Cistanche Tubulosa Phenylethanoid Glycosides gây ra quá trình chết rụng ở tế bào Eca ‑ 109 Qua con đường phụ thuộc vào ty thể
Mar 06, 2022
Liên hệ: Audrey Hu Whatsapp / hp: 0086 13880143964 Email:audrey.hu@wecistanche.com
CHANGSHUANG FU, JINYU LI, ADILA AIPIRE, LIJIE XIA, YI YANG, QIUYAN CHEN, JIE LV, XINHUI WANG và JINYAO LI
trừu tượng
Cistanche tubulosacó các chức năng sinh học khác nhau. Trong nghiên cứu này, tác dụng chống khối u của các glycoside phenylethanoid hòa tan trong nước của C. tubulosa (CTPG-W) đối với bệnh ung thư thực quản đã được khảo sát. Tế bào Eca -109 được xử lý bằng CTPG-W và khả năng sống sót của tế bào được đo bằng xét nghiệm MTT. Quá trình apoptosis, chu kỳ tế bào, điện thế màng ty thể (Δψm) và các loại oxy phản ứng được phân tích bằng phép đo tế bào dòng chảy. Mức độ protein trong các con đường apoptotic được phát hiện bằng phân tích Western blot. Người ta xác định rằng CTPG ‑ W làm giảm đáng kể khả năng tồn tại của tế bào Eca -109 thông qua cảm ứng quá trình apoptosis và bắt giữ chu kỳ tế bào. Sau khi điều trị bằng CTPG-W, Δψm của Eca -109 đã giảm đáng kể, có liên quan đến mức độ điều chỉnh của ung thư hạch tế bào B -2 (Bcl -2) - mức X liên quan và mức độ điều hòa giảm của Bcl -2. Do đó, mức độ cytochrome c và c-Jun NH 2- terminal kinase được tăng lên, điều này điều chỉnh mức độ polymerase-poly (ADP-ribose) bị phân cắt và caspase bị phân cắt -3, {{18} } và -9, nhưng không phải caspase -8. Tương ứng, mức độ của các loại oxy phản ứng trong các tế bào Eca -109 đã cho thấy những thay đổi đáng chú ý. Những kết quả này chỉ ra rằng CTPG-W đã gây ra quá trình chết rụng của tế bào Eca -109 thông qua con đường phụ thuộc vào ty thể.
Giới thiệu
Ung thư thực quản là một trong những loại ung thư phổ biến nhất với tỷ lệ mắc bệnh cao thứ 11 và tỷ lệ tử vong cao thứ 6 trên toàn cầu và gây ra ~ 439, 000 ca tử vong vào năm 2015 (1). Tỷ lệ mắc ung thư thực quản thay đổi đáng kể giữa các khu vực khác nhau, với Đông Á, Đông và Nam Phi có tỷ lệ mắc cao nhất và Tây Phi có tỷ lệ thấp nhất vào năm 2012 (1,2). Tại Trung Quốc, số ca tử vong và tử vong do ung thư thực quản ước tính lần lượt là 477, 000 và 375, 000 vào năm 2015 (3). Mặc dù tỷ lệ mắc ung thư thực quản đã giảm ở các nước có chỉ số xã hội học trung bình và trung bình cao từ năm 2005 đến năm 2015, tỷ lệ tử vong vẫn cao do tiên lượng xấu (1,4). Sự kết hợp giữa phẫu thuật cắt bỏ với hóa trị hoặc xạ trị đã được sử dụng để điều trị ung thư thực quản, tuy nhiên, có báo cáo rằng từ năm 2003 đến năm 2014, tỷ lệ sống sót 5- năm vẫn<20% in="" china,="" the="" usa,="" and="" europe="" (4,5).="" for="" these="" reasons,="" it="" is="" urgent="" to="" develop="" novel="" therapeutic="" agents="" to="" treat="" esophageal="">
Thuốc thảo dược cổ truyền Trung Quốc (CHM) đã được sử dụng để điều trị các loại ung thư khác nhau, bao gồm ung thư phổi không phải tế bào nhỏ (6), ung thư đại trực tràng (7), ung thư biểu mô tế bào gan (8). Gần đây, các thử nghiệm lâm sàng báo cáo rằng sự kết hợp CHM với hóa trị hoặc xạ trị không chỉ chứng minh một số lợi ích về chất lượng cuộc sống và giảm bớt các tác dụng phụ do hóa trị hoặc xạ trị gây ra (9,10), mà còn cải thiện tỷ lệ sống sót của bệnh nhân. bị ung thư phổi, gan, dạ dày, đại trực tràng, vòm họng hoặc cổ tử cung không phải tế bào nhỏ (9). Tuy nhiên, có bằng chứng mâu thuẫn về hiệu quả của điều trị CHM đối với ung thư thực quản (10,11). Nhiều nghiên cứu xác định rằng một