Đặc tính của khả năng ức chế enzym CYP3A4 của các flavonoid được chọn lọc Phần 2

Vui lòng bấm vàooscar.xiao@wecistanche.comđể biết thêm thông tin

Như trong các thí nghiệm trước, mức giảm hoạt động của enzym cao nhất đã được quan sát thấy khi chrysin được sử dụng như một chất ức chế. Hoạt tính còn lại của enzym sau khi ủ và thẩm tách bằng chrysin là 0. 57 phần trăm, và sau khi ủ và thẩm tách với xử lý trước bằng kali hexacyanoferrate, là 1,31 phần trăm (Hình 4).

Trong trường hợp ức chế trực tiếp (có thể đảo ngược), loại thí nghiệm này sẽ cho thấy sự phục hồi hoạt tính của enzym sau khi thẩm tách. Trong trường hợp ức chế giả không thể đảo ngược, hoạt tính của enzym sẽ được phục hồi sau khi điều trị bằng chất oxy hóa và thẩm tách. Vì đây không phải là trường hợp của bất kỳ phân tích nàoflavonoid, có thể kết luận rằng tất cả các flavonoid cho thấy sự ức chế không thể đảo ngược của cytochrome P 450 3 A4.

Vui lòng bấm vào đây để biết thêm

3. Thảo luận

Người ta đã chứng minh rằng một số flavonoid có thể ức chế hoạt động của các enzym cytochrom P45 0. Saric-Mustapic và cộng sự. [28] và Kondza và cộng sự. [29] cho thấy rằng acacetin, apigenin, chrysin và pinocembrin ức chế enzym CYP3A4 trong thử nghiệm với testosterone làm chất đánh dấu. Vì enzym CYP3A4 sở hữu một vị trí hoạt động lớn có thể chứa các cơ chất khác nhau, nên tiến hành các xét nghiệm hoạt tính với một cơ chất đánh dấu khác như nifedipine và midazolam [3 0]. Do đó, chúng tôi sử dụng quá trình oxy hóa nifedipine làm phản ứng đánh dấu hoạt động của CYP3A4 và xác định các thông số động học của sự bất hoạt. Các giá trị về hiệu quả ức chế thu được khi sử dụng nifedipine làm chất đánh dấu có cùng mức độ khi so sánh với xét nghiệm testosterone đối với apigenin, acacetin và pinocembrin. Chỉ có chrysin cho thấy giá trị cao hơn gấp bốn lần trong testosterone 【29】 khi so sánh với xét nghiệm nifedipine, tức là 0,108 phút -1 μM -1 so với 0,029 phút -1 uM -1. Các điểm tương đồng quan sát được trong động học quá trình khử hoạt tính phù hợp với dữ liệu tài liệu xác nhận rằng nifedipine vàtestosteronecó các vị trí ràng buộc khác nhau chồng chéo lên nhau [31]. Cytochrome P 450 3 A4 có một trong những vị trí hoạt động lớn nhất và có thể chứa chất nền và chất ức chế cùng một lúc, với một chất ảnh hưởng đến sự liên kết của chất kia, điều này có thể giải thích sự khác biệt quan sát được giữa các xét nghiệm nifedipine và testosterone.

Có thể tránh được các tác động lâm sàng của thuốc ức chế có thể đảo ngược (tức là tương tác giữa thức ăn và thuốc) nếu ngừng điều trị chất ức chế. Các tương tác quan trọng hơn là những tương tác không thể đảo ngược, trong khi chỉ cần ngừng sử dụng chất ức chế sẽ không giải quyết được các vấn đề tương tác. Trong nghiên cứu này, chrysin cho thấy khả năng ức chế cao nhất, với IC5n và K thấp nhất; các giá trị. Nghiên cứu gắn kết phân tử của flavonoid liên kết với cytochrom P4503A4 đã chỉ ra ái lực liên kết cao hơn của chrysin bằng cách cho vòng B tiếp xúc với sắt ở trung tâm hoạt động của enzym [28]. Nghiên cứu về mối quan hệ cấu trúc-ức chế đã chỉ ra rằng các nhóm hydroxyl ở vòng A đóng góp vào tác dụng ức chế có thể do tương tác ion-ion, trong khi vòng B có thể không thay thế (pinocembrin, chrysin) hoặc đơn chất (acacetin, apigenin) đối với tác dụng ức chế được quan sát (Hình 1) [28]. Các flavonoid không thay thế (pinocembrin, chrysin) dễ bị oxy hóa hơn và tạo ra các chất trung gian phản ứng làm bất hoạt CYP3A4. Tác dụng ức chế mạnh hơn quan sát được với chrysin có lẽ là do độ cứng của cấu trúc và sự hiện diện của liên kết đôi C 2= C3 khi so sánh với pinocembrin.

