Trừu tượng:Rễ Vitis amurensis đã được báo cáo là có khả năng làm trắng da thông qua việc đánh giá các hoạt động ức chế melanogen và tyrosinase. Trong nghiên cứu này, rễ V. amurensis được sử dụng để chọn nhanh các thành phần làm trắng bằng cách sử dụng LC-Q-TOF-MS cùng với xét nghiệm ức chế tyrosinase và để tối ưu hóa quy trình chiết xuất để sử dụng làm nguyên liệu chức năng làm trắng da bằng phương pháp bề mặt phản ứng. Kết quả cho thấy rễ V. amurensis thể hiện tác dụng ức chế tyrosinase bởi hai oligome stilbene, ε-vinifera (1) và vitamin B (2), như dự đoán của LC-Q-TOF-MS kết hợp với xét nghiệm sinh học. Các điều kiện chiết xuất tối ưu (nồng độ metanol 66% , thể tích dung môi 140 mL và thời gian chiết xuất 100 phút) đối với các thành phần làm trắng da đã được thiết lập với hiệu suất 6,20% và hoạt tính ức chế tyrosinase là 87,27%. Mối quan hệ giữa từng yếu tố và phản ứng tương ứng của nó đã được xác nhận bằng phân tích tương quan của Pearson. Thể tích dung môi cho thấy mối quan hệ tuyến tính rõ ràng với sản lượng và nồng độ metanol có mối quan hệ tuyến tính chặt chẽ với hoạt tính ức chế tyrosinase đối với các hợp chất 1 và 2, cũng như sự kết hợp của chúng. Nhìn chung, LC-Q-TOF-MS kết hợp với xét nghiệm sinh học đã được chứng minh là có tiềm năng tìm kiếm hiệu quả các thành phần hoạt tính mới, cũng như các thành phần hoạt tính đã biết; vitamin có thể được đề xuất như một chất làm trắng tiềm năng tự nhiên mới.

Theo các nghiên cứu liên quan,hột cálà một loại thảo mộc phổ biến được mệnh danh là “thần dược kéo dài tuổi thọ”. Thành phần chính của nó làcistanoside, có tác dụng khác nhau nhưchống oxy hóa, chống viêm, Vàxúc tiến chức năng miễn dịch. Cơ chế giữa cistanche vàLàm trắng danằm trong tác dụng chống oxy hóa của cistancheglycosid. Melanin trong da người được tạo ra bởi quá trình oxy hóa tyrosine được xúc tác bởityrosinaza, và phản ứng oxy hóa cần có sự tham gia của oxy nên các gốc oxy tự do trong cơ thể trở thành nhân tố quan trọng ảnh hưởng đến quá trình sản sinh melanin. bể chứacistanoside, là một chất chống oxy hóa và có thể làm giảm sự hình thành các gốc tự do trong cơ thể, do đó ức chế sản xuất melanin.

Nhấp vào Cistanche được bán gần tôi

Để biết thêm thông tin:

david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501

từ khóa:Viêm amurensis; LC-Q-TOF-MS kết hợp với xét nghiệm ức chế tyrosinase; phương pháp bề mặt đáp ứng; tương quan Pearson

1. Giới thiệu

Melanin chịu trách nhiệm tạo nên màu sắc của da và lông của động vật có vú và bảo vệ da khỏi tia cực tím, nhưng việc sản xuất và tích tụ melanin quá mức trong da gây ra các rối loạn tăng sắc tố da như tàn nhang, nám, đồi mồi, ephelides và tàn nhang do tuổi già. Tyrosinase, được biết đến như một loại enzyme oxidase có chứa đồng, có vai trò quan trọng trong quá trình sinh tổng hợp melanin. Enzim xúc tác cho hai phản ứng oxy hóa liên tiếp: Bước đầu tiên, quá trình hydroxyl hóa L-tyrosine thành 3,4-dihydroxy-L-phenylalanine (L-DOPA) và bước thứ hai, quá trình oxy hóa L-DOPA thành dopaquinone. Dopaquinone là một chất có khả năng phản ứng cao, có thể trùng hợp một cách tự nhiên để tạo ra hắc tố [1–3]. Do đó, chất ức chế tyrosinase có thể được sử dụng như phương pháp điều trị rối loạn da liên quan đến tăng sắc tố và làm chất làm trắng da.

Vitis amurensis là loài nho mọc hoang, phân bố chủ yếu ở Châu Á (Hàn Quốc, Trung Quốc, Nhật Bản). Quả chín hoàn toàn được ăn sống và chứa nhiều chất dinh dưỡng như sucrose, glucose, protein và vitamin nên được dùng làm nguyên liệu cho rượu vang, nước trái cây, thạch và mứt. Ngoài ra, lá của nó được sử dụng trong món salad [4]. Rễ và thân của nó đã được sử dụng làm thuốc y học cổ truyền để điều trị ung thư, đau dây thần kinh và đau bụng [5,6]. Rễ của nó bao gồm stilbenes (một thành phần chính), procyanidin, flflavonoid, triterpenoid và các hợp chất phenolic khác. Cho đến nay, các thành phần hóa học của rễ đã được nghiên cứu đầy đủ chi tiết. Đặc biệt, nhiều oligomers stilbene khác nhau, bao gồm resveratrol, amurensin A, vitamin A, ( cộng với )-ε-vinifera, amurensins C–M, ampelopsin A, D, và ampelopsin E, đã được báo cáo [6]. Chiết xuất metanol của rễ thể hiện tác dụng chống tạo hắc tố chống lại sự hình thành hắc tố do hormone kích thích tế bào hắc tố trong các tế bào B16F10 và trong quá trình oxy hóa 3,4-dihydroxyphenylalanine (L-DOPA) thông qua tyrosinase của nấm [7]. Ngoài ra, chiết xuất V. amurensis và các hợp chất hoạt động của chúng thể hiện tác dụng chống oxy hóa, chống viêm, bảo vệ thần kinh và chống khối u [7–10].

