Làm thế nào để nghiên cứu sự đa dạng di truyền của Herba Cistanches?
Mar 14, 2022
Nghiên cứu về sự đa dạng di truyền của Herba Cistanches bởi RAPD
Tiếp xúc:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791
Cui Guanghong, Chen Min, Huang Luqi *, Xiao Suping, Li Da
(Viện Trung Quốc Materia Medica, Học viện Trung y Trung Quốc, Bắc Kinh 100700)
trừu tượng
Mục đích:Để nghiên cứu dân sốđa dạng di truyềncủaCistanche DesticolavàCistanche tubulosa.
Phương pháp:Hai quần thể hoang dã củaCistanche Desticolavà bốn quần thể hoang dã củaCistanche tubulosađã được phân tích bởi RAPD, vàđa dạng di truyềncủa các quần thể đã được phân tích bằng phiên bản phần mềm 1.31 của POPGENE.
Kết quả:Phần trăm trung bình của các locus đa hình củaCistanche Desticolalà 47,37 phần trăm, locus đa hình của hai quần thể là 39,47 phần trăm và 35,53 phần trăm, và độ đa dạng gen trung bình của Nei là 0. 135 8. Shannon của còn hơn thế. Chỉ số thông tin trạng thái là 0. 207 2 và hệ số phân biệt gen Gst {{1 {{2 0}}}}. 254 6. Tỷ lệ trung bình của các locus đa hình ở Cistanche là 27,59 phần trăm và tỷ lệ phần trăm các locus đa hình trong mỗi quần thể dao động từ 19,54 phần trăm đến 25,29 phần trăm, trong đó quần thể Andier có 25,29 phần trăm cao nhất và độ đa dạng gen trung bình của Nei là 0. { {21}}, chỉ số thông tin đa hình của Shannon là 0,1258, hệ số biệt hóa gen Gst =0. 175 5.
Sự kết luận:Cistanche DesticolavàCistanche tubulosacó sự phân hóa nhất định giữa các quần thể. Cácđa dạng di truyềncủa Desert Cistanche cao hơn đáng kể so với Cistanche tubulosa và đã phân biệt thành hai kiểu sinh thái.
Từ khóa: Cistanche Desticola; Cistanche tubulosa; RAPD; đa dạng di truyền
[Số phân loại thư viện Trung Quốc] S 567 [Mã nhận dạng tài liệu] A [Số bài báo] 1001-5302 (2004) 08-0727-04
Cistanche là một loài thực vật ký sinh thuộc chi Cistanche trong họ Lidanaceae, còn gọi là Dayun, là một loại dược liệu quý của Trung Quốc. Các loài thực vật nguồn gốc chính của Cistanche Desticola ở đất nước tôi làCistanche DesticolaYCMa và C.tubulosa (Schenk) R.Wight [1]. Các cây ký chủ của Cistanche Desticola là Haloxylon ammodendron và Haloxylon ammodendron, phân bố chủ yếu ở Liên minh Alashan ở Nội Mông, bắc Tân Cương, Thanh Hải, Cam Túc và những nơi khác. Sự phân bố của Cistanche Desticola cũng giống như ở các cây ký chủ. Ở nước tôi, Cistanche cistanche chỉ phân bố ở các hạt xung quanh sa mạc Taklimakan phía nam dãy núi Thiên Sơn ở Tân Cương, và sự phân bố của nó không hoàn toàn đồng bộ với cây chủ Tamarix. Các vùng khác như bắc Tân Cương, Cam Túc, Thanh Hải, Ninh Hạ, Nội Mông, Thiểm Tây, và những nơi khác Cây Tam thất không bị Cistanche Tubula ký sinh [2]. Do nhu cầu về Cistanche gia tăng nhanh chóng trong những năm gần đây, dẫn đến sự tuyệt chủng của các nguồn tài nguyên của nó, các nguồn tài nguyên Cistanche hoang dã đã bị thu hẹp chỉ còn một số khu vực sản xuất chính. Cả hai đều được xếp vào danh sách các loài thực vật được bảo vệ có nguy cơ tuyệt chủng ở nước tôi [3], trong số đóCistanche Desticolađã được đưa vào Phụ lục II của Công ước CITES [4].