Cistanche có thể cải thiện khả năng miễn dịch

Tầm quan trọng của động học enzym được mô tả này có thể được quan sát trong bối cảnh tương tác giữa thực phẩm và thuốc, trong đó việc sử dụng chrysin (20-100 uM) làm tăng đáng kể AUC và nồng độ đỉnh trong huyết thanh (Cmax) của nitrofurantoin ở chuột [32] . Ví dụ, chất ức chế dựa trên cơ chế tương đối yếu của enzym CYP3A4 / 5,erythromycin[33], đã được báo cáo là gây ra tương tác vừa phải với cerivastatin ở những người tình nguyện khỏe mạnh (tăng 21% AUC của cerivastatin) [34]. Chrysin cũng có khả năng ức chế lớn hơn mibefradil, một loại thuốc hạ huyết áp đã bị thu hồi do tương tác đáng kể với các loại thuốc khác. Kết quả của nghiên cứu này cho thấy chrysin có thể là một chất ức chế mạnh và có thể tương tác với các loại thuốc đã sử dụng khác, làm thay đổi AUC và Cmax của những loại thuốc này. Chrysin có nhiều trong keo ong (28g / L), và nó là flavonoid chính thứ ba trong mật ong 5,3 mg / kg [35]; do đó, một chế độ ăn nhiều thực phẩm này có khả năng tương tác với các loại thuốc là chất nền CYP3A4.

Pinocembrin, một chất ức chế không thể đảo ngược đã được chứng minh của enzym CYP3A4, cho thấy giá trị động học thấp nhất là 0. 0 4 ± 0. 01 phút-. Hiệu quả bất hoạt của nó tương tự như hiệu quả của acacetin và apigenin (0,01 phút -1 uM-). Pinocembrin chủ yếu được tìm thấy trong thực phẩm như mật ong và đồ uống (trà và rượu vang đỏ), là nguồn cung cấp dồi dào flavonoid này [29]. Theo các thông số động học này, cần thận trọng khi tiêu thụ các nguồn pinocembrin này cùng với các loại thuốc hoạt động như chất nền CYP3A4.

Acacetin cho thấy giá trị IC5 0 cao hơn chrysin ba lần và K cao hơn năm lần; giá trị, trong khi vẫn duy trì các giá trị tác động tương tự như các flavonoid khác, cho thấy hiệu quả ức chế thấp hơn. Acacetin chủ yếu có thể được tìm thấy trong các loài thực vật như Turnera diffusa, Robinia pseudoacacia, và Betula lines [36], nhưng một số loại thực phẩm cũng có nguồn flavonoid này. Ví dụ, nước quất là một nguồn giàu acacetin, và acacetin có thể được tìm thấy ở nồng độ 0,1 mg / 100 g nước ép tươi [37]. Hợp chất mẹ của acacetin, apigenin cho thấy giá trị IC50 cao nhất và K cao nhất; giá trị trong số bốn flavonoid được thử nghiệm. Tiềm năng ức chế của apigenin đã được xác nhận trên cơ thể người khi điều trị kết hợp apigenin và paclitaxel dẫn đến tăng sinh khả dụng qua đường uống của paclitaxel, chủ yếu là do tăng cường hấp thu ở đường tiêu hóa thông qua việc ức chế P-glycoprotein và giảm lượng thuốc đầu tiên. chuyển hóa của paclitaxel thông qua sự ức chế phân họ CYP3A ở ruột non và / hoặc ở gan bởi apigenin [38]. Apigenin là một flavonoid chiếm ưu thế trong cần tây, mùi tây và hoa cúc. Mùi tây khô đã được báo cáo là có lượng apigenin tối đa, ở mức 45035 ug / g. Các nguồn apigenin bổ sung được tìm thấy trong các loại thảo mộc như hoa khô của hoa cúc, chứa 3000 đến 5000 ug / g, và hạt cần tây, chứa 786,5ug / g 【39】.

