Cistanche sa mạc polysacarit làm giảm bệnh thận đái tháo đường ở chuột bằng cách ảnh hưởng đến hệ thực vật đường ruột và ức chế con đường truyền tín hiệu 4/yếu tố hạt nhân giống như thụ thể Toll

Tóm tắt: Mục tiêu của nghiên cứu này là điều tra hiệu ứng cải thiện vàCơ chế tiềm năng của cistanche sa mạc polysacarit (CDP)TRÊNBệnh thận đái tháo đường (DN)ở chuột. Mô hình chuột DN được thành lập bằng chế độ ăn nhiều chất béo (HFD) kết hợp với tiêm streptozotocin trong phúc mạc (STZ). Ba mươi sáu chuột đực C57BL/6N được chia ngẫu nhiên thành sáu nhóm (n=6 mỗi con). Tất cả các nhóm được dùng bằng miệng với nước cất (đối chứng và mô hình), dapagliflozin hoặc CDP trong 4 tuần. Những thay đổi trong các chỉ số sinh lý, chức năng thận,các yếu tố viêmvà microbiota ruột đã được đánh giá. Kết quả cho thấy CDP đã cải thiện đáng kể tình trạng chung và làm suy giảmThay đổi mô bệnh học thận, Vàgiảm mức đường huyết, Protein tiết niệuVàcác yếu tố viêmở chuột DN. Ngoài ra, CDP ảnh hưởng đến sự cân bằng của microbiota đường ruột, làm tăng sự phong phú của vi khuẩn có lợi và giảm vi khuẩn gây bệnh tiềm năng, từ đó cải thiện chức năng rào cản đường ruột. CDP cũng ức chế sự kích hoạt của con đường truyền tín hiệu 4/yếu tố hạt nhân giống như Toll (TLR4/NF-κB) và giảm giải phóng lipopolysacarit (LPS). Tóm lại, CDP thể hiện tác dụng cải thiện đối với DN ở chuột bằng cách ảnh hưởng đến hệ vi sinh vật đường ruột và ức chế các con đường truyền tín hiệu viêm. Phát hiện này cung cấp những hiểu biết mới về điều trị DN.

 

Từ khóa: Cistanche sa mạc polysacarit;Bệnh thận đái tháo đường; hàng rào ruột; hệ thực vật đường ruột; Thụ thể giống như số lượng 4; Yếu tố hạt nhân-κB

 

Chiết xuất cistanche sa mạc với nguyên liệu chất lượng cao

Bấm để có thêm chi tiết

 

 

 

Bệnh thận bệnh tiểu đường (DN)là nguyên nhân hàng đầu của bệnh thận giai đoạn cuối và đe dọa nghiêm trọng cuộc sống và sức khỏe của bệnh nhân [1]. Các nghiên cứu đã xác nhận rằng sự mất cân bằng hệ thực vật đường ruột đóng vai trò gây bệnh quan trọng trong quá trình bệnh tiểu đường phát triển thành DN [2-3]. Lý thuyết "Trục Gut-Kidney" tin rằng những thay đổi trong môi trường vi mô ruột có thể ảnh hưởng đến sự tiến triển của bệnh thận mãn tính bằng cách điều chỉnh trực tiếp các chất chuyển hóa của hệ thực vật ruột [2-3]. Hệ thực vật đường ruột đóng vai trò quan trọng trong việc điều chỉnh chức năng thận trong các mô hình chuột DN [4-5]. Nghiên cứu chuyên sâu về "Trục Gut-Kidney" sẽ giúp làm rõ cơ chế bệnh sinh của DN và khám phá các mục tiêu mới để phòng ngừa và điều trị.
Cistanche sa mạc là một loại cây thuốc truyền thống và có thể ăn được, còn được gọi là sa mạc cistanche, dijing, jinsun, v.v., thường được gọi là Dayun, và có tiếng là "nhân sâm sa mạc" [6]. Theo Pharmacopoeia của Cộng hòa Nhân dân Trung Hoa, sa mạc Cistanche là thân thịt khô với lá có vảy của Cistanche sa mạc YC MA hoặc C. tubulosa (Schenk) Wight, một loại cây thuộc chi Cistanche trong gia đình Orobanchaceae.
Trong số đó, Cistanche sa mạc có một lịch sử lâu dài được sử dụng làm cả thuốc và thực phẩm. Cistanche sa mạc là ngọt ngào, mặn và ấm trong tự nhiên và đi vào thận và các kinh tuyến ruột lớn. Nó có ảnh hưởng của việc làm săn chắc yang, có lợi cho bản chất và máu, và làm ẩm ruột và làm giảm táo bón [7-8]. Polysacarit là một trong những hoạt chất chính của sa mạc cistanche. Hàm lượng polysacarit trong chiết xuất nước sa mạc cistanche là tương đối cao. Nó chủ yếu bao gồm các monosacarit như glucose, galactose, rhamnose, arabinose và fructose. Nó có nhiều tác dụng dược lý như điều chỉnh hoạt động miễn dịch, chống lão hóa, cải thiện học tập và trí nhớ, bảo vệ các dây thần kinh, chống lại tổn thương gan, chống vi-rút và chống khối u [9-12]. Các nghiên cứu trước đây của nhóm nghiên cứu đã chỉ ra rằng chiết xuất nước sa mạc Cistanche có tác dụng điều trị tiềm năng đối với DN [13]. Dựa trên điều này, thí nghiệm này đã lấy hệ thực vật đường ruột và phản ứng viêm làm điểm khởi đầu để nghiên cứu ảnh hưởng của các polysacarit sa mạc Cistanche (CDP) đối với việc cải thiện DN ở chuột và phục hồi chức năng thận, để cung cấp cơ sở khoa học cho vai trò của CDP trong việc điều trị DN.