Sau nhiều năm nghiên cứu, việc nghiên cứu nhân tạo giống Cistanche đã thành công, đang trong giai đoạn xúc tiến và trồng trên diện rộng. Tuy nhiên, làm thế nào để ngăn chặn sự suy giảm của các loài Cistanche trong quá trình sản xuất công nghiệp, làm thế nào để khôi phục quần thể hoang dã hạn chế càng sớm càng tốt, và bảo tồn nguồn gen quý hoang dã, là những chìa khóa để đạt được mục đích sử dụng bền vững. Đối với di sản được bảo vệ của Cistanche [Ngày nhận], 2004-03-11 [Dự án Quỹ] Dự án Phúc lợi Xã hội Bộ Khoa học và Công nghệ (2001.109); Dự án "Kế hoạch 5 năm lần thứ 10" của Bộ Khoa học và Công nghệ (2001BA701A09a) [Tác giả tương ứng] * Huang Luqi, Tel :( 010) 64014411-2955, E-mail: huangluqi @ 263.net Nghiên cứu về sự lây truyền vẫn trống. Nghiên cứu này sử dụng công nghệ RAPD để nghiên cứu 2 quần thể hoang dã củaCistanche Desticolavà 4 quần thể hoang dã củaCistanche tubulosavà phân tích cả hai Sự khác biệt trongđa dạng di truyềndự kiến sẽ cung cấp một cơ sở di truyền thực nghiệm quan trọng để bảo vệ Cistanche, một loại thuốc quý của Trung Quốc.
1. Chất liệu và phương pháp
1.1 Vật liệu
Cistanche Desticolađược thu thập từ Hạt Jimsar ở Tân Cương và khu vực Jilantai của Liên đoàn Alxa Cổ ở Nội Mông. Các quần thể Cistanche được thu thập từ Quận Minfeng và Quận Yutian, Tân Cương. Quận Minfeng hiện là khu vực có sản lượng Cistanche cistanche lớn nhất, với mật độ cao nhất và các cộng đồng rừng tự nhiên tương đối hoàn chỉnh. Các điểm lấy mẫu Andil, Sawuzek, Yatongguz và Daheyan của Hạt Yutian là các khu vực sản xuất chính, nằm ở sông Andir, sông Yeyike, sông Yatongguzi và Kelaniya Ở hạ lưu sông, khoảng cách giữa các quần thể lớn hơn 50 km. Mỗi quần thể được lấy mẫu ngẫu nhiên 19-30 cá thể. Các mẫu nhanh chóng được làm khô trong silica gel và được sử dụng để tách chiết DNA (Bảng 1).
Bảng 1 Lấy mẫu quần thể và khu vực sản xuất của Cistanche Desticola và Cistanche tubulosa
1.2 Tách chiết DNA
Phương pháp tách chiết DNA tổng số sử dụng phương pháp muối cao, pH thấp [5]. Mẫu DNA được đưa vào máy đo quang phổ để phát hiện nồng độ của khuôn mẫu DNA, sau đó điện di trên gel agarose 1%, nhuộm EB, quan sát và chụp ảnh dưới ánh sáng cực tím, điện di DNA với các dải rõ ràng và ít đuôi hơn được sử dụng để phân tích RAPD.
1.3 Sàng lọc mồi RAPD
Vì thí nghiệm phát hiện ra rằng cùng một loại mồi có ảnh hưởng không tốt đến sự khuếch đại đồng thời của cả haiCistanche Desticolavà Cistanche tubulosa, các mồi được sàng lọc độc lập. 150 mồi ngẫu nhiên (10 bp), hệ thống phản ứng 25 μL của Công ty TNHH Công nghệ sinh học Shenggong Thượng Hải đã được sử dụng để khuếch đại và sàng lọc; mỗi mồi sử dụng 2 tiêu bản quần thể và 1 nước cất hai lần khử trùng làm mẫu đối chứng trắng và thu được 10 mồi để khuếch đại Cistanche Desticola với các dải rõ ràng, tính đa hình mạnh và độ lặp lại tốt: S490, S 1 101, S {{ 8}}, S 1 137, S 1 165, S 1 218, S 1 222, S 2 015, S 2 112, S {{15 }}; 10 mồi củaCistanche tubulosa: S1 141, S1 146, S1 183, S1 208, S1 500, S2 032, S2 042, S2 052, S2 059, S2 155.