Sự ức chế thuận nghịch của các cytochrom P 450 3 A4 có liên quan đến bước đầu tiên của chu trình xúc tác cytochrom P450 (Hình 5). Thông thường, sự cạnh tranh giữa chất nền và chất ức chế trong việc liên kết với vị trí hoạt động (sắt sắt) được quan sát thấy. Trong trường hợp đó, nên tiến hành các thí nghiệm ràng buộc (chuẩn độ enzyme) và để kiểm tra nó với nhiều hơn một chất nền, vì CYP3A4 có một vị trí hoạt động lớn có thể chứa nhiều hơn một phân tử chất nền / chất ức chế [26,30]. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã sử dụng nifedipine làm chất nền, và kết quả về hiệu quả ức chế có mức độ tương đương với các thử nghiệm được báo cáo trước đây được thực hiện với testosterone làm chất đánh dấu (Bảng 1).

Hình 5. Chu trình xúc tác Cytochrome P450 bao gồm chín bước. Bước đầu tiên đại diện cho sự liên kết của cơ chất và điểm tương tác với các chất ức chế thuận nghịch. Trong bước thứ hai, sắt heme bị khử thành dạng sắt mà các chất ức chế giả không thể đảo ngược liên kết với nhau. Nếu quan sát thấy sự ức chế không thể đảo ngược, nó thường liên quan đến dạng gốc của chất nền (được hình thành ở bước 7) và / hoặc sản phẩm (được hình thành ở bước 8).cistanche trong quần của bạnCác loại oxy phản ứng được hình thành trong chu trình cytochrome P450 vô ích (bước 3a và 5a) có thể gây ra sự phá hủy enzyme, có thể được ngăn chặn bằng cách bổ sung SOD và CAT. Mô tả các bước không liên quan đến ức chế bị bỏ qua. Chuẩn bị theo tài liệu tham khảo [26].

Tuy nhiên, như chúng tôi đã chỉ ra trước đây [28,29] và xác nhận ở đây trong các thí nghiệm đã tiến hành của chúng tôi, tất cả các flavonoid được nghiên cứu đều cho thấy sự ức chế không thể đảo ngược. Không phân biệt loại ức chế không thể đảo ngược (giả không thể đảo ngược hoặc liên kết cộng hóa trị của chất trung gian với heme hoặc apoprotein), sự ức chế sẽ nổi bật nhất nếu tiến hành ủ trước, trước khi bổ sung chất đánh dấu [26]. Trong quá trình ủ trước, chu trình xúc tác được kích hoạt bằng cách bổ sung hệ thống tạo ra để sản xuất coenzyme (NADPH), và có đủ thời gian để quan sát sự bất hoạt của enzyme. Do đó, tất cả các dạng ức chế không thể đảo ngược đều cần đến sự khử enzym thành dạng sắt (Hình 5).

Vì cytochromes P45 0 là hemoprotein, chúng tôi đã nghiên cứu sự liên kết của flavonoid với dạng sắt của vị trí hoạt động và sự liên kết của chất trung gian phản ứng có thể có với heme [26]. Để đánh giá khả năng hình thành cộng hưởng heme, một xét nghiệm hemochromopyridine đã được tiến hành. Tất cả các flavonoid được thử nghiệm đã làm giảm đáng kể nồng độ heme trong cả hai thử nghiệm, hơn 50%. Chrysin, một lần nữa, là chất ức chế mạnh nhất, phù hợp với các giá trị động học ức chế được quan sát trong nghiên cứu này. Nồng độ heme với pinocembrin cao hơn năm lần, và với apigenin, nó cao hơn gần mười lần so với nồng độ với chrysin (lần lượt là 25,3 ± 0,4 và 45,1 ± 1,7%). Sự giảm nồng độ heme này cho thấy rằng sự ức chế không thể đảo ngược của CYP3A4 bởi các flavonoid được nghiên cứu có thể là do liên kết cộng hóa trị của chất trung gian phản ứng với heme. Cần lưu ý rằng hemes có thể bị phá hủy bởi các loại oxy phản ứng, làm giảm kết quả xét nghiệm hemochromopyridine. Để loại trừ khả năng này, quá trình ủ được tiến hành với sự có mặt của SOD và CAT (lable2), xác nhận kết luận nói trên.