1 vật liệu và phương pháp

1.1 Động vật, Vật liệu và Thuốc thử

{{0 ara Độ phân giải đạo đức số: IACUC -20210331-04.
Sa mạc CDP (phân số khối polysacarit ＞ 80%, số lô: 2306019) Công ty Shaanxi Xintianyu; Dapagliflozin (DAPA; Số lô: 2108119) Công ty TNHH Dược phẩm AstraZeneca, Ltd .; tổng protein trong nước tiểu (tổng protein, UTP; số lô: c 035-2-1}), urê nitơ (máu nitơ, bun; số lô: c {{4}), creatinine (creatinine, cre; Viện sinh học Jiancheng Jiancheng; Lipopolysacarit (LPS; Số lô: yx -121619 m), interleukin -6 (IL -6; YX-E20217), Yếu tố hoại tử khối u- (TNF-; Số lô: YX-E20220) KIT SHANGHAI YOUXUAN BIOMITY Co., Ltd .; Công ty TNHH Công nghệ Gen Pulilai, Công ty TNHH Công ty TNHH Gen Pulilai, Công ty TNHH Công ty TNHH Công ty TNHH Gen Pulilai (Ltd; Streptozotocin (STZ; Số lô: 20230503), chế độ ăn nhiều chất béo (tỷ lệ chất béo 60% loại chất ăn uống tinh khiết, số nguyên liệu: Boaigang12492M) Bắc Kinh Boaigang Biotech Fechnology Co., Ltd.
Thức ăn cơ bản (chứa 22% bột ngô, 12% cám, dư lượng dầu 18%, 8% bột cá, bữa ăn đậu nành 12%, 0. 17% muối, {{7}. 25% vitamin, {{9}. Đại học Y khoa Tân Cương.

 

1.2 Dụng cụ và Thiết bị

Cân bằng phân tích AE240, Mettler-Toledo Cụ Công ty, Ltd., Thụy Sĩ; DHG -9053 Một lò sưởi ấm điện, Công ty TNHH Công cụ Khoa học Thượng Hải Yiheng, Ltd .; DK-S22 Tắm nước nhiệt độ không đổi, Công ty TNHH Thiết bị thí nghiệm Thượng Hải Jinghong, Ltd .; 3-18 KS ly tâm nhiệt độ thấp tốc độ cao, Sigmaaldrich, Hoa Kỳ; BS -380 Phân tích sinh hóa tự động hoàn toàn, Công ty TNHH Điện tử Biomedical Thâm Quyến, Ltd .; Máy cắt EM KMR3, Máy cắt HI1220, Kính hiển vi kỹ thuật số Leitz Optilux, Leica, Đức; Hệ thống hình ảnh phát quang fluorchem E, ProteinSimple, Hoa Kỳ.