LC-MS kết hợp với xét nghiệm sinh học có thể đồng thời xác nhận thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của các thành phần trong sản phẩm tự nhiên mà không cần chiết xuất và phân lập. Do đó, nó gần đây đã được sử dụng để xác định hiệu quả và nhanh chóng các hợp chất có hoạt tính sinh học trong các sản phẩm tự nhiên [11–13].

Tối ưu hóa là một quy trình cho phép đạt được hiệu quả tối đa của các hệ thống hoặc sản phẩm thử nghiệm. Phương pháp bề mặt đáp ứng (RSM), phân tích đa biến, thiết kế thí nghiệm sử dụng các kỹ thuật toán học và thống kê dựa trên các mô hình thực nghiệm và biểu thị mối tương quan giữa thiết kế thí nghiệm và kết quả dưới dạng hàm đa thức, là một số kỹ thuật cung cấp các điều kiện tối ưu hóa lý tưởng với hiệu quả tối đa. RSM là một phương pháp tối ưu hóa chính xác và hiệu quả được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau, bao gồm chế biến thực phẩm, hóa học, sinh học và nông nghiệp [14–16]. Trong những thập kỷ qua, sự quan tâm đến dược phẩm, mỹ phẩm và thực phẩm chức năng có chứa các sản phẩm tự nhiên ngày càng tăng; do đó, có những nghiên cứu đang diễn ra ở cả giới học thuật và ngành công nghiệp nhằm phát triển các sản phẩm như vậy [17,18]. Bước đầu tiên trong các nghiên cứu này liên quan đến việc chiết xuất thành phần có hoạt tính sinh học từ các sản phẩm tự nhiên. Tại thời điểm này, do nhiều yếu tố như thời gian chiết xuất, nhiệt độ, tỷ lệ rắn-lỏng và thể tích dung môi ảnh hưởng đến các thành phần được chiết xuất nên cần phải tối ưu hóa để chiết xuất tối đa các thành phần có hoạt tính sinh học.

Theo hiểu biết của chúng tôi, các thành phần ức chế tyrosinase và tối ưu hóa chiết xuất từ ​​rễ V. amurensis hiếm khi được báo cáo [5,19]. Do đó, nghiên cứu này nhằm mục đích nhanh chóng thu được chất ức chế tyrosinase từ rễ V. amurensis bằng cách sử dụng LC-Q-TOF-MS kết hợp với xét nghiệm ức chế tyrosinase và tối ưu hóa các điều kiện chiết xuất để mở rộng việc sử dụng rễ V. amurensis làm chất làm trắng da của RSM.

2. Kết quả và thảo luận

2.1. LC-QTOF MS Kết hợp với Xét nghiệm ức chế Tyrosinase Sử dụng Chiết xuất Rễ của V. amurensis

Chiết xuất MeOH 80 phần trăm của rễ V. amurensis thể hiện hoạt tính ức chế tyrosinase đáng kể (80,7 ± 0,8 phần trăm ở 50 µg/mL, Bảng S1). Để xác định các hợp chất ức chế tyrosinase trong rễ V. amurensis mà không cần phân lập, LC-QTOF-MS kết hợp với thử nghiệm ức chế tyrosinase đã được tiến hành. Hồ sơ hóa học của dịch chiết rễ cây V. amurensis thu được trong lần chạy đầu tiên (Hình S1) và các hợp chất có hoạt tính sinh học được xác định bằng cách sử dụng xét nghiệm ức chế tyrosinase của các phân số được thu thập cứ sau 30 giây từ lần chạy thứ hai (Hình 1). Có hai đỉnh trong khoảng thời gian từ 19 đến 22 phút trên sắc ký đồ khối được dự đoán là có hoạt tính ức chế tyrosinase đáng kể và cấu trúc của chúng được xác định là dimer stilbene (1) và tetramer stilbene (2) bằng cách sử dụng hồ sơ hóa học (Bảng 1).

2.2. Xác định các thành phần ức chế Tyrosinase của Rễ V. amurensis

Đầu tiên, hai thành phần dự kiến ​​có hoạt tính ức chế tyrosinase được phân lập từ phần EtOAc và hoạt tính sinh học của chúng được đánh giá. Cấu trúc của các hợp chất đã phân lập 1 và 2 được xác định lần lượt là ε-vinifera (1) [20,21] và vitamin B ( -vinifera, 2) [21–23], sử dụng 1H-NMR, 13C-NMR, và ESI-MS (Hình 2, Hình S2 và S3 và Bảng S2). Trong thử nghiệm ức chế tyrosinase, giá trị IC50 của hợp chất 1, 2 và axit kojic lần lượt là 3,51, 10,74 và 27,09 µM. Cả hai hợp chất đều cho thấy tác dụng ức chế tyrosinase cao hơn so với đối chứng dương, axit kojic là thành phần làm trắng da đã biết (Bảng 1 và Hình S4). Trong các nghiên cứu trước đây, ε-vinifera (1) được báo cáo là có hoạt tính ức chế tyrosinase [23]; tuy nhiên, vitamin B (2) lần đầu tiên được xác định trong nghiên cứu của chúng tôi.