1.4 Khuếch đại PCR và phát hiện sản phẩm
Các đoạn mồi đã chọn được sử dụng để khuếch đại DNA khuôn mẫu củaCistanche DesticolavàCistanche tubulosabằng PCR. DNA bộ gen được pha loãng thành 5 0 ng · μL -1 theo nồng độ đo được dưới dạng khuôn mẫu. Tổng thể tích phản ứng là 25 μL, trong đó 1 0 × PCR Buffer 2,5 μL, Mg2 cộng với 1,5 μL, Taq (5 U · μL -1) 0,2 μL, dNTP Hỗn hợp (mỗi 2,5 mM) 1 μL, 5 μM Primer 1 μL, DNA mẫu 1 μL, nước cất hai lần tiệt trùng 18,8 μL, dung dịch khuếch đại PCR ở trên là sản phẩm của Shanghai Sangon. Khuếch đại được thực hiện trên bộ tuần hoàn nhiệt PTC -100. Chương trình khuếch đại được biến tính trước 94 độ trong 5 phút và sau đó 40 chu kỳ. Mỗi chu kỳ bao gồm 94 độ 45 giây, 34 độ 1 phút, 72 độ 1 phút 30 giây, và cuối cùng là Kéo dài ở 72 độ trong 5 phút. Các sản phẩm khuếch đại được điện phân trên gel agarose 2,0% (chứa EB) trong bộ đệm 1 × TAE và được quan sát và chụp ảnh dưới hệ thống hình ảnh gel SYNGENE.
1.5 Thống kê và phân tích dữ liệu
Trong phổ điện di, vị trí tương ứng của sản phẩm phản ứng trên gel được so sánh theo tiêu chuẩn trọng lượng phân tử, và trọng lượng phân tử của sản phẩm khuếch đại được ước tính. Băng có dải được ghi là 1 và dải không có dải được ghi là 0, tạo thành biểu đồ ma trận 0 / 1 và nhập vào máy tính, sử dụng POPGENE32 để tính toán phần trăm các vị trí đa hình (PPL) của mỗi quần thể, chỉ số đa dạng gen của Nei (H), chỉ số thông tin đa hình của Shannon (I), hệ số khác biệt gen (Gst), đa dạng gen (Ht),Đa dạng di truyền(Hs), nhận dạng di truyền (I) và khoảng cách di truyền (D) của Nei (1978) trong một quần thể, và phân tích cụm được thực hiện bằng phương pháp UPGMA.
2. Kết quả và phân tích
2.1 Đa dạng di truyền của Cistanche
Tất cả các mẫu đều thu được các dải có trọng lượng phân tử nằm trong khoảng từ 200 đến 2 200 bp (Hình 1, 2). Tổng cộng có 76 locus được phát hiện trong 60 mẫu từ 2 quần thể củaCistanche Desticola, 36 trong số đó là locus đa hình, chiếm 47,37 phần trăm, H=0. 135 8, I=0. 207 2. Trong số đó, PPL của Jimsar là 39,47% và của Gilanty là 35,53%. H là 0. 0 95 3 và 0. 1 070 và tôi lần lượt là 0. 15 12 và 0. 163 7. Tổng cộng 87 locus được phát hiện ở {{2 0}} cá thể từ 4 quần thể Cistanche, 24 trong số đó là locus đa hình, chiếm 27,59 phần trăm, H=0. 084 8, Tôi=0. 1278. PPL cao nhất là Andil với 25,29%, trong khi PPL thấp hơn ở Savuzek và Yatungusi (cả hai đều ở mức 19,54%). H là 0. 062 1 -0. 080 0, tôi là 0. 095 0 -0. 116. Kích thước của H và I phù hợp với xu hướng kích thước của PPL của mỗi dân số và các hệ số là lớn nhất ở Andier, tiếp theo là Dayan. Trong trường hợp cùng một PPL, Savuzek's H=0. {{4 0}} Tổng I=0. 097 0 cao hơn một chút so với 0. {{44 }} và 0. 095 0 của Yatunguska (Bảng 2).