1.3 Phương pháp

1.3.1 Thí nghiệm động vật

36 C57BL/6J Chuột đực được cho ăn trong phòng thí nghiệm SPF của Đại học Y khoa Tân Cương và được cho ăn tự do. Thí nghiệm được thực hiện sau 7 ngày cho ăn thích nghi. Sáu con chuột được chọn ngẫu nhiên là nhóm (đối chứng) bình thường và đưa ra chế độ ăn kiêng cơ bản. Phần còn lại của các nhóm thí nghiệm được cho ăn một chế độ ăn nhiều chất béo và được giữ trong các lồng riêng biệt. Trọng lượng cơ thể đã được kiểm tra mỗi tuần một lần. Những con chuột được tự do ăn và uống nước. Sau 6 tuần cho ăn chế độ ăn nhiều chất béo, chuột thử nghiệm đã được tiêm STZ 4 0 mg/kg trong màng bụng trong 5 ngày liên tiếp ngoài chế độ ăn nhiều chất béo miễn phí mỗi ngày. Đường huyết lúc đói sau khi mô hình hóa là 11,1 mmol/L, được coi là một mô hình bệnh tiểu đường thành công. Ba mươi con chuột có mô hình thành công được chia ngẫu nhiên thành năm nhóm, với sáu con chuột trong mỗi nhóm, cụ thể là mô hình (nước cất CDP liều cao (200 mg/kg + chế độ ăn nhiều chất béo, CDPS-H). Nhóm đối chứng (nước cất + chế độ ăn bình thường) được cho một lượng nước cất bằng nhau. Mỗi con chuột được điều trị ở mức 0,1 ml/10 g, mỗi ngày một lần tại cùng một lúc, trong tổng số 4 tuần. Trọng lượng cơ thể và thay đổi đường huyết của chuột được ghi nhận hàng tuần.

1.3.2 Xác định chỉ số

Sau 4 tuần quản lý Gavage, các mẫu nước tiểu (24 giờ) và phân tươi được thu thập thông qua các lồng trao đổi chất vào cuối tuần thứ 4 và được lưu trữ ở mức -20 và -80 độ, tương ứng. Những con chuột được nhịn ăn nhưng không được tưới trong 12 giờ. Ngày hôm sau, trọng lượng cơ thể nhịn ăn của chuột được đo. Những con chuột được gây mê bằng cách tiêm trong màng bụng 3 ml/kg dung dịch hydrat chloral 10%. Máu được thu thập từ quỹ đạo và ly tâm trong máy ly tâm (4 độ, 3 500 r/phút) trong 15 phút. Chất nổi trên mặt được hút, đóng gói và được lưu trữ trong tủ lạnh -80 để sử dụng sau. Huyết thanh được đo cho BUN, CRE, UA, IL -6, IL -1, TGF-, TNF- và LPS theo bộ. Nước tiểu được đo trong 24 giờ UTP theo bộ dụng cụ.

 

1.3.3 Quan sát hình thái và bệnh lý của thận và ruột

1.3.3.1 Xác định hệ số thận

Sau khi lấy máu, chuột được gây mê cho đến chết vì quá liều, và thận và đại phân đã được loại bỏ hoàn toàn và ngay lập tức được rửa sạch bằng nước muối làm mát trước, thoát nước trên giấy lọc và cân. Hệ số thận được tính toán theo công thức sau: Hệ số thận/%= × 100 m1m, trong đó M1 là trọng lượng ướt của thận/g; m là trọng lượng cơ thể của chuột/g.

 

1.3.3.2 Quan sát bệnh lý của thận

Thận chuột được cố định trong độ cố định 4% paraformaldehyd, bị mất nước bởi độ dốc dung dịch ethanol, trong suốt bằng xylene, được nhúng vào parafin, cắt lát (độ dày 2 μm) niêm phong, và hình ảnh được thu thập và quan sát dưới kính hiển vi.