Nhìn chung, các kết quả tương quan với dữ liệu dự đoán của LC-MS kết hợp với xét nghiệm ức chế tyrosinase và vitamin B (2), cho thấy tiềm năng như một chất ức chế tyrosinase mới. Hơn nữa, các nghiên cứu lắp ghép phân tử đã được thực hiện để hỗ trợ kết quả của hoạt động ức chế tyrosinase đáng kể của hai oligome stilbene. Như được hiển thị trong Bảng 1, các hợp chất 1 và 2 cho thấy điểm kết nối cao hơn so với đối chứng dương, axit kojic, phù hợp với dữ liệu thực nghiệm của chúng tôi. Tuy nhiên, kết quả lắp ghép của các hợp chất trái ngược với kết quả thí nghiệm của chúng tôi. Các dạng tương tác của hợp chất 1 và 2 được mô tả trong Hình 3. Hợp chất 1 hình thành 4 liên kết hydro, 2 tương tác kỵ nước và 1 tương tác cặp pi-đơn và hợp chất 2 hình thành 11 liên kết hydro, 7 tương tác kỵ nước, 1 tương tác van der Waals , và 3 tương tác cặp pi-đơn độc. Kết quả là, người ta đã xác nhận rằng các hợp chất có thể được đưa vào vị trí hoạt động của protein mục tiêu và liên kết với các gốc axit amin xúc tác có thể ức chế hoạt động của tyrosinase. Ngoài ra, ε-vinifera (1) được báo cáo là chất ức chế cạnh tranh liên kết với cùng một vị trí mà L-DOPA liên kết với tyrosinase [23]. Người ta quan sát thấy rằng vitamin B (2) liên kết vào cùng một vị trí với ε-vinifera (1), điều này khẳng định rằng vitamin B (2) là một chất ức chế cạnh tranh mới.

2.3. Tối ưu hóa chiết xuất rễ V. amurensis bằng RSM

Để sử dụng rễ V. amurensis làm nguyên liệu có chức năng làm trắng da, các điều kiện chiết xuất tối ưu đã được thiết kế bởi Box-Behnken design (BBD) để tối đa hóa năng suất chiết xuất và hoạt tính ức chế tyrosinase. Ảnh hưởng của các phản ứng độc lập như năng suất chiết xuất, hoạt tính ức chế tyrosinase, lượng hợp chất 1, lượng hợp chất 2 và lượng tổng hợp chất 1 và 2, trên ba biến độc lập (thời gian chiết xuất, nồng độ MeOH/nước và thể tích dung môi), đã được đo (Bảng 2). Phạm vi của các biến được đặt là thời gian chiết xuất (40, 70 và 100 phút), nồng độ MeOH (40, 70 và 100 phần trăm) và thể tích dung môi ( 35, 87,5, và 140 mL) dựa trên thử nghiệm sơ bộ một yếu tố (dữ liệu không được hiển thị). Các giá trị thu được từ các thí nghiệm được thiết kế được biểu thị dưới dạng đa thức tương quan giữa các biến bằng phân tích hồi quy (Bảng S4–S13 và Hình S5). Kết quả của việc thực hiện tối ưu hóa riêng lẻ cho từng phản ứng (Bảng 3), hiệu suất dự kiến ​​là 6,21 phần trăm khi được chiết xuất với 100.00 phút, MeOH 64,78 phần trăm , 140.{{42} }mL. Hoạt tính ức chế tyrosinase ( phần trăm ) được chiết xuất với các điều kiện 65,22 phút, MeOH 100.00 phần trăm, 140.00 mL và được dự đoán là có giá trị 90,37 phần trăm . Lượng hợp chất 1 ở 65,74 phút, MeOH 100.00 phần trăm , 35,00 mL được dự đoán là 37,45 µg/mg và lượng hợp chất 2 ở 70,00 phút, MeOH 70,00 phần trăm và 92,24 mL được dự đoán là 86.77 µg/mg. Ngoài ra, tổng hàm lượng của các hợp chất 1 và 2 dự kiến ​​sẽ hiển thị giá trị tối đa là 108,10 µg/mg khi được chiết xuất trong các điều kiện 75,20 phút, MeOH 100,00 phần trăm và 35,00 mL. Các thí nghiệm dựa trên các điều kiện được tối ưu hóa mang lại 6,19 ± 0,36 phần trăm , hoạt tính ức chế tyrosinase 91,72 ± 3,48 phần trăm , hàm lượng hợp chất 1 là 36,54 ± 1,78 µg/mg, hàm lượng hợp chất 2 là 85,74 ± 16,57 µg/mg và tổng của các hợp chất 1 và {{85} }.10 ± 19,11 µg/mg đã thu được và các phản hồi riêng lẻ cho từng biến thể hiện sự khác biệt từ 5 phần trăm trở xuống so với các giá trị được dự đoán theo lý thuyết. Tối ưu hóa nhiều phản ứng đã được thực hiện để tối đa hóa năng suất chiết xuất và hoạt động ức chế tyrosinase (Bảng 3). Các điều kiện được tối ưu hóa như sau: thời gian chiết, 100 phút; nồng độ MeOH 66,38 % ; và thể tích dung môi, 140 mL. Sử dụng các điều kiện này, hiệu suất được xác định là 5,95 ± 1,13 phần trăm và hoạt tính ức chế tyrosinase là 85,93 ± 1,57 phần trăm ; các giá trị này tương tự như các giá trị dự đoán, tương ứng là 6,20 và 87,25%. Ngoài ra, mối tương quan giữa từng biến và phản hồi tương ứng được phân tích bằng hệ số tương quan Pearson (Bảng 4). Hiệu suất chiết xuất cho thấy mối quan hệ tuyến tính rõ ràng giữa thời gian chiết xuất và nồng độ MeOH và mối quan hệ tuyến tính nghịch với lượng hợp chất 1. Ngoài ra, hoạt động ức chế tyrosinase cho thấy mối quan hệ tuyến tính mạnh mẽ giữa lượng hợp chất 2 và lượng tổng của hợp chất 1 và 2 và mối quan hệ tuyến tính rõ ràng với hợp chất 1. Do đó, hoạt tính ức chế tyrosinase của rễ V. amurensis tỷ lệ thuận với cả hợp chất 1 và 2 nhưng thể hiện mối quan hệ tuyến tính mạnh hơn với lượng hợp chất 2 so với hợp chất 1.