Bước đầu tiên trong chu trình xúc tác của enzym cytochrom P450 là liên kết của cơ chất với ion sắt. Nếu chất ức chế cho thấy sự ức chế cạnh tranh với cơ chất, hoạt tính của enzyme có thể được lấy lại bằng thẩm phân, vì việc loại bỏ chất ức chế cho phép khôi phục hoàn toàn hoạt động của enzyme [26]. Tuy nhiên, nếu chất ức chế liên kết với sắt đen, thì cần sử dụng chất oxy hóa, chẳng hạn như PCF, trước khi thẩm tách để lấy lại hoạt tính của enzym. Nếu hoạt động của enzym được phục hồi, sự ức chế được đặc trưng là giả không thể đảo ngược [26]. Vì hoạt động của enzym không thể phục hồi sau khi thẩm tách có hoặc không có PCF, không flavonoid nào được thử nghiệm (ở nồng độ 25 uM) hoạt động như chất ức chế có thể đảo ngược hoặc giả không thể đảo ngược đối với enzym CYP3A4. Điều này cũng khẳng định rằng sự ức chế không thể đảo ngược do liên kết cộng hóa trị với heme hoặc apoprotein là nguyên nhân có thể gây ra bất hoạt enzym.

Cần lưu ý rằng chrysin làm giảm gần như hoàn toàn heme trong quá trình ủ: 97,1% không có và 94,5% với SOD và CAT (Bảng 2); trong khi kết quả hoạt động của enzyme còn lại trong các điều kiện tương tự cho thấy sự giảm hoạt tính của enzyme khoảng 99 phần trăm (Hình 4). Xét nghiệm hemochromopyridine ghi lại hemes từ tất cả các nguồn trong quá trình ủ, tức là cytochrome P450, cũng như cytochrome bs. Kết quả đối với chrysin chỉ ra rằng chất trung gian phản ứng được tạo ra bởi cytochrome P450 đã phản ứng với heme từ cytochrome P450 cũng như cytochrome b5.

Phân tích LC-MS sâu hơn đã được tiến hành để xác định các chất trung gian flavonoid phản ứng có thể có ở dạng chất phụ gia heme hoặc bị giữ lại bằng cách sử dụng glutathione như một chất loại bỏ gốc rễ (dữ liệu không được hiển thị). Tuy nhiên, chúng tôi không thể phân lập bất kỳ sản phẩm bổ sung nào được dự đoán có thể là do sự không ổn định của chất bổ sung trung gian flavonoid phản ứng và / hoặc heme / glutathione. Hành vi tương tự đã được quan sát thấy với mibefradil, một thuốc hạ huyết áp, bị rút khỏi thị trường do tương tác thuốc / thuốc. Mặc dù mibefradil làm giảm heme, nhưng chất trung gian phản ứng không được thiết lập [40].

4. Vật liệu và Phương pháp

4.1 Vật liệu

Bốn flavonoid (acacetin, apigenin, chrysin và pinocembrin) đã được sử dụng trong nghiên cứu này (Sigma-Aldrich, St.Louis, MO, USA). Các cytochromes tái tổ hợp P 450 3 A4 cùng biểu hiện với nicotinamide-adenine-dinucleotide phosphate (NADPH) reductase và cytochrome bs trong các thể tự động đã được mua từ Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA).

