Cistanche sa mạc cải thiện tổn thương tế bào thần kinh của đồi hải mã ở chuột mắc bệnh Parkinson thông qua việc điều chỉnh con đường chống oxy hóa KEAP1/NRF2/HO -1

Tóm tắt:

 

Mục tiêu khám phá hiệu ứng củaCistanche sa mạc khi bị tổn thương tế bào thần kinh trong bệnh Parkinson (PD)chuột và cơ chế liên quan của nó. Phương pháp chuột đực Sprague-Dawley (SD) được chia ngẫu nhiên thành ba nhóm (1 0 chuột trong mỗi nhóm): nhóm kiểm soát, nhóm mô hình và nhóm Cistanche. Những con chuột trong nhóm mô hình và nhóm điều trị được tiêm nội sọ với 6- hydroxydopamine (6- ohda). Những con chuột trong nhóm cistanche được cung cấp 0,216g/ ml dung dịch cistanche, chuột trong nhóm trống và nhóm mô hình được cung cấp tưới nước muối bình thường, lượng tưới là 1ml/ (100g · d) trong hai tuần .. Hình thái học và cơ sở hạ tầng của các tế bào thần kinh. Hình thái của các cơ thể Nishi ở khu vực Hemimani được quan sát bởi vết bẩn của Nishi. Mức độ malondialdehyd (MDA) và superoxide effutase (SOD) đã được phát hiện bằng phương pháp axit thiobarbituric và phương pháp tetrazolium nitroblue. Những thay đổi của protein 1 liên quan đến ECH 1 (KEAP 1), yếu tố hạt nhân E 2- Yếu tố 2 (NRF 2) và protein Heme cyclooxygenase 1 (ho -1}) được phân tích bằng phương Tây. Kết quả sau khi điều trị bằng thuốc sa mạc cistanche, cấu trúc mô vùng đồi thị của chuột PD đã được cải thiện, hình thái của các tế bào thần kinh đã được cải thiện, bệnh pyretosis hạt nhân đã được giảm bớt giảm. Biểu hiện protein của NRF 2 và HO -1 tăng lên. Kết luận Cistanche sa mạc có thể cải thiện tổn thương của các tế bào thần kinh vùng đồi thị và giảm mức độ phản ứng căng thẳng oxy hóa ở vùng đồi thị của chuột PD. Cácảnh hưởng của sa mạc cistanchetrongĐiều trị PDChuột có liên quan chặt chẽ đến quy định của Keap -1 /nrf 2 /ho -1 đường dẫn tín hiệu.

 

 

 

Cistanche chất lượng cao để điều trị PD

 

Từ khóa: Cistanche sa mạc;Bệnh Parkinson; Stress oxy hóa; Hippocampus; tế bào thần kinh; KEAP1; NRF2; Ho -1

 

Theo thống kê từ nghiên cứu dữ liệu bệnh toàn cầu, các bệnh thần kinh đã trở thành nguyên nhân hàng đầu gây khuyết tật trên toàn thế giới. Trong lĩnh vực này, bệnh Parkinson (PD) đã trở thành một trong những bệnh phát triển nhanh nhất với sự gia tăng tỷ lệ lưu hành theo tiêu chuẩn đáng kể, tăng các trường hợp khuyết tật và tỷ lệ tử vong tăng. một.
Từ năm 1990 đến 2020, số bệnh nhân PD trên toàn thế giới tăng 118%, đạt 6,2 triệu và tỷ lệ mắc bệnh vẫn đang tăng theo năm [1-2]. Bệnh nhân PD thường có các triệu chứng vận động như run, cứng cơ, bradykinesia và độ khó cân bằng trong giai đoạn cuối. Tuy nhiên, các triệu chứng không vận động như suy giảm nhận thức có thể xảy ra trong giai đoạn đầu của bệnh. Khi bệnh tiến triển, suy giảm nhận thức sẽ dần dần trở nên tồi tệ hơn và trở nên nghiêm trọng hơn.