Hình 1 Các dải khuếch đại RAPD của một số mẫu sa mạcCistanche Desticola, mồi S 490 1-10. Garantie mẫu; 11-20. Jimpster lấy mẫu M-DNA Marker (200 - 2 000 bp)
Hình 2 Các dải khuếch đại RAPD của một số mẫu Cistanche Tubulosa, mồi S 2 042 1-20. Điểm đánh dấu M-DNA mẫu Tân Cương Andier (200 - 2 000 bp)
Bảng 2đa dạng di truyềncủaCistanche DesticolavàCistanche tubulosaquần thể
2.2 Phân tích biến thể di truyền của Cistanche
Theo mức độ củađa dạng di truyềntrong quần thể (Hs), sự khác biệt giữa các quần thể (Dst) và tỷ lệ khác biệt di truyền giữa các quần thể trong tổng số khác biệt di truyền (Gst), có thể thấy rằng tổng số đa dạng di truyền của Cistanche Desticola Ht=0. {{ 1}}, trong đó Hs=0. 101 2, Gst =0. 254 6. Cistanche Ht =0. 082 2, trong đó Hs =0. 067 8, Gst =0. 175 5 (Bảng 3). Kết quả trên chứng tỏ rằng các quần thể có sự biến đổi di truyền ở một mức độ nhất định. Sự khác biệt giữa các quần thể sa mạc của Cistanche Desticola chiếm 25,46% tổng số biến thể, và sự biến động của các quần thể Cistanche tubulosa chiếm 17,55% tổng số biến thể.
Bảng 3 Phân tích sự biến đổi di truyền củaCistanche DesticolavàCistanche tubulosa.
2.3 Khoảng cách di truyền và phân tích cụm giữa các quần thể Cistanche Desticola
Khoảng cách di truyền của hai quần thể làCistanche Desticolalà {{0}}. 080 0 và danh tính di truyền là 0. 9231. Khoảng cách di truyền của bốn quần thể Cistanche là 0. 012 0-0. 031 5 và đặc điểm nhận dạng di truyền là 0. 9690-0. 988 1 (Bảng 4) . Việc phân nhóm các cá thể Cistanche Desticola và Cistanche tubulosa cho thấy rằng Cistanche Desticola có thể được tập hợp thành hai nhóm riêng biệt tùy theo quần thể, trong khi các cá thể khác nhau của cistanche tubulosa không thể thành cụm theo quần thể, điều này cũng chỉ ra rằng sự khác biệt về mặt di truyền giữa các loài Cistanche Desticola dân số tương đối cao. Lớn, nhưng sự khác biệt về di truyền giữa các quần thể của Cistanche tubulosa là nhỏ.
Bảng 4 Nhận dạng di truyền (dưới cùng bên trái) và khoảng cách di truyền (trên cùng bên phải) củacistanche tubulosa.
3. Thảo luận
3.1 Đa dạng di truyền của Cistanche
Mức độđa dạng di truyềncủa thực vật không thể tách rời đặc điểm sinh học, môi trường sống, nguồn gốc và quá trình tiến hóa của chúng. Trong số đó, hệ thống nhân giống, phạm vi phân bố, dạng sống, phương thức phát tán hạt phấn và hạt có ảnh hưởng lớn nhất [6]. Theo kết quả thống kê dữ liệu allozyme của 499 loài thực vật trong 165 chi của Ge Song et al. [7], tính đa hình của Cistanche ở cấp độ loài nên vào khoảng 5 0 phần trăm và mức độ đa hình ở cấp độ quần thể phải là khoảng 40 phần trăm. Khoảng 0,17. Các mức đa hình thu được trong thí nghiệm này đều thấp hơn các giá trị trung bình này. Đồng thời, so sánh với mức độ locus đa hình thu được bằng phương pháp RAPD đối với một số loài thực vật có nguy cơ tuyệt chủng thông thường, chẳng hạn như 32% các loài có nguy cơ tuyệt chủng Linh sam bạc [18], 22,5% hoa mẫu đơn lùn và 27,6% hoa mẫu đơn tím [9]] Có thể thấy rằng sự đa dạng di truyền củaCistanche Desticola thấp hơn một chút so với mức trung bình, trong khi tính đa dạng di truyền của Cistanche tubulosa đã cực kỳ thấp.