Dựa trên xét nghiệm cytochrome P450 carbon monoxide [41], hàm lượng của enzyme CYP3A4 do nhà sản xuất công bố đã được xác nhận là 1 uM.Glucose -6- phosphate (G6P) glucose -6- phosphate dehydrogenase (G6PDH) , và muối dinatri -nincotinamide-dinucleotide phosphate (NADP plus) được mua từ Sigma-Aldrich. Kali photphat (pa) và diclometan (pa) được mua từ dd Kemika (Zagreb, Croatia), axit formic (85%, pa) từ Semikem doo (Sarajevo, Bosnia và Herzegovina), và metanol được sử dụng để hòa tan thuốc thử và sắc ký từ Merck KGaA (Darmstadt, Đức). Nước siêu tinh khiết được sử dụng trong hỗn hợp ủ và sắc ký. Potassium dihydrogen phosphate (dd Kemika) được sử dụng để điều chế dung dịch đệm kali phosphate pH7,85; pH được điều chỉnh bằng cách sử dụng natri hydroxit mua từ Semikem doo Nifedipine (Sigma-Aldrich) và nifedipine oxy hóa (Cục Quản lý Chất lượng Thuốc, Dược điển Châu Âu, ấn bản thứ 10, Strasbourg, Pháp) được sử dụng trong nghiên cứu hoạt tính của enzym còn lại, cũng như trong động học khử hoạt. Testosterone (Sigma-Aldrich) và 6 - hydroxytestosterone (Cayman Europe, Tallinn, Estonia) được sử dụng để thử nghiệm trong việc ức chế giả không thể đảo ngược. Troleandomycin và diltiazem được lấy từ Cơ quan Sản phẩm Thuốc và Thiết bị Y tế (Zagreb, Croatia). Pyridine (pa) (Semikem doo), hemin bò (Sigma-Aldrich), và dimethylsulfoxide (Semikem doo) đã được sử dụng trong xét nghiệm hemochromopyridine. Potassium hexacyanoferrate (Siegfried AG, Zofingen, Thụy Sĩ) đã được sử dụng trong nghiên cứu về sự ức chế thuận nghịch và giả đảo ngược. Superoxide dismutase (SOD) (Sigma-Aldrich), catalase (CAT) (Sigma-Aldrich), và axit clohydric (36 phần trăm, pa) (Semikem doo) được sử dụng trong thử nghiệm độ đặc hiệu liên kết. Ủ enzyme được thực hiện trong bể nước (Inkolab, Zagreb, Croatia). Kiểm tra hoạt tính còn lại của enzyme và động học khử hoạt tính flavonoid được thực hiện bằng cách sử dụng sắc ký lỏng hiệu năng cao kết hợp với phát hiện UV-Vis (HPLC UV-Vis, Agi-lent 1100, Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA). Tính toán hoạt động dư và các thông số động học ức chế được thực hiện bằng cách sử dụng chương trình R (Dự án R cho Máy tính Thống kê, Vienna, Áo) và Microsoft Excel (Microsoft, Redmond, WA, Hoa Kỳ).