Cistanche chất lượng cao để điều trị PD

Ảnh hưởng đến chất lượng cuộc sống của bệnh nhân [3]. Hippocampus là một tổ chức quan trọng trong não để học tập không gian và nhận thông tin bên ngoài. Nó là cấu trúc chính để hiện thực hóa các chức năng nhận thức của con người. Rối loạn chức năng vùng đồi thị có liên quan chặt chẽ đến sự khởi phát của rối loạn chức năng nhận thức ở bệnh nhân PD. Stress oxy hóa có liên quan đến sự phát triển của các tế bào thần kinh trong mô vùng đồi thị. Thiệt hại [4-5]. Do đó, nếu các tế bào thần kinh vùng đồi thị được bảo vệ ở bệnh nhân mắc PD, nó có thể cải thiện nhận thức của bệnh nhân và trì hoãn sự tiến triển của bệnh.
Trong những năm gần đây, một loạt các loại thuốc thảo dược Trung Quốc đã được chứng minh là có hiệu quả trong việc điều trị các bệnh liên quan đến thần kinh [6]. Cistanche sa mạc là một loại thuốc cổ truyền Trung Quốc có thể nuôi dưỡng thận và bổ sung tinh chất và máu. Nó đã được sử dụng để điều trị các bệnh thần kinh như đột quỵ do thiếu máu cục bộ và viêm thần kinh [7]. Các nghiên cứu trước đây của nhóm nghiên cứu đã chỉ ra rằng sa mạc cistanche có thể cải thiện hành vi của chuột mô hình PD và giảm apoptosis của các tế bào thần kinh dopamine trong khu vực provia nigra của midbrain [8-9]. Tuy nhiên, không rõ liệu sa mạc Cistanche có thể cải thiện tổn thương mô vùng đồi thị ở chuột mô hình PD hay không. Do đó, nghiên cứu này đã thiết lập một mô hình chuột PD để quan sát ảnh hưởng của sa mạc cistanche đối với tổn thương mô vùng đồi thị và khám phá cơ chế của nó, để cung cấp ý tưởng mới cho điều trị PD.Tian công ty sinh học); Thuốc thử nhuộm Nissl (Công ty sinh học Senbing Senbeijia); Isoflurane (Công ty sinh học Thượng Hải Yaji).

 

1 vật liệu và phương pháp

1.1 Vật liệu

1.1.1 Động vật thí nghiệm

30 6- Chuột đực SD tuần tuổi cân 210-230 g đã được sử dụng. Trung tâm động vật thí nghiệm của Đại học Y học cổ truyền Trung Quốc đã cung cấp động vật thí nghiệm và các cơ sở môi trường động vật thí nghiệm y tế nói chung. Thí nghiệm đã được phê duyệt bởi Ủy ban Đạo đức Động vật của tổ chức này và số đăng ký đạo đức là 1N2023019.

1.1.2 Thuốc thử thử nghiệm
Cistanche sa mạc hạt (Bệnh viện Nhân dân thứ ba Fujian); 6- Hydroxydopamine (6- ohda) thuốc thử (Công ty TNHH Công nghệ Biolabor Bắc Kinh); Hematoxylin-eosin (HE) nhuộm thuốc thử (Taizhou Yunke Biotech Co., Ltd.); Protein mô động vật lysate (Công ty sinh học Bắc Kinh Solebao); Các chất ức chế phosphatase protein (Công ty sinh học Wuhan Pujian); Các chất ức chế protease (Công ty công nghệ sinh học Hunan Yunbang); Protein liên quan đến Ech giống như Kelch -1 (Keap1) Kháng thể đơn dòng (Công ty công nghệ sinh học Vân sinh học); Glyceraldehyd 3- Phosphate dehydrogenase (GAPDH) Kháng thể đơn dòng (Wuhan Huaamei Biological); Yếu tố hạt nhân E2 liên quan đến yếu tố 2 (NRF2), heme oxyase 1 (hemoxygenas -1, ho -1) kháng thể đơn dòng (Wuhan Pujian Biotech Co. Bộ dụng cụ phát hiện Superoxide Effutase (SOD) và Malondialdehyd (MDA) (Công ty TNHH Công nghệ sinh học Thượng Hải); Nissl nhuộm thuốc thử (Công ty TNHH Công nghệ sinh học Senbing Senbeijia, Ltd.); Isoflurane (Công ty TNHH Công nghệ sinh học Thượng Hải Yaji).