 

1.3.3.3 Quan sát bệnh lý đường ruột

Ruột chuột được cố định với độ cố định 4% paraformaldehyd, bị mất nước bằng gradient dung dịch ethanol, trong suốt với xylen, được nhúng trong parafin, cắt lát (độ dày 2 m)

 

 

1.3.4 Phân tích thành phần hệ thực vật đường ruột

Nội dung đại tràng của chuột trong nhóm đối chứng, nhóm mô hình và nhóm CDPS-H đã được phát hiện bằng trình tự thông lượng cao của gen 16S rRNA. Việc khai thác DNA và xây dựng thư viện và giải trình tự vi sinh vật trong hàm lượng đại tràng đã được hoàn thành bởi Lianchuan Biotech Co., Ltd., và dữ liệu thu được được phân tích trên nền tảng đám mây Lianchuan.

 

1.3.5 Phát hiện biểu hiện protein liên quan đến thận và đại tràng

Các protein mô thận và mô đại tràng được chiết xuất, và protein được định lượng bằng phương pháp định lượng protein axit bicinchoninic. Sau khi biến tính protein, protein được lưu trữ trong tủ lạnh -20. 10% natri dodecyl sulfate-polyacrylamide điện di gel, chuyển màng polyvinylidene Difluoride, màng được đặt trong dung dịch đệm được đệm Tris với tween -20 (TBST), và bị chặn ở nhiệt độ phòng. Phát hiện
Các kháng thể chính của các thụ thể giống như Toll (TLR) 4, yếu tố phiên mã hạt nhân (NF) -κB p65, P-NF-κBP65 và -actin trong mô thận (kháng thể pha loãng 1: {9}} (v/v) . Pha loãng TBST, kháng thể thứ cấp (kháng thể
Pha loãng với dung dịch TBST 1∶ 2 000 (v/v)), được ủ ở nhiệt độ phòng trong 1 giờ, rửa bằng TBST 3 lần, sau đó được phát hiện bằng cách thêm thuốc thử phát quang ECL và hình ảnh gel được sử dụng để phát hiện biểu hiện protein. -actin được sử dụng làm tài liệu tham khảo nội bộ và giá trị màu xám protein được phân tích bằng phần mềm ImageJ. Biểu hiện protein của mỗi nhóm được biểu thị bằng giá trị tương đối của giá trị xám của nhóm đối chứng.

 

1.4 Thống kê dữ liệu

Tất cả các kết quả dữ liệu được biểu thị là ± S và SPSS 21. 0 đã được sử dụng để phân tích thống kê. Đối với dữ liệu liên tục, nếu họ tuân theo phân phối bình thường, phân tích phương sai một chiều đã được sử dụng để so sánh giữa các nhóm. Nếu sự khác biệt giữa các nhóm có ý nghĩa thống kê, phương pháp Thổ Nhĩ Kỳ được sử dụng thêm để so sánh theo cặp; Nếu dữ liệu theo phân phối bình thường, thử nghiệm Kruskal-Wallis H đã được sử dụng để so sánh giữa các nhóm. Khi có sự khác biệt thống kê giữa các nhóm, phương pháp khác biệt ít nhất của Durbin được sử dụng thêm cho nhiều so sánh. P <0. 05 chỉ ra rằng sự khác biệt có ý nghĩa thống kê.

 

 

2 Kết quả và phân tích

2.1 Ảnh hưởng của CDP đến đường huyết, trọng lượng cơ thể và hệ số thận của C57BL/6J

Như có thể thấy từ Bảng 1 đến 3, so với nhóm đối chứng, đường huyết lúc đói của chuột trong nhóm mô hình đã tăng đáng kể (P<0.01), and the kidney coefficient was significantly increased (P<0.01); compared with the Model group, CDPs- The body weight of mice in group H increased significantly after 4 weeks of administration (P＜0.05), and blood sugar began to decrease after 3 weeks of administration (P＜0.05). The kidney coefficient of mice in each intervention group decreased, and the CDPs-H group was the lowest (P<0.01); the body weight of mice in the Control group was larger than that of each group, indicating that CDPs can slow down the swelling of the kidneys of DN mice, thereby Reduce the kidney coefficient.