4.2.Methods

4.2.1. Xác định Động học Enzyme và Hoạt tính Dư

Ủ enzyme được thực hiện trong ba lần, với khuấy cơ học trong nồi cách thủy ở 378C. Phần nhỏ flavonoid với nồng độ cuối cùng là 1 μM được hòa tan trong metanol, chuyển vào ống thủy tinh và làm bay hơi đến khô, ngoại trừ các mẫu đối chứng không có chất ức chế (flavonoid). Sau khi làm bay hơi dung môi, hỗn hợp ủ được chuẩn bị đến thể tích 1 0 0 μL, bao gồm 5 pmol enzym CYP3A4, dung dịch đệm kali photphat 50 mM (pH 7,4) và nước siêu tinh khiết. Hệ thống tạo NADPH bao gồm 0,1 M G6P∶10mg / mL NADP cộng với ∶1000 IU / mL G6PDH =50 ∶25∶1 （v / v / ø） đã được chuẩn bị ngay trước khi sử dụng. Hệ thống tạo này chứa glucose -6- phosphat dehydrogenase tái tạo NADP thành NADPH, giữ cho nồng độ của coenzyme cytochrome P450 (NADPH) không đổi trong quá trình ủ. Việc bổ sung hệ thống tạo （15 phần trăm thể tích trong lần ủ cuối cùng, v / ø） bắt đầu phản ứng. Nifedipine được sử dụng để kiểm tra hoạt tính còn lại của enzym ở nồng độ cuối cùng là 200 uM. Phản ứng được dừng lại bằng cách sử dụng 1 mL dung dịch axit fomic 1% trong nước đá lạnh trong điclometan. Các mẫu được trộn, sau đó ly tâm trong 10 phút trên 1900g (Rotofix32, Westfalia, Đức). Sau khi ly tâm, hai lớp được hình thành (nước và lớp hữu cơ） .850 μL của lớp hữu cơ được chuyển đến cuvet và làm bay hơi. Chất phân tích sau đó được hòa tan trong 30 μL metanol. Cột Agilent Zorbax SBC18 （4,6 × 250 mm, 3 μm, Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA） được sử dụng để phân tích mẫu bằng HPLC. Pha động bao gồm metanol và nước theo tỷ lệ 64:36. Phân tích là đẳng cấp. Lưu lượng được đặt ở mức 1,0 mL tối thiểu -1. Thể tích tiêm được đặt ở 10 μL. Nifedipine được sử dụng làm chất nền đánh dấu. Phản ứng quan sát được là quá trình oxy hóa nifedipine, Sắc ký đồ được ghi lại ở bước sóng 254 nm. Thời gian phân tích được đặt ở 25 phút Thời gian lưu của nifedipine là 7,1 phút và của nifedipine bị oxy hóa là 10,8 phút [42]. Trong cả hai trường hợp, lượng sản phẩm thu được được quan sát là diện tích dưới đường cong (AUC) so với mẫu đối chứng. tất cả các flavonoid, nồng độ ức chế nửa tối đa (IC5), không đổi của sự ức chế (K;), hằng số của tốc độ bất hoạt (Kinect), và hiệu quả bất hoạt (Kinect / K;) đã được xác định. Troleandomycin được sử dụng như một chất kiểm soát tích cực — chất ức chế không thể đảo ngược của cytochrome P 450 3 A4,25 μM nồng độ troleandomycin làm giảm hoạt tính của enzym xuống 35 ± 5%.

4.2.2. Xét nghiệm Hemochromopyridine

Xét nghiệm hemochromopyridine được sử dụng để đánh giá khả năng phá hủy heme bởi dạng phản ứng trung gian trong chu trình cytochrome P45 0 và được thực hiện theo phương pháp được mô tả bởi Flink và Watson [43] và Paul et al. [44], với một số sửa đổi. Đường chuẩn được thiết lập bằng cách sử dụng hemin hòa tan trong dimethylsulfoxit (0. 6 đến 0. 1 μM）. Quang phổ được ghi lại ở bước sóng từ 5 0 0 đến 600 nm. Hỗn hợp ủ với 25 chất ức chế uM （flavonoid） đã được điều chế đến thể tích 200 μL. Phản ứng được bắt đầu bằng cách bổ sung hệ thống tạo NADPH (về chế phẩm, xem Phần 4.2.1), và ủ kéo dài trong 30 phút. Phản ứng dừng lại. sau nửa giờ bằng cách bổ sung pyridine (nồng độ cuối cùng 0,83 M) và natri hydroxit (nồng độ cuối cùng 0,06 M). Các mẫu được ghi lại trên máy quang phổ (UV -1280, Shimadzu Corporation, Kyoto, Nhật Bản) trong vòng 1 phút của việc bổ sung dung dịch kiềm, do tính không ổn định của pyridin hemochromogen ở các điều kiện cơ bản [44]. Nồng độ heme trong các mẫu được tính toán dựa trên đường chuẩn đã chuẩn bị. Thử nghiệm này được thực hiện ba lần. Việc ủ được lặp lại bằng cách sử dụng catalase và superoxide dismutase (mỗi lần 5 IU) trong t ông ủ hỗn hợp để ngăn chặn sự tạo ra hydrogen peroxide thông qua chu trình xúc tác vô tích.

