từ giai đoạn cuối thai kỳ đến 3 năm sau khi sinh (Jevtovic-Todorovic và cộng sự, 2003). Chuột Sprague-Dawley 7 ngày tuổi nặng 12 con16g được chọn từ 20 con chuột đang mang thai (được mua từ Phòng thí nghiệm của Bệnh viện Shengjing, Đại học Y Trung Quốc, Trung Quốc; tỷ lệ đực / cái, 1: 1).
Tất cả chuột đều có thể tiếp cận nước và thức ăn một cách thoải mái, đồng thời được duy trì ở nhiệt độ và độ ẩm tiêu chuẩn trong phòng thí nghiệm với chu kỳ 12-giờ sáng/tối (8 giờ sáng/8 giờ tối). Tất cả các thí nghiệm trên động vật được thực hiện theo Hướng dẫn của Viện Y tế Quốc gia (Bethesda, MD, Hoa Kỳ) về Chăm sóc và Sử dụng Động vật trong Phòng thí nghiệm.
Ủy ban Chăm sóc Động vật trong Phòng thí nghiệm của Đại học Y Trung Quốc đã chính thức phê duyệt các thí nghiệm được mô tả (Thẩm Dương, Trung Quốc; số phê duyệt 2016PS337K) vào ngày 9 tháng 11 năm 2016.
Từ 25 con chuột đang mang thai, 249 con chuột P7 được chọn và chia ngẫu nhiên thành các nhóm dựa trên bảng số ngẫu nhiên (Wang và cộng sự, 2019a). Phân tích cuối cùng của chúng tôi bao gồm tổng cộng 201 trẻ sơ sinh; tỷ lệ tử vong sau điều trị HI là 19%.
201 con chuột sơ sinh này được chia ngẫu nhiên thành bốn nhóm: sham(n=54), HI (n=54), HI + sevoflurane (HIS) (n=54) và HIS+ YC{{ 6}} (n=39) nhóm. Trong mỗi nhóm, 24 con chuột được sử dụng cho xét nghiệm Western blot, 5 con được sử dụng cho hóa mô miễn dịch và nhuộm Golgi, và 10 con được sử dụng để kiểm tra hành vi. 45 con chuột còn lại trong các nhóm giả, HI và HIS được sử dụng cho phản ứng sao chép chuỗi polymerase ngược (RT- PCR).
Thiết kế thí nghiệm và tiếp xúc với thuốc gây mê
Mô hình HIE được sử dụng đã được mô tả trước đây (Zhao et al., 2007; Grandvuillemin et al., 2017). Dựa trên khoảng cách giữa hậu môn và cơ quan sinh sản, việc xác định giới tính chuột sau sinh đã được hoàn thành. Để thiết lập mô hìnhHIE, đầu của mỗi con chuột P7 được đặt vào một ống nhựa trong suốt, được bịt kín bằng bông trước khi Sevoflurane được giải phóng (Wang và cộng sự, 2019a; Xue và cộng sự, 2019).
Động mạch cảnh chung bên trái của mỗi con chuột được thắt vĩnh viễn, và động mạch bị cắt giữa hai dây chằng; mỗi ca phẫu thuật được hoàn thành trong vòng 5 phút. Sau đó, chuột không bị ảnh hưởng bởi thuốc mê và được đưa trở lại chuồng của chuột mẹ trong 2 giờ. Để sử dụng SPC, chuột được đưa vào buồng trong suốt (Công ty Linh Chi, Hàng Châu, Trung Quốc) được kết nối với máy hóa hơi asevoflurane; một ống hỗ trợ thông gió, trong khi ống kia chuyển mẫu khí ra khỏi buồng đến màn hình.
Buồng được thông gió với 30% O2 và 70% N2 trong 2 giờ đối với nhóm giả, trong khi 8% O2 và 92%N2 được sử dụng trong 2 giờ đối với nhóm HI. SPC được thiết lập ngay sau khi HI: 2,4% sevoflurane (1 nồng độ phế nang tối thiểu) được chuột hít vào trong buồng có khí quyển là 30% O2 và 70% N2 và tốc độ luồng khí là 2 L/phút trong 30 phút. Bể sưởi ổn định nhiệt độ bên trong buồng ở mức 37 độ.
Quản lý thuốc
Chính xác 30 phút trước HI, 1,52 ug chất ức chế HIF-1 (YC1; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) đã được tiêm vào tâm thất trái (Paxinos và Franklin, 2013) bằng cách sử dụng ống tiêm 5-μLHamilton (Công nghệ Yingweida, Bắc Kinh, Trung Quốc). Như đã mô tả trước đây, YC-1 được hòa tan trong dịch não tủy nhân tạo ở nồng độ 0,304 ug/μL (Shen và cộng sự, 2012; Na và cộng sự, 2015).
Phân tích Western blot
Chuột P7 được gây mê bằng 2% Sevoflurane và các mô hồi hải mã được lấy ra từ chuột con vào lúc 12, 24 và 48 giờ và 28 ngày sau phẫu thuật. Sau khi chiết xuất, các mô ngay lập tức được đặt trên băng.