 

1.1.3 Dụng cụ

JEA3001 Cân bằng điện tử (Công ty TNHH Công cụ đo lường Thượng Hải Puchun); Cân bằng điện tử BSA224S (Sartorius, Đức); Stab S2T Shaker nhiệt độ thấp (Công ty TNHH Công cụ Khoa học Thượng Hải Hetian); Máy cắt parafin RM2235 hoàn toàn tự động (Leica, Đức); Trình đọc vi bản đa chức năng I3X (Thiết bị phân tử, Hoa Kỳ); BX63
Kính hiển vi huỳnh quang (Olympus, Nhật Bản); Máy ly tâm cầm tay DLAB D1008/D1008E (Bắc Kinh Dalong Xingchuang Experimental Mitch CÔNG TY TNHH CÔNG TY); Tủ lạnh nhiệt độ cực thấp F740HI (Epend, Đức); MINIPRO EPBASIC CUNG CẤP CUNG CẤP CUNG CẤP CUNG CẤP (Công ty TNHH Công nghệ sinh học Thượng Hải Yisheng); Lò khô nhiệt độ không đổi (Công ty TNHH Thiết bị Khoa học Hàng Châu Hàng Châu); Ascent Max Ductless Fume Hood (Công ty TNHH Phát triển Doanh nghiệp Thượng Hải Yishike).

 

1.2 Phương pháp

1.2.1 Thành lập mô hình và nhóm động vật

Rats were placed in an environment with a temperature of 24-25℃, a humidity of 55%-60%, and a 12/12 h light/dark cycle, with free access to food and water. SD rats were randomly divided into 3 groups (10 rats in each group): blank group, model group, and Cistanche deserticola group. According to the PD animal model establishment method [5], SD rats in the model group and Cistanche deserticola group were anesthetized by 2% isoflurane inhalation and fixed on a brain stereotaxic instrument. The skin was incised along the midline of the skull, and the skull membrane was bluntly separated. The coordinates of the right striatum were determined by referring to the rat brain stereotaxic atlas. 8μL of 6-OHDA was injected intracranially at the above target at a concentration of 2μg/μL, and the blank group rats were injected with an equal volume of saline. Successful modeling criteria: One week after modeling, apomorphine (0.5 mg/kg) was intraperitoneally injected to induce rat rotation. The rats rotated from the healthy side to the affected side, and the number of rotations within 30 min was >21 0 Vòng tròn, được coi là một mô hình thành công. Sau đó, những con chuột trong nhóm sa mạc Cistanche đã được điều trị bằng dung dịch sa mạc cistanche 0,216 g/ml mỗi ngày, và nhóm và nhóm mô hình trống được đưa ra bằng nước muối bình thường. Thể tích GAVAGE của ba nhóm chuột là 1 ml/(100 g · d) trong hai tuần [9]. Sau khi điều trị cho mỗi nhóm chuột được hoàn thành, những con chuột đã được tiêu hóa bởi 2% gây mê bằng đường hít isoflurane và các mô não đã được thu thập cho các nghiên cứu thực nghiệm tiếp theo.

 

1.2.2 Quan sát những thay đổi bệnh lý ở mô vùng đồi thị bằng nhuộm hematoxylin-eosin

 

Các mô vùng đồi thị của chuột trong mỗi nhóm được thu thập, đặt trong dung dịch formaldehyd, mất nước bằng ethanol gradient, nướng trong lò sấy, sáp hòa tan, khô, ướt, nhuộm màu với anh

 

1.2.3 Quan sát kính hiển vi điện tử truyền tải về cơ sở hạ tầng của các tế bào thần kinh vùng đồi thị

Các mô vùng đồi thị được đặt trong 3% glutaraldehyd cố định, mất nước bằng ethanol gradient, nhúng (nhựa epoxy) và các phần siêu âm đã được điều chế. Nhuộm chì citrate và uranyl acetate đã được sử dụng để quan sát những thay đổi siêu tế bào của các tế bào thần kinh vùng đồi thị (dưới kính hiển vi điện tử truyền qua).

 

1.2.4 Nhuộm Nissl để quan sát sự thay đổi của cơ thể Nissl trong mô vùng đồi thị

Các phần paraffin mô vùng đồi thị được đề cập ở trên được ngậm nước trong ethanol khan, ethanol gradient 95% và 70%, tương ứng. Sau khi rửa bằng nước cất 3 lần, nhuộm bằng dung dịch nhuộm NISSL trong 5 phút, sau đó rửa bằng cồn gradient mất nước và nước cất, và trong suốt bằng xylen. Các phần được niêm phong bằng keo trung tính, và được quan sát và ghi lại dưới kính hiển vi quang học sau khi hóa rắn.

 

1.2.5 Phương pháp so màu hóa học để phát hiện hàm lượng MDA và SOD trong mô vùng đồi thị

Sau khi các mô vùng đồi thị của các nhóm thí nghiệm khác nhau được đồng nhất hóa, chúng được ly tâm ở mức 1000 g trong 20 phút và phần nổi của mỗi nhóm thử nghiệm được thu thập. Theo hướng dẫn của bộ dụng cụ, bộ dụng cụ xét nghiệm MDA và SOD đã được sử dụng để phát hiện nội dung của MDA và SOD trong mỗi nhóm các mẫu thử nghiệm.