4.2.3. Thử nghiệm ức chế giả không thể đảo ngược

Mục đích của bài tiểu luận này là kiểm tra sự hình thành phức chất cộng hóa trị với sắt đen (Fe2 cộng), bằng cách đánh giá sự phục hồi hoạt tính của enzym sau khi thẩm tách có hoặc không bổ sung chất oxy hóa. Ba loại thí nghiệm được thực hiện cho mỗi flavonoid: hỗn hợp ủ không có flavonoid (đối chứng), hỗn hợp ủ có flavonoid và hỗn hợp ủ có flavonoid mà chất oxy hóa được thêm vào sau khi ủ. Mỗi lần ủ với chất ức chế được thực hiện trong 30 phút bằng cách sử dụng các cài đặt thí nghiệm tương tự như đã mô tả ở trên (Phần 4.2.1). Sau khi ủ, các mẫu được chuyển sang các hộp lọc máu. Chất oxy hóa Aa — dung dịch kali hexacyanoferrat 20 mM được thêm vào một trong các tủ ấm trước khi thẩm tách [45]. Các băng cassette (Máy thẩm tách Slide-A-Lyzer, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) được ngâm trong dung dịch đệm kali photphat 50 mM (pH7,4) trong 30 phút (dung dịch thẩm tách được thay đổi ba lần). Sau khi thẩm tách, các mẫu được chuyển từ hộp trở lại ống thủy tinh, và hoạt tính của enzym còn lại được đánh giá bằng cách sử dụng testosterone làm chất đánh dấu （200 μM nồng độ cuối cùng）. Khi hệ thống tạo NADPH cũng được thẩm tách, nó một lần nữa được thêm vào tủ ấm để bắt đầu các phản ứng enzym. Các mẫu được ủ trong 30 phút với các cài đặt giống nhau (được mô tả trong Phần 4.2.1). Phản ứng được kết thúc bằng cách thêm dung dịch axit fomic trong diclometan. Các mẫu được phân tích bằng HPLC. Diltiazem, một chất ức chế giả không thể đảo ngược đã biết của cytochrome P 450 3 A4, được sử dụng như một chất đối chứng dương tính để đánh giá quá trình oxy hóa thành dạng sắt (đã quan sát thấy sự phục hồi hoàn toàn hoạt động của enzyme).

4.2.4. Xử lý kết quả

Phép thử t một phía sẽ được sử dụng để đánh giá ý nghĩa thống kê của sự khác biệt giữa các mẫu và mẫu chứng, dựa trên các phép đo hoạt tính còn lại. Một phương trình phi tuyến được sử dụng để tính giá trị IC50. Phương trình Michaelis-Menten được sử dụng để xác định hằng số bất hoạt và tốc độ bất hoạt của chất ức chế. Xử lý thống kê và chuẩn bị đồ thị được thực hiện bằng Chương trình R (Dự án R cho Máy tính Thống kê, Vienna, Áo) và Microsoft Excel (Microsoft, Redmond, WA, Hoa Kỳ).

5. Kết Luận

Acacetin, apigenin, chrysin và pinocembrin ức chế hoạt động của enzym CYP3A4 trong ống nghiệm. Chrysin là chất ức chế enzym mạnh nhất, với IC50, K thấp nhất; Giá trị Kinect và hiệu quả khử hoạt tính cao nhất. Tất cả các flavonoid đều làm giảm nồng độ heme của enzym, xác nhận rằng đây là sự ức chế không thể đảo ngược bởi chất trung gian phản ứng mà không thể ngăn chặn bằng cách bổ sung SOD và CAT. Không có flavonoid nào được thử nghiệm hoạt động như chất ức chế thuận nghịch hoặc giả không thể đảo ngược đối với enzym CYP3A4 ở nồng độ 25 uM, vì hoạt động của enzym không thể phục hồi khi thẩm tách có và không bổ sung kali hexacyanoferrat. Vì các flavonoid này có thể được tìm thấy nhiều trong các loại thực phẩm khác nhau như trái cây, rau, gia vị, trà và rượu vang đỏ, nên có khả năng chúng có thể gây trở ngại cho các loại xenobiotics khác nhau là chất nền CYP3A4. Các nghiên cứu in vivo sâu hơn là cần thiết để điều tra hoàn toàn các khả năng của các tương tác thuốc-thực phẩm như vậy, cũng như sự đóng góp có thể có của các enzym và chất vận chuyển khác trong các tương tác.

Bài này được trích từ Molecules 2021, 26, 3018