Tổng số protein nổi phía trên được phân lập bằng cách thêm chất xét nghiệm ức chế miễn dịch vô tuyến (Beyotime, Haimen, Trung Quốc). Nồng độ protein được xác định bằng One BCA Kit (Beyotime).
Tiếp theo, mẫu được tách trên gel natri dodecylsulfate-polyacrylamide 12,5% và chuyển sang màng nitrocellulose. Sau khi ngăn chặn bằng albumin huyết thanh bò 5% (Sigma-Aldrich) ở 4 độ, màng này được ủ với các kháng thể chính thích hợp, bao gồm anti-glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH; 1:2000; Cat# 5174S; Công nghệ tín hiệu tế bào , Danvers, MA, USA), chống DJ-1 (1:1000;Cat# ab18257; Abcam, Cambridge, UK), chống VHL (1:5000;polyclonal; Cat# ab77262; Abcam), chống -HIF-1 (1:900;polyclonal; Cat# ab2185; Abcam), thuốc chống thần kinh (1:200;monoclonal; Cat# sc-33663; Công nghệ sinh học Santa Cruz, Dallas,TX, Hoa Kỳ) , protein mật độ chống hậu synap 95 (PSD95; 1:1000;monoclonal; Cat. No 3409S; Công nghệ tín hiệu tế bào), protein liên quan đến khả năng chống tăng trưởng 43 (GAP43; 1:2000; polyclonal;Cat# 16971-1-AP; Công nghệ sinh học Proteintech , Chicago, IL,USA) và anti-GFAP (1:5000, polyclonal, Cat# ab53554;Abcam).
Sau đó, các đốm màu được ủ bằng IgG kháng chuột (1:5000; Cat# ZB-2301; Zhongshanjinqiao, Bắc Kinh, Trung Quốc) hoặc IgG kháng chuột (1:5000; Cat# ZB-2301; Zhongshanjinqiao) trong 2 giờ ở nhiệt độ phòng.
Các vết protein được hiển thị bằng thuốc thử phát hiện phát quang hóa nâng cao (SuperSignal West Pico; Pierce, Rockford, IL, USA). Các dải protein được định lượng bằng phần mềm ImageJ (Viện Y tế Quốc gia). Để phân tích các blots phía tây, dữ liệu đã được chuẩn hóa thành GAPDH.
Hóa mô miễn dịch
28 ngày sau phẫu thuật, chuột được gây mê bằng phương pháp mô tả ở trên, được tưới bằng 4% formalin và não của chúng được loại bỏ để nhuộm huỳnh quang miễn dịch.
Não được ngâm trong 4% paraformaldehyde ở nhiệt độ 4 độ trong 48 giờ, sau đó được khử nước trong loạt ethanol đã được phân loại và cuối cùng được nhúng vào parafin. Tiếp theo, các mô nhúng parafin được cắt thành các phần có độ dày 2,5-μm bằng máy rung và các phần thu được được bảo quản ở nhiệt độ phòng.
Mỗi bộ não được cắt liên tục và ba phần não không liên tục được chọn để nhuộm NeuN (dấu hiệu tế bào thần kinh), GFAP (dấu hiệu tế bào hình sao) và nhuộm thần kinh (dấu vết sẹo thần kinh đệm). Để dán nhãn kép, các phần mô được ủ với hai kháng thể chính hỗn hợp, bao gồm cả kháng thể kháng dê GFAP(1:250; polyclonal; Cat# ab53554; Abcam), kháng nguyên thỏ (1:100; Cat# 12943; Công nghệ tín hiệu tế bào) và/hoặc thuốc kháng thần kinh của chuột (1:200; monoclonal; Cat# sc{{ 10}};Công nghệ sinh học Santa Cruz) ở nhiệt độ 4 độ qua đêm trong buồng ẩm.
Sau đó, các phần được rửa bằng 0.1 dung dịch muối đệm Mphosphate và ủ trong 2 giờ ở nhiệt độ phòng với các kháng thể thứ cấp thích hợp, bao gồm cả IgG kháng thỏ kết hợp với Alexa Fluor-594 (1:200;Life Technologies, Grand Island, NY, USA), IgG chống chuột kết hợp với Alexa Fluor-594 (1:200; Life Technologies) và IgG chống dê kết hợp với fluorescein isothiocyanate (1:200; Life Technologies).
Việc nhuộm màu nhân tế bào được thực hiện bằng 4′,6-diamidino-2-phenylindole (Beyotime) trong 5 phút.
Một kính hiển vi Olympus BX51 (OlympusCorporation, Tokyo, Nhật Bản) đã được sử dụng để quan sát các phần bị nhuộm màu. Ba trường nhìn của đồi hải mã bên trái được chọn ngẫu nhiên từ mỗi lát để chụp ảnh. Phần mềm ImageJ được sử dụng để ước tính mức độ tập trung định lượng và do đó, tính toán hệ số chồng chéo của Manders.
For more information:1950477648nn@gmail.com