3.2 Lý do cho sự đa dạng di truyền thấp của Cistanche
Cistanche là một loài thực vật ký sinh cụ thể, đồng thời phân bố ở các vùng sa mạc hẹp. Do đó, lối sống độc đáo và diện tích sống tương đối hẹp có thể là lý do cố hữu khiếnđa dạng di truyềncủa Cistanche nói chung là thấp hơn so với các cây thông thường.
Sự khác biệt trongđa dạng di truyềngiữa Cistanche Desticola và Cistanche tubulosa có thể liên quan đến sự khác biệt về phạm vi phân bố của hai loài này và liệu chúng có đồng bộ với phân bố ký chủ hay không. Khu vực phân bố của Cistanche tubulosa nhỏ hơn đáng kể so với Cistanche Desticola, và sự phân bố của nó rất không đồng bộ với cây chủ. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng có sự đa dạng phong phú giữa các loài Tamarix. Ví dụ, Zhang Juan và cộng sự. báo cáo rằng sự đa dạng di truyền của Tamarix sibiricus cao tới 98,7 phần trăm [10], trong khi sự đa dạng di truyền của Cistanche là cực kỳ kém, cho thấy sự tiến hóa lâu dài. Cistanche tubulosa có thể đã trải qua những tắc nghẽn nghiêm trọng trong lịch sử, dẫn đến mất một lượng lớnđa dạng di truyền.
Đồng thời, theo các cuộc điều tra, người ta thấy rằng không cóCistanche Desticolatrong vòng 20 km từ các khu định cư của con người có thể được khai quật và nở hoa bình thường. Các hố lớn và nhỏ của Cistanche đã được khai quật, đặc biệt là ở các khu vực sản xuất chính của hoa ống Cistanche. Do đó, nó được gây ra bởi một lượng lớn đào. Việc thiếu nguồn gốc xuất xứ và môi trường sống bị phá hủy có thể là những lý do chính do con người tạo ra chođa dạng di truyềncủa Cistanche.
3.3 Sự khác biệt di truyền của Cistanche
Do khoảng cách địa lý giữa Tân Cương và Nội Mông, sự cách biệt về địa lý đã gây ra sự phân hóa và cô lập giữa cácCistanche Desticolacác quần thể, và hai quần thể đã hình thành các kiểu sinh thái khác nhau về mặt di truyền do sự thích nghi của chúng với các điều kiện môi trường sống địa phương. Do phạm vi phân bố hẹp và sự trao đổi gen thường xuyên giữa các quần thể nên sự khác biệt về gen giữa các quần thể ít hơn so với loài Cistanche Desticola.