 

Bảng 1 Ảnh hưởng của CDP lên đường huyết của chuột (N=6))

Nhóm	Thời gian/tuần
	0	1	2	3	4
Điều khiển	7.98±0.55	7.32±0.40	7.58±0.50	7.38±0.87	7.28±0.34
Người mẫu	10.62±2.79#	20.32±2.69#	24.47±4.18#	24.92±3.98#	20.33±2.96#
CDPS-L	16.03±2.97	21.83±4.81	20.13±6.97	23.30±3.77	21.25±1.65
CDPS-M	13.17±3.59	22.6±5.88	19.35±4.45	22.6±4.87	18.38±1.20
CDP-H	11.07±1.74	21.53±3.71	21.57±6.19	17.43±2.05**	15.87±0.90**
Dapa	10.28±4.75	21.12±4.96	17.72±2.00**	17.35±2.00**	14.55±1.06**

Đơn vị: MMOL/L.

 

Bảng 2 Ảnh hưởng của CDP trên chỉ số của chuột (N=6))

 

Nhóm	Điều khiển	Người mẫu	CDPS-L	CDPS-M	CDP-H	Dapa
Thận/cơ thể %	0.98±0.04	1.69±0.17##	1.42±0.12	1.37±0.10*	1.28±0.10**	1.18±0.10**

 

Bảng 3 Ảnh hưởng của CDP trên khối lượng cơ thể của chuột (N=6))

 

Nhóm	Thời gian/tuần
	0	1	2	3	4
Điều khiển	28.57±0.82	28.75±0.97	28.70±0.79	29.10±1.24	29.32±1.35
Người mẫu	24.53±1.25##	24.92±1.20##	24.35±1.39##	24.82±1.22##	24.73±1.56##
CDPS-L	25.75±0.69	24.77±0.91	24.83±0.99	25.10±0.83	25.42±0.97
CDPS-M	25.10±0.56	25.00±0.54	24.68±0.48	25.13±0.62	25.25±0.58
CDP-H	25.38±0.28	25.43±0.49	25.52±0.62	25.73±0.50	26.08±0.34*
Dapa	25.13±1.02	25.52±0.98	25.97±1.00*	26.25±0.63*	26.63±0.78*

 

 

2.2 Ảnh hưởng của CDP đến chức năng thận của chuột C57BL/6J

Như thể hiện trong Bảng 4, so với nhóm đối chứng, nồng độ BUN, CRE và UA trong huyết thanh và nồng độ khối u UTP 24 giờ ở nước tiểu của chuột trong nhóm mô hình tăng lên đáng kể (P<0.01); compared with the Model group, CDPs-M and CDPs-H can significantly reduce the concentrations of BUN, Cre, and UA in serum and the 24-hour UTP mass concentration in urine (P＜0.05, P＜0.01). CDPs-L can significantly reduce the concentrations of BUN and UA in mouse serum. and 24 h UTP mass concentration in urine (P＜0.05, P＜0.01).

 

Bảng 4 Ảnh hưởng của CDP trên BUN, CRE, UA và 24 giờ UTP ở chuột DN (N=6))

Nhóm	Nồng độ BUN (MMOL/L)	Nồng độ CRE (μmol/L)	Nồng độ hàm lượng UTP 24H (Mg/ML)	Nồng độ UA (μmmol/L)
Điều khiển	47.51±7.32	12.80±1.36	1.32±0.12	103.9±18.59
Người mẫu	157.97±30.57##	44.85±4.36##	2.38±0.37##	500.43±81.06##
CDPS-L	112.70±16.76*	40.72±3.62	1.37±0.12**	264.07±14.85**
CDPS-M	82.31±14.68**	35.37±6.21*	1.06±0.17**	247.62±11.22**
CDP-H	64.58±8.64**	30.00±2.87**	0.65±0.17**	222.71±37.52**
Dapa	76.98±10.47**	28.82±3.72**	0.37±0.10**	129.87±17.69**

 

 

2.3 Ảnh hưởng của CDP đến các yếu tố viêm và nồng độ khối lượng LPS trong huyết thanh của chuột C57BL/6J

 

Như thể hiện trong Bảng 5, so với nhóm điều khiển, nồng độ TNF-, IL -1, IL {3}}, TGF- và LPS ở chuột trong nhóm mô hình tăng đáng kể (P P<0.01); compared with the Model group, Each dose of CDPs can reduce the levels of TNF-α, IL-1β, IL-6, TGF-β and LPS in serum, CDPs-M
Ảnh hưởng của nhóm CDPS-H là đáng kể (p 0.