3. Vật liệu và phương pháp

3.1. Quy trình thí nghiệm chung

Sắc ký lỏng trung áp (MPLC) được thực hiện bằng Biotage Isolera (Biotage AB, Uppsala, Thụy Điển). Một hệ thống được trang bị bơm sắc ký nhanh hiệu suất cao (HPFC), máy dò bước sóng kép thay đổi được và bộ thu. Phổ NMR được thu nhận bằng máy quang phổ Bruker SPECTROSPIN 300 MHz (Bruker Corporation, Billerica, MA, USA). Methanol-d4, một dung môi NMR, được mua từ Phòng thí nghiệm đồng vị Cambridge, Inc. Acetonitril (ACN), nước và metanol (MeOH) loại sắc ký được mua từ ThermoFisher Science Korea Ltd. (Seoul, Hàn Quốc). L-tyrosine, nấm tyrosinase, axit kojic và axit formic được mua từ Sigma–Aldrich Co (St. Louis, MO, USA).

3.2. Nguyên liệu thực vật

Rễ V. amurensis được lấy từ Gyeongbuk, Hàn Quốc và cũng được mua từ Omniherb (Daegu, Hàn Quốc). Chúng được xác định bởi Tiến sĩ Giáo sư Ki Yong Lee, từ Đại học Dược tại Đại học Hàn Quốc. Một mẫu chứng từ (KUP-HD071) đã được gửi tại Phòng thí nghiệm Dược lý, Đại học Dược, Đại học Hàn Quốc.

3.3. Khối phổ LC-Q-TOF

LC được thực hiện bằng cách sử dụng sê-ri Agilent 1260 (Agilent, Santa Clara, CA, USA) bao gồm một bơm nhị phân, bộ khử khí trực tuyến, bộ lấy mẫu tự động, ngăn cột được kiểm soát nhiệt độ và máy dò dãy đi-ốt quang. Quá trình phân tách sắc ký được thực hiện bằng cách sử dụng cột Shiseido CapCell PAK C18 (5 µm, 4,6 mm, ID × 150 nm). Pha động bao gồm nước (dung môi A) và ACN (dung môi B), cả hai đều chứa 0.1 phần trăm axit formic. Các điều kiện độ dốc như sau: 0–5 phút, 10 phần trăm B, 5–30 phút và tăng tuyến tính B từ 10 đến 90 phần trăm . Tốc độ đồng loại được đặt thành 0,6 mL/phút; 5 µL và 20 µL mẫu được tiêm để phân tích LC-Q-TOF-MS và LC-Q-TOF-MS cùng với xét nghiệm ức chế tyrosinase, tương ứng. Phép đo phổ khối được thực hiện bằng máy quang phổ khối Agilent 6530 Q-TOF (Agilent, Santa Clara, CA, USA) với giao diện ion hóa phun điện (ESI) ở chế độ âm. Dữ liệu có phạm vi khối lượng từ m/z 50–1000 được thu thập ở chế độ trọng tâm. Các thông số khối lượng như sau: điện áp mao dẫn, 4000 V; áp suất máy phun sương, 40 psi; điện áp mảnh, 175 V; điện áp skimmer, 65 V; nhiệt độ khí sấy, 325 ◦C; tốc độ đồng thời của khí sấy, 12,0 L/min; năng lượng va chạm 10, 20, 30 và 40 eV. Điều chỉnh tham số thu thập và xử lý dữ liệu được thực hiện bằng Thu thập dữ liệu LC-MS/MS bằng cách sử dụng Q-TOF sê-ri 6530 (phiên bản B.05.00) (phần mềm MassHunter Workstation, Agilent, Santa Clara, CA, USA).

3.4. LC-Q-TOF-MS kết hợp với xét nghiệm ức chế Tyrosinase

LC-Q-TOF-MS kết hợp với xét nghiệm ức chế tyrosinase được tiến hành bằng phương pháp đã thiết lập trong nghiên cứu trước đó [24]. Tóm lại, thử nghiệm được tiến hành trong hai lần chạy. Trong lần chạy đầu tiên, hồ sơ hóa học của mẫu thu được bằng cách sử dụng LC-Q-TOF-MS. Trong lần chạy tiếp theo, dịch rửa giải sau khi đi qua hệ thống LC trong các điều kiện LC-Q-TOF đã nêu được thu thập trong các đĩa giếng 96-cứ sau 30 giây. Hoạt tính ức chế tyrosinase của các phần thu thập được đánh giá bằng cách sử dụng xét nghiệm ức chế tyrosinase.