 

1.2.6 Protein miễn dịch để phát hiện biểu hiện cụ thể của protein KEAP1, NRF 2 và HO -1

Các mô hải mã của mỗi nhóm được thêm vào với bộ đệm ly giải và ly tâm ở mức 12, 000 r · min -1 trong 15 phút. Chất nổi trên mặt được thu thập để sử dụng chờ. Nồng độ protein được xác định bằng phương pháp BCA. Theo kết quả định lượng protein, khối lượng tương ứng của tổng số protein đã được thêm và nạp với điện di gel protein. Các mẫu được biến tính ở 95 độ trong 10 phút, được chuyển vào màng, cắt và chặn trong dung dịch chặn trong 1 giờ. Các kháng thể chính bị pha loãng Keap1, Nrf 2, Ho -1 và GAPDH (1: 500) đã được thêm vào, phản ứng qua đêm ở 4 độ, được rửa bằng 1 × TBST, được ủ với các kháng thể thứ cấp (1: 4000) và rửa bằng 1 × TBST.

 

1.3 Phân tích thống kê

Dữ liệu đếm được biểu thị dưới dạng độ lệch chuẩn trung bình ±. Dữ liệu phù hợp với phân phối bình thường và tính đồng nhất của phương sai đã được kiểm tra t, dữ liệu phù hợp với phân phối bình thường và phương sai không đồng đều đã được kiểm tra t đã sửa; Dữ liệu không phù hợp với phân phối bình thường đã được kiểm tra không tham số. ANOVA một chiều đã được sử dụng để so sánh sự khác biệt giữa các nhóm khác nhau và sau đó phương pháp LSD được sử dụng để so sánh hai nhóm. P <0. 05 được coi là có ý nghĩa thống kê.

 

2 Kết quả

2.1 Ảnh hưởng của sa mạc cistanche đến cấu trúc hình thái của vùng CA1 ở vùng đồi thị trong các con chuột mô hình PD, anh ta nhuộm cho thấy các tế bào thần kinh ở vùng CA1 của vùng đồi thị của chuột trống được sắp xếp gọn gàng và chặt chẽ, với sự phân bố hình thái thường xuyên và không có sự phân bố tế bào thần kinh rõ ràng; Các tế bào tế bào thần kinh trong nhóm mô hình được sắp xếp vô trật tự hơn, các hạt nhân tế bào bị thu hẹp, nhuộm hạt nhân đã được sâu hơn và tổn thương tế bào thần kinh là rõ ràng; Các tế bào thần kinh trong nhóm sa mạc cistanche được sắp xếp thường xuyên hơn so với các tế bào trong nhóm mô hình, số lượng ngưng tụ hạt nhân tương đối giảm và tổn thương tế bào thần kinh đã được giảm bớt. Các kết quả được hiển thị trong Hình 1.

 

 

Hình 1 Ảnh hưởng của sa mạc Cistanche đối với cấu trúc bệnh lý ở khu vực Ca1 của đồi hải mã ở chuột Parkinson (HE, × 400) Lưu ý: A: Nhóm kiểm soát; B: Nhóm mô hình; C: Nhóm Cistanche. Mũi tên đen cho thấy các tế bào thần kinh bị hư hỏng.

 

2.2 Ảnh hưởng của sa mạc Cistanche đối với cơ sở hạ tầng của tế bào thần kinh vùng đồi thị ở chuột mô hình PD

Trong nhóm trống, khi quan sát các tế bào thần kinh vùng đồi thị, có thể quan sát thấy rằng cấu trúc tế bào duy trì một hình thái rõ ràng, nhân thể hiện hình dạng tròn hoặc hình bầu dục thông thường, màng hạt nhân vẫn mịn và nguyên vẹn, và chromatin trong hạt nhân được phân bố đều, và không có sự phân bổ cạnh của hạt nhân. Ngược lại, các tế bào thần kinh vùng đồi thị của nhóm mô hình cho thấy những thay đổi rõ ràng: mật độ electron tổng thể của các tế bào tăng lên, hạt nhân ngưng tụ, chromatin trong hạt nhân được tổng hợp và gắn vào đáy màng hạt nhân, màng hạt nhân dày lên và không nhìn thấy trong màng tế bào. Sau khi can thiệp bằng sa mạc cistanche, so với nhóm mô hình, các tế bào thần kinh vùng đồi thị của nhóm sa mạc cistanche cho thấy một xu hướng phục hồi nhất định: kích thước của cơ thể tế bào thần kinh Không bào trong tế bào chất giảm, chỉ ra rằng sa mạc cistanche có tác dụng bảo vệ hoặc sửa chữa nhất định trên các tế bào thần kinh. Xem Hình 2.