Bảng 5 Ảnh hưởng của CDP đến các yếu tố viêm và LPS ở chuột (N=6))

 

Nhóm	Nồng độ khối lượng (PG/mL)
	Tnf-	Il -1	Il -6	TGF-	LPS
Điều khiển	111.23±5.47	125.85±11.41	112.27±10.28	152.25±7.28	116.17±15.07
Người mẫu	167.90±16.91##	184.53±21.03##	195.57±31.88##	209.36±16.17##	173.51±15.72##
CDPS-L	144.57±10.15*	160.46±11.84*	169.10±20.32	189.03±8.02*	151.41±9.40*
CDPS-M	133.62±13.24**	154.30±17.39*	150.47±19.28*	171.25±14.35**	135.33±23.92**
CDP-H	119.30±7.31**	140.54±16.11**	127.12±10.94**	169.47±10.57**	124.98±16.38**
Dapa	114.79±10.48**	135.17±14.37**	120.90±9.32**	159.11±10.92**	113.34±13.14**

 

 

2.4 Ảnh hưởng của CDP đến bệnh lý thận của chuột C57BL/6J

Như được hiển thị trong Hình 1, sau khi nhuộm H & E, người ta thấy rằng cấu trúc cầu thận và hình thái của chuột trong nhóm đối chứng là bình thường và rõ ràng, màng đáy được trơn tru, hình thái cầu thận là thường xuyên, các tế bào xen kẽ là bình thường, các ống thận được sắp xếp gọn gàng. So với nhóm đối chứng, thể tích cầu thận của chuột trong nhóm mô hình đã được mở rộng, màng tầng hầm được làm dày, các tế bào viêm bị xâm nhập xung quanh nó, và các ống thận bị rối loạn và giãn ra; So với nhóm mô hình, các nhóm quản trị CDP có mức độ cải thiện khác nhau trên thận chuột. Thể tích cầu thận của chuột trong các nhóm CDPS-M và CDPS-H đã giảm đáng kể, độ dày của màng đáy đã giảm, chỉ một lượng nhỏ các tế bào viêm bị xâm nhập và các ống thận được phục hồi đáng kể và được sắp xếp chặt chẽ. Sau 4 tuần can thiệp CDP, các điều kiện bệnh lý ở trên đều được khôi phục ở các mức độ khác nhau.

Nhuộm Masson cho thấy các ống thận của chuột trong nhóm đối chứng được sắp xếp bình thường và cầu thận ở trong hình dạng bình thường, không có sự tăng sinh sợi collagen nào được quan sát và màng đáy hình ống có thể nhìn thấy; Một lượng lớn collagen nhuộm màu đã được quan sát thấy trong mô kẽ thận của chuột trong nhóm mô hình, và mô sợi kẽ được bó và tăng sinh reticular; Thể tích cầu thận của chuột trong nhóm CDPS-M đã giảm và các triệu chứng tăng sinh mô sợi được giảm bớt; Các ống thận của chuột trong nhóm CDPS-H được sắp xếp thường xuyên hơn và một lượng nhỏ tăng sinh sợi collagen đã được quan sát.

Kết quả nhuộm PAS cho thấy cầu thận của chuột trong nhóm đối chứng là bình thường về thể tích và cấu trúc nguyên vẹn; Những con chuột trong nhóm mô hình bị tổn thương thận, thể tích cầu thận lớn hơn bình thường và hình dạng không đều, và ma trận trung mô đã được lắng đọng; So với nhóm mô hình, tổn thương thận của chuột trong mỗi nhóm được điều trị bằng thuốc đã được giảm bớt, và với sự gia tăng của liều, hình dạng cầu thận và kích thước có xu hướng bình thường, và mức độ lắng đọng ma trận bị giảm. Kết quả cho thấy CDP có thể giảm bớt tổn thương mô thận ở chuột DN.

 

Hình.