3.5. Phân lập Hợp chất ức chế Tyrosinase từ Rễ V. amurensis

Để phân lập các hợp chất ức chế tyrosinase được xác định bằng cách sử dụng LC-Q-TOF-MS kết hợp với xét nghiệm ức chế tyrosinase, gốc V. amurensis (3.01 kg) được chiết xuất ba lần với 80 phần trăm MeOH trong 60 phút ở nhiệt độ phòng bằng siêu âm. Dung môi chiết xuất được lọc và cô để thu được dịch chiết thô (215,7 g), dịch chiết này được lơ lửng trong nước và được phân chia tuần tự bằng cách sử dụng n-hexan, etyl axetat (EtOAc) và n-BuOH. Phần EtOAc (25,85 g) được xử lý bằng sắc ký cột silica gel sử dụng n-hexan: EtOAc trong các điều kiện gradient (20:1 → 0:1) để thu được bảy phần (E1–E7). Phân đoạn E4 được phân tách bằng MPLC và 100 g SNAP KP-Sil, hộp silica gel và dichloromethane:MeOH trong điều kiện gradient (97:3 → 0:100) để tạo ra bảy phân số con (E4–1 đến E4–7) . Hợp chất 2 (417,0 mg) thu được từ E4–5. Tiểu phần E4–4 được sắc ký lại trên MPLC sử dụng SNAP 25 g Ultra, hộp silica gel và cloroform:MeOH: H2O trong điều kiện gradient (50:4:1 → 15:4:1) để thu được bảy phần ( E4–4–1 đến E4–4–7). Hợp chất 1 (396,0 mg) thu được từ E4–4–5, được quan sát thấy dưới dạng một vết đơn lẻ trên tấm sắc ký lớp mỏng (TLC).

3.6. Xét nghiệm ức chế Tyrosinase

Hoạt tính ức chế tyrosinase được đánh giá bằng phương pháp được mô tả trước đây với một chút sửa đổi [25]. Hai microlit mẫu và 50 µL tyrosinase nấm 0.1 U/µL được xử lý trong các đĩa giếng 96-và ủ ở 37 ◦C. Sau 15 phút, 50 µL của 1 mM L-tyrosine được thêm vào và sau đó cho phản ứng ở 37 ◦C trong 15 phút. Lượng dopachrom hình thành được đo ở bước sóng 495nm bằng đầu đọc vi bản Spectra Max 19{{20}} (Thiết bị phân tử, San Jose, CA, Hoa Kỳ). Hoạt tính ức chế tyrosinase được tính bằng phương trình sau: ức chế tyrosinase ( phần trăm )=[1 − (S − S0)/(C − C0)] × 100, trong đó S là độ hấp thụ của mẫu, tyrosinase và L -tyrosine; S0 là độ hấp thụ của mẫu và L-tyrosine; C là độ hấp thụ của tyrosinase và L-tyrosine, và C0 là độ hấp thụ của L-tyrosine. Axit Kojic, một chất ức chế tyrosinase đã biết, được sử dụng như một biện pháp kiểm soát tích cực. Các giá trị IC50 được tính toán bằng GraphPad Prism 6 (GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA, USA).

3.7. Nghiên cứu lắp ghép phân tử

Quá trình ghép phân tử được thực hiện bằng phần mềm SYBYL-X 2.1.1 (Tripos Ltd., St. Louis, MO, USA) với cấu trúc tinh thể của PPO3, một tyrosinase từ Agaricus bisporus (ID Ngân hàng Dữ liệu Protein (PDB): 2Y9W). Tất cả các phân tử nước của protein mục tiêu đã được loại bỏ và quá trình chuẩn bị phối tử được tiến hành theo quy trình chuẩn bị "khử trùng" trong SYBYL-X 2.1.1. Ái lực phối tử protein được tính toán bằng trường lực Tripos và được biểu thị bằng tổng điểm. Tư thế neo của phối tử từ phức hợp protein-phối tử đã được hình dung trong chương trình Khách hàng R2 của Discovery Studio 2017 (Biovia Co., San Diego, CA, USA).

3.8. Thiết kế thí nghiệm và phân tích thống kê

Một điều kiện tối ưu để chiết xuất các thành phần có hoạt tính ức chế tyrosinase tối đa từ gốc V. amurensis đã được thiết lập bằng cách sử dụng BBD với ba biến số và ba cấp độ (MINITAB Phiên bản 14.12.0 Phần mềm Thống kê). Dựa trên kết quả thí nghiệm đơn yếu tố sơ bộ, các biến độc lập bao gồm thời gian chiết xuất (X1), MeOH và nồng độ nước (X2) và thể tích chất lỏng (X3) và một loạt các biến của chúng đã được chọn (Bảng S3). Các biến cho RSM được mã hóa bằng ba cấp độ, −1, 0 và 1. Nhìn chung, 15 thí nghiệm được thiết kế bao gồm 3 lần lặp lại ở trung tâm của thiết kế (Bảng 2). Là các phản ứng độc lập, năng suất ( phần trăm ), hoạt tính ức chế tyrosinase ( phần trăm ), lượng hợp chất (1) (µg/mg) và lượng hợp chất (2) (µg/mg) được đo. Hoạt tính ức chế tyrosinase của dịch chiết được đánh giá ở nồng độ 50 µg/mL. Mỗi câu trả lời được thể hiện bằng phương trình đa thức bậc hai sau:

trong đó R biểu thị phản hồi; 1, 2 và 3 là các hệ số tuyến tính; 12, 23, 13 là hệ số tương tác giữa 3 biến; và 11, 22 và 33 là các hệ số bậc hai.
Hơn nữa, phân tích tương quan của Pearson đã được thực hiện để xác định sự tồn tại của mối quan hệ tuyến tính giữa từng biến và phản hồi. Hệ số tương quan Pearson có mối quan hệ tuyến tính chặt chẽ giữa {{0}}.7 và 1.0, mối quan hệ tuyến tính rõ ràng giữa 0.3 và 0.7, mối quan hệ tuyến tính yếu giữa {{10}}.1 và 0.3 và không có hoặc không đáng kể mối quan hệ tuyến tính giữa 0.0 và 0,1. Mối tương quan thuận và nghịch được thể hiện tùy thuộc vào hệ số tương quan của Pearson là dương hay âm.