 

Hình 2 Ảnh hưởng của sa mạc Cistanche đối với cơ sở hạ tầng tế bào thần kinh ở vùng đồi thị của chuột mắc bệnh Parkinson (× 7000) Lưu ý: A: Nhóm kiểm soát; B: Nhóm mô hình; C: Nhóm Cistanche.

 

2

Kết quả nhuộm NISSL cho thấy các tế bào thần kinh trong nhóm trống được sắp xếp chặt chẽ, với hình thái thường xuyên, cơ thể Nissl phong phú và nhuộm màu tối; Các tế bào thần kinh trong nhóm mô hình được sắp xếp lỏng lẻo, sưng và hầu hết các cơ thể NISSL đều bị hòa tan và nhuộm màu nhẹ; Các tế bào thần kinh trong nhóm sa mạc Cistanche đã được sắp xếp chặt chẽ, với hình thái thường xuyên, và số lượng và nhuộm của các cơ thể NISSL đã được cải thiện so với nhóm mô hình. Các kết quả được hiển thị trong Hình 3.

 

Hình 3 Ảnh hưởng của sa mạc Cistanche đối với cơ thể của các tế bào thần kinh vùng đồi thị của Nissl trong chuột mắc bệnh Parkinson (NISSL, × 200) Lưu ý: A: nhóm kiểm soát; B: Nhóm mô hình; C: Nhóm Cistanche.

 

2.4 Ảnh hưởng của sa mạc Cistanche đối với hàm lượng SOD và MDA ở vùng đồi thị của chuột mắc bệnh Parkinson

 

So với nhóm trống, hàm lượng SOD ở vùng đồi thị của nhóm mô hình giảm, trong khi hàm lượng MDA tăng lên; So với nhóm mô hình, hàm lượng SOD ở vùng đồi thị của nhóm sa mạc Cistanche tăng lên, trong khi hàm lượng MDA giảm. Xem Bảng 1.

 

Tab. 1 Tác dụng của sa mạc Cistanche đối với hàm lượng SOD và MDA ở vùng đồi thị của chuột mắc bệnh Parkinson

Nhóm	SOD (PG/ML)	MDA (PG/ML)
Điều khiển	12.36±2.75	2.85±0.83
Người mẫu	2.75±0.83*	9.95±0.37*
Rhynchophylla	7.22±1.32#	5.16±1.75#

Lưu ý: so với nhóm kiểm soát, *p<0.05; compared with model group, #P<0.05.

 

2.5 Tác dụng của Cistanche sa mạc đối với biểu hiện của protein Keap1, NRF2 và Ho -1 ở vùng đồi thị của chuột Parkinson

Kết quả của các thí nghiệm Western blot cho thấy sự biểu hiện của protein Nrf2 và Ho -1 ở vùng đồi thị của chuột trong nhóm mô hình giảm, trong khi biểu hiện của protein KEAP1 tăng lên; So với nhóm mô hình, biểu hiện của protein Nrf2 và Ho -1 ở vùng đồi thị của chuột trong nhóm sa mạc cistanche tăng lên, trong khi biểu hiện của protein Keap1 giảm. Xem Hình 4 và Bảng 2.

Hình 4 Ảnh hưởng của Cistanche sa mạc đối với biểu hiện của Keap1, NRF2 và Ho -1 ở vùng đồi thị của chuột mắc bệnh Parkinson

Lưu ý: A: Nhóm kiểm soát; B: Nhóm mô hình; C: Nhóm Cistanche

 

 

Tab. 2 Ảnh hưởng của Cistanche sa mạc

 

Nhóm	Keapl	NRF2	Ho -1
Nhóm trống	0.16±0.05	0.38±0.07	0.33±0.05
Nhóm mô hình	0.85±0.23*	0.12±0.09*	0.11±0.02*
Nhóm tích cực	0.22±0.03#	0.86±0.06#	0.79±0.05#

 

Lưu ý: So với nhóm điều khiển, *p <{{0}}. 05; So với nhóm mô hình, #P <0,05.