3.4 Khuyến nghị để bảo vệ Cistanche
Đa dạng di truyềnlà điều kiện tiên quyết cho sự tồn tại lâu dài của các loài tránh bị tuyệt chủng. Giảmđa dạng di truyềnsẽ làm giảm khả năng thích ứng của quần thể với những thay đổi của môi trường trong cả ngắn hạn và dài hạn [11]. Vì vậy, việc bảo vệ sự đa dạng di truyền của Cistanche là rất quan trọng đối với việc bảo vệ loại thuốc quý hiếm của Trung Quốc này. Vì Cistanche là loài có kiểu sinh thái đặc biệt nên chủ yếu được bảo vệ tại chỗ, và cơ sở bảo vệ tự nhiên của Cistanche nên được thiết lập theo tính đa dạng di truyền của nó. Ví dụ, choCistanche tubulosa, vì sự đa dạng di truyền chủ yếu đến từ bên trong quần thể, các quần thể có đa dạng di truyền lớn sẽ là đối tượng bảo vệ ưu tiên [12], chẳng hạn như Angier của Minfeng và Daheyan của Yutian có thể được liệt vào danh sách các cơ sở bảo vệ tự nhiên cho Cistanche. Đối vớiCistanche Desticola, các quần thể ở Nội Mông và Tân Cương đã có những thay đổi đáng kể, do đó, việc nghiên cứu thử nghiệm cần được tăng cường hơn nữa để xác định các quần thể được ưu tiên bảo vệ. Đồng thời, thực hiện nghiên cứu cơ bản về sinh học sinh sản và sinh thái thụ phấn của Cistanche để cung cấp thông tin cho việc bảo vệ nó.
Người giới thiệu
[1] He Yanping, Yin Zhezhu, Tu Pengfei, et al. Nhận dạngCistanchevà điều tra các dược liệu thương mại. Dược liệu Trung Quốc, 1997, 20 (3): 117.
[2] Liu Mingting. Nghiên cứu toàn diện và ứng dụng chung của cây Tamarix. Lan Châu: Nhà xuất bản Đại học Lan Châu, 1995.
[3] Fu Guoli. Sách Đỏ về Thực vật Trung Quốc. Bắc Kinh: Nhà xuất bản Khoa học, 1992.
[4] Văn phòng quản lý xuất nhập khẩu các loài nguy cấp của Cộng hòa nhân dân Trung Hoa, Ủy ban khoa học về các loài nguy cấp của Cộng hòa nhân dân Trung Hoa. Công ước về buôn bán quốc tế các loài động, thực vật hoang dã nguy cấp (CITES), Phụ lục II. 2003.41.
[5] Zou Yuping, Wang Xiaoquan, Lei Yiding, et al. Chiết xuất và xác định tổng số DNA của một số loài thực vật có nguy cơ tuyệt chủng và họ hàng của chúng. Thực vật học Acta, 1994, 36: 528.
[6] Wang Hongxin, Hu Zhiang. Hệ thống nhân giống cây trồng, cấu trúc di truyền và bảo vệđa dạng di truyền. Đa dạng sinh học, 1996, 4 (2): 92.
[7] Chen Jiakuan, Yang Ji. Sinh học Tiến hóa Thực vật. Vũ Hán: Nhà xuất bản Đại học Vũ Hán, 1994.
[8] Wang Xiaoquan, Zou Yuping, Zhang Daming, et al. Phân tích RAPD về đa dạng di truyền của linh sam bạc. Khoa học Trung Quốc (C), 1997, 40 (2): 145.
[9] Pei Yanlong, Zou Yuping, Yin Zhen, et al. Báo cáo sơ bộ về phân tích RAPD của hoa mẫu đơn lùn và hoa mẫu đơn tím. Tạp chí Phân loại thực vật Trung Quốc, 1995, 33 (4): 350.
[10] Zhang Juan, Yin Linke, Zhang Daoyuan. Nghiên cứu sơ bộ vềĐa dạng di truyềnquần thể tự nhiên của Tamarix lanceolate. Nghiên cứu Thực vật Vân Nam, 2003, 25 (5): 557.
[11] Ellstrand NC, Elam D R. Hậu quả di truyền quần thể của quy mô quần thể nhỏ: Ý nghĩa đối với việc bảo tồn thực vật. Đánh giá hàng năm Hệ sinh thái và Hệ thống học, 1993, 34: 217.
[12] Liu Zhanlin, Zhao Guifang. Nguyên tắc di truyền quần thể và ứng dụng của nó trong việc bảo vệ các loài thực vật có nguy cơ tuyệt chủng. Đa dạng sinh học, 1999, 7 (4): 340.
Từ: China Journal of Chinese Materia Medica; Tập 29, Số phát hành ngày 8 tháng 8 năm 2004