3.9. Phân tích Định lượng Hợp chất ức chế Tyrosinase 1 và 2

Lượng của từng hợp chất 1 và 2 trong dịch chiết thu được bằng cách sử dụng 15 điều kiện thí nghiệm đã thiết kế được đo bằng các đường cong hiệu chuẩn (Bảng 2). Đường chuẩn cho các hợp chất 1 và 2 được xác định bằng cách sử dụng diện tích dưới đường cong sắc ký UV (330 nm thu được ở các nồng độ lần lượt là 0,1–1000 µg/mL và 7,81–1000 µg/mL). LC được thực hiện bằng hệ thống Waters 2695 LC (Waters, Santa Clara, CA, USA) với các điều kiện tương tự như điều kiện của hệ thống LC được nêu chi tiết trong Vật liệu và Phương pháp, phép đo khối phổ LC-Q-TOF.

4.Kết luận

ε-Viniferin (1) và vitamin B (2) của rễ V. amurensis được đặc trưng là thành phần làm trắng da bằng cách sử dụng LC-Q-TOF-MS kết hợp với xét nghiệm ức chế tyrosinase. Đặc biệt, vitamin B (2) lần đầu tiên được xác định là hợp chất ức chế tyrosinase trong nghiên cứu này và ε-vinifera (1) và vitamin B (2) cho thấy tác dụng ức chế tyrosinase cao hơn so với axit kojic đối chứng dương tính. Các điều kiện tối ưu hóa với tác dụng ức chế tyrosinase tối đa và năng suất của rễ V. amurensis được thiết lập bằng cách sử dụng thời gian chiết xuất (100 phút), nồng độ MeOH (66,38 phần trăm ) và thể tích chất lỏng (140 mL). Kết quả cho thấy sự tương ứng tốt giữa các giá trị thử nghiệm và dự đoán. Do đó, LC-Q-TOF-MS kết hợp với thử nghiệm sinh học đã chứng minh tiềm năng tìm kiếm hiệu quả các thành phần hoạt tính mới, cũng như các thành phần hoạt tính đã biết, vitamin B (2), có thể được đề xuất như một chất làm trắng tiềm năng tự nhiên mới.

Nguyên liệu bổ sung: Các phần sau đây có sẵn trực tuyến, Hình S1: Sắc ký đồ MS ở chế độ ion hóa âm (A); Sắc ký đồ UV ở bước sóng 280 nm (B) của dịch chiết rễ V. amurensis, Hình S2: Phổ 1H-và 13C-NMR của hợp chất 1 (300 và 75 MHz, CD3OD), Hình S3: Phổ 1H-và 13C-NMR của hợp chất 2 (300 và 75 MHz, CD3OD), Hình S4: Đồ thị sigmoidal và IC50 của kiểm soát dương tính, hợp chất 1 và 2, Hình S5: Đồ thị đường viền và bề mặt phản ứng thể hiện ảnh hưởng của các tham số trích xuất (X1: thời gian trích xuất, tối thiểu; X2: Nồng độ MeOH, phần trăm ; X3: thể tích dung môi, mL). (Giao; (B) hoạt động ức chế tyrosinase; (C) hợp chất 1; (D) hợp chất 2; (E) tổng của các hợp chất 1 và 2, Bảng S1. Hoạt tính ức chế tyrosinase của dịch chiết rễ cây V. amurensis, Bảng S2: Dữ liệu NMR 1H- và 13C của các hợp chất 1 và 2 trong CD3OD (δ tính bằng ppm), Bảng S3: Các biến số và mức độ độc lập đối với phương pháp bề mặt phản ứng, Bảng S4: Hồi quy ước tính hệ số năng suất, Bảng S5: Phân tích phương sai của năng suất, Bảng S6: Hệ số hồi quy ước tính cho hoạt tính ức chế tyrosinase, Bảng S7: Phân tích phương sai cho hoạt động ức chế tyrosinase, Bảng S8: Hệ số hồi quy ước tính cho hợp chất 1, Bảng S9: Phân tích phương sai cho hợp chất 1, Bảng S10: Hệ số hồi quy ước tính cho hợp chất 2, Bảng S11. Phân tích phương sai cho hợp chất 2, Bảng S12: Hệ số hồi quy ước tính cho tổng hợp chất 1 và 2, Bảng S13: Phân tích phương sai cho tổng hợp chất 1 và 2.
Sự đóng góp của tác giả: Khái niệm hóa, KYL; phương pháp, K.-EO, HS và KYL; phần mềm, K.-EO và HS; xác nhận, HS; phân tích chính thức, K.-EO và HS; điều tra, K.-EO, HS, MKL và KYL; quản lý dữ liệu, K.-EO, HS, BP và KYL; viết— chuẩn bị bản thảo gốc, K.-EO, và HS; viết—đánh giá và chỉnh sửa, HS, MKL, BP và KYL; giám sát, MKL, BP và KYL Tất cả các tác giả đã đọc và đồng ý với phiên bản đã xuất bản của bản thảo.
Kinh phí: Nghiên cứu này được hỗ trợ bởi khoản tài trợ của Quỹ Nghiên cứu Quốc gia Hàn Quốc do Chính phủ Hàn Quốc tài trợ (NRF-2017R1A2B4003403 và NRF-2019R1A6A1A03031807) và khoản tài trợ của Dự án R&D Công nghệ Y tế Hàn Quốc thông qua Dự án Phát triển Công nghiệp Y tế Hàn Quốc Viện (KHIDI), được tài trợ bởi Bộ Y tế và Phúc lợi, Hàn Quốc (HF20C0038).
Tuyên bố về tính khả dụng của dữ liệu: Dữ liệu được trình bày trong nghiên cứu này có sẵn trong tài liệu bổ sung.
Xung đột lợi ích:Các tác giả tuyên bố không có xung đột lợi ích.
Sẵn có mẫu: Không có sẵn

Người giới thiệu

1. Ranjbar, S.; Shahvaran, Tái bút; Edraki, N.; Khoshneviszadeh, M.; Darroudi, M.; Sarrafifi, Y.; Hamzehloueian, M.; Khoshneviszadeh, M. 1, 2, 3-thuốc an thần 5-benzylidene (thio) được liên kết với triazole dưới dạng chất ức chế tyrosinase mới và chất tẩy gốc tự do. Vòm. dược phẩm. 2020, 353, 2000058. [CrossRef] [PubMed]

2. Chang, T.-S.; Ding, H.-Y.; Lin, H.-C. Xác định 6, 7, 40 -trihydroxyisoflflavone là chất ức chế tyrosinase mạnh. khoa học sinh học. công nghệ sinh học. hóa sinh. 2005, 69, 1999–2001. [CrossRef] [PubMed]

3. Miyazawa, M.; Oshima, T.; Koshio, K.; Itsuzaki, Y.; Anzai, chất ức chế J. Tyrosinase từ cám gạo đen. J. Nông nghiệp. Hóa chất thực phẩm 2003, 51, 6953–6956. [Tham khảo chéo]

4. Chen, Q.; Diao, L.; Song, H.; Zhu, X. Vitis amurensis Rupr: Đánh giá về hóa học và dược lý. Phytomedicine 2018, 49, 111–122. [CrossRef] [PubMed]

5. Jin, K.-S.; Ôi, YN; Huyn, SK; Kwon, HJ; Kim, BW Axit betulinic được phân lập từ rễ Vitis amurensis ức chế 3-isobutyl-1- methylxanthine gây ra sự hình thành hắc tố thông qua việc điều chỉnh các con đường MEK/ERK và PI3K/Akt trong các tế bào B16F10. Hóa chất thực phẩm chất độc. 2014, 68, 38–43. [Tham khảo chéo]

6. Kim, H.; Thương, PT; Ngọc, TM; Lee, tôi.; Hùng, ND; Bae, K. Hoạt động ức chế chất chống oxy hóa và lipoxygenase của oligostilbenes từ lá và thân của Vitis amurensis. J. Dược phẩm dân tộc. 2009, 125, 304–309. [Tham khảo chéo]

7. Jin, K.-S.; Ôi, YN; Huyn, SK; Kwon, HJ; Kim, BW Vitis amurensis Ruprecht gốc ức chế -melanocyte kích thích sự hình thành hắc tố do hormone gây ra trong các tế bào B16F10. Dinh dưỡng. độ phân giải Thực hành. 2014, 8, 509–515. [Tham khảo chéo]

8. Jang, MH; Piao, XL; kim, hỷ; Cho, EJ; Baek, SH; Kwon, SW; Park, JH Resveratrol oligomers từ Vitis amurensis làm giảm căng thẳng oxy hóa do amyloid gây ra trong các tế bào PC12. sinh học. dược phẩm. Bò đực. 2007, 30, 1130–1134. [Tham khảo chéo]

9. Lee, E.-O.; Lee, H.-J.; Hwang, H.-S.; Ahn, K.-S.; Chae, C.; Kang, K.-S.; Lu, J.; Kim, S.-H. Khả năng ức chế sự phát triển ung thư phổi Lewis bằng hexanol A từ rễ của Vitis amurensis thông qua các hoạt động apoptotic và chống tạo mạch. Chất gây ung thư 2006, 27, 2059–2069. [Tham khảo chéo]

10. Bak, M.-J.; Trường, VL; Kang, H.-S.; Tháng sáu, M.; Jeong, W.-S. Tác dụng chống viêm của procyanidin từ hạt nho dại (Vitis amurensis) trong các tế bào RAW 264,7 do LPS gây ra. oxi. y tế. Tế bào. Longev. 2013, 2013. [Tham khảo chéo]

11. Shin, H.; Chung, H.; Công viên, B.; Lee, KY Xác định các thành phần chống oxy hóa từ Polygonum aviculare bằng cách sử dụng LC-MS kết hợp với xét nghiệm DPPH. tự nhiên sản xuất. Khoa học. 2016, 22, 64–69. [Tham khảo chéo]

12. Công viên, S.; Shin, H.; Công viên, Y.; Choi, tôi.; Công viên, B.; Lee, KY Đặc điểm của các thành phần ức chế sản xuất NO từ Catalpa ovata bằng LC-MS kết hợp với xét nghiệm dựa trên tế bào. sinh học. hóa học. 2018, 80, 57–63. [CrossRef] [PubMed]

13. Ingkaninan, K.; De Best, C.; Van Der Heijden, R.; Hofte, A.; Karabatak, B.; Irth, H.; Tjaden, U.; Van der Greef, J.; Verpoorte, R. Sắc ký lỏng hiệu năng cao với UV kết hợp trực tuyến, phát hiện khối phổ và sinh hóa để xác định các chất ức chế acetylcholinesterase từ các sản phẩm tự nhiên. J. Sắc ký đồ. 2000, 872, 61–73. [Tham khảo chéo]

14. Bezerra, MA; Santelli, LẠI; Ô liu, EP; Biệt thự, LS; Escaleira, Phương pháp bề mặt phản ứng LA (RSM) như một công cụ để tối ưu hóa trong hóa học phân tích. Talanta 2008, 76, 965–977. [CrossRef] [PubMed]

15. Witek-Krowiak, A.; Chojnacka, K.; Podstawczyk, D.; Dawiec, A.; Pokomeda, K. Ứng dụng phương pháp bề mặt đáp ứng và phương pháp mạng nơ-ron nhân tạo trong mô hình hóa và tối ưu hóa quá trình hấp thụ sinh học. nguồn sinh học. công nghệ. 2014, 160, 150–160. [CrossRef] [PubMed]

16. Araujo, PW; Brereton, RG Thiết kế thử nghiệm I. Sàng lọc. Nhà phân tích xu hướng. hóa học. 1996, 15, 26–31. [Tham khảo chéo]

17. Vương, Y.; Zhao, L.; Trương, R.; Dương, X.; Mặt trời, Y.; Shi, L.; Xue, P. Tối ưu hóa chiết xuất có hỗ trợ siêu âm bằng phương pháp bề mặt phản ứng, khả năng chống oxy hóa và hoạt tính ức chế tyrosinase của anthocyanin từ cám gạo đỏ. Khoa học thực phẩm Dinh dưỡng. 2020, 8, 921–932. [Tham khảo chéo]

18. Weremfo, A.; Adulley, F.; Adarkwah-Yiadom, M. Tối ưu hóa đồng thời quá trình chiết xuất các hợp chất phenolic và hoạt động chống oxy hóa của hạt bơ (Persea americana Mill.) bằng cách sử dụng phương pháp bề mặt phản ứng. J. Hậu môn. Phương pháp Hóa học 2020, 2020, 7541927. [CrossRef]

19. Ko, J.; Choi, J.; Bae, SK; Kim, J.; Yoon, KD Tách năm oligostilben từ V itis amurensis bằng sắc ký ngược dòng hiệu suất cao gradient tỷ lệ đồng cấp. J. Tháng 9. Khoa học. 2013, 36, 3860–3865. [Tham khảo chéo]

20. Wang, K.-T.; Chen, L.-G.; Tseng, S.-H.; Huang, J.-S.; Hsieh, M.-S.; Vương, C.-C. Tác dụng chống viêm của resveratrol và oligostilbenes từ Vitis thunbergii var. taiwaniana chống viêm khớp do lipopolysacarit gây ra. J. Nông nghiệp. Hóa chất thực phẩm 2011, 59, 3649–3656. [Tham khảo chéo]

21. Hu, J.; Lin, T.; Từ, J.; Đinh, R.; Vương, G.; Shen, R.; Zhang, Y.-W.; Chen, H. Polyphenol được phân lập từ lá của Vitis thunbergii var. taiwaniana điều chỉnh con đường liên quan đến APP. sinh học. y tế. hóa học. Hãy để. 2016, 26, 505–511. [CrossRef] [PubMed]

22. Oshima, Y.; Kamijou, A.; Ohizumi, Y.; Niwa, M.; Ito, J.; Hisamichi, K.; Takeshita, M. Tiểu thuyết oligostilbenes từ Vitis cognetiae. Tứ diện 1995, 51, 11979–11986. [Tham khảo chéo]

23. Anna Malinowska, M.; Phôi, K.; Drouet, S.; Munsch, T.; Unlubayir, M.; Tungmunnithum, D.; Giglioli-Guivarc'h, N.; Hà Nội, C.; Lanoue, A. Chiết xuất mía nho như một thành phần mỹ phẩm trẻ hóa đa chức năng: Đánh giá hoạt động của Sirtuin, ức chế Tyrosinase và tiềm năng sinh khả dụng. Phân tử 2020, 25, 2203. [CrossRef] [PubMed]

24. Dương, Hộ; Ồ, K.-E.; Jo, YH; An, JH; Lưu, Q.; Thổ Nhĩ Kỳ, A.; Jang, JY; Hwang, BY; Lee, KY; Lee, MK Đặc tính của các thành phần ức chế tyrosinase từ các bộ phận trên không của Humulus japonicus bằng cách sử dụng xét nghiệm trực tuyến kết hợp LC-MS/MS. sinh học. y tế. hóa học. 2018, 26, 509–515. [CrossRef] [PubMed]

25. Liu, Q.; Kim, C.; Jo, YH; Kim, SB; Hwang, BY; Lee, MK Tổng hợp và đánh giá sinh học các dẫn xuất resveratrol như chất ức chế quá trình hình thành hắc tố. Phân tử 2015, 20, 16933–16945. [CrossRef] [PubMed]

Để biết thêm thông tin: david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501