số loại thuốc hoặc thành phần thảo dược có thể ức chế sự phát triển của tế bào ung thư thực quản in vitro và in vivo, bao gồm Andrographis paniculata (12,13), Daikenchuto (14), icariin (15), Rosa Roxburghii Tratt và Fagopyrum Cymosum (16), Jaridonin (17), Marsdenia tenacissima (18), OP16 (một ent-kaurene diterpenoid mới) (19), Qigesan (20) và nước sắc Tonglian (21). Cistanche là một loại CHM và có các chức năng sinh học khác nhau, bao gồm chống oxy hóa, chống viêm và bảo vệ thần kinh (22,23). Nghiên cứu trước đây của chúng tôi đã chứng minh rằngCistanche tubulosa phenylethanoid glycoside(CTPG) có thể ngăn chặn sự phát triển của tế bào ung thư hắc tố B 16- F10 trong ống nghiệm và in vivo (24). Tuy nhiên, khả năng hòa tan trong nước kém của CTPG được sử dụng trước đây đã hạn chế sự phát triển của thuốc (24). Do đó, CTPG hòa tan trong nước (CTPG-W) đã được sử dụng và tác dụng chống khối u trên tế bào ung thư thực quản (Eca -109) đã được nghiên cứu. Người ta xác định rằng CTPG-W có thể ức chế khả năng tồn tại của tế bào Eca -109 một cách phụ thuộc vào liều lượng thông qua việc cảm ứng quá trình apoptosis thông qua con đường phụ thuộc vào ty thể.
Vật liệu và phương pháp Động vật.
Chuột cái C57BL / 6 (6-8 tuần, ~ 25 g) được mua từ Trung tâm Nghiên cứu Động vật Phòng thí nghiệm Bắc Kinh (Bắc Kinh, Trung Quốc) và được nuôi trong nhiệt độ được kiểm soát (25˚C), ánh sáng theo chu kỳ (12 / 12) Cơ sở Động vật của Đại học Tân Cương (Urumqi, Trung Quốc). Tất cả các động vật đều nhận được nước và thức ăn không có mầm bệnh.
Dòng tế bào và nuôi cấy. Dòng tế bào ung thư biểu mô thực quản ở người (Eca -109) được Phòng thí nghiệm Trọng điểm về Tài nguyên Sinh vật và Kỹ thuật Di truyền Tân Cương (Trường Cao đẳng Khoa học Đời sống và Công nghệ, Đại học Tân Cương, Urumqi, Trung Quốc) bảo tồn và được nuôi cấy trong RPMI {{1} } môi trường (Gibco; Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA) bổ sung 10% huyết thanh bò thai bất hoạt nhiệt (FBS; MRC, EN MOASAI Biological Technology Co., Ltd, Jiangsu, China), 1% L -glutamine (100 mM), 100 U / ml penicillin và 100 µg / ml streptomycin ở 37 ° C trong môi trường ẩm có chứa 5% CO2.
Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). CTPG-W (cat. No. SGJG2 0 170410) được mua từ Shanghai Upbio Tech Co., Ltd. (Thượng Hải, Trung Quốc). Các hợp chất chính của CTPG đã đủ tiêu chuẩn và định lượng bằng HPLC theo nghiên cứu trước đây của chúng tôi (24). Một cách ngắn gọn, HPLC được tiến hành trên Cột ZORBAX SB ‑ C18 (250x4,6 mm; 5 µm) ở 30˚C và rửa giải bằng dung dịch axit formic 0,2% và gradient metanol bắt đầu từ 23%, cứ sau 1 ml được thêm vào mỗi phút trong 45 phút cho đến khi đạt 31 phần trăm. Tổng cộng 10 µl mẫu đã được tiêm và phát hiện ở bước sóng 330. Tiêu chuẩn echinacoside được mua từ Shanghai Baoban Biotech Co., Ltd. (Thượng Hải, Trung Quốc) và tiêu chuẩn acteoside được mua từ Sigma-Aldrich (Merck KGaA, Darmstadt, Đức). Các tiêu chuẩn được sử dụng để phân tích các thành phần của CTPG-W.
Thử nghiệm MTT. Sự tăng sinh tế bào được đo bằng xét nghiệm MTT. Tế bào Eca {{0}} được cấy vào 96- đĩa giếng với mật độ 5x1 0 3 ô trong 1 0 0 µl RPMI {{5 }} môi trường / giếng và được nuôi cấy ở 37˚C trong 24 giờ, sau đó được xử lý bằng các nồng độ khác nhau (0, 200, 400, 600 và 800 µg / ml) CTPG-W hoặc 0,4 phần trăm dimethyl sulfoxide (DMSO) trong 24, 48 và 72 giờ. DMSO được sử dụng làm chất kiểm soát dung môi (800 µg / ml CTPG-W chứa 0,4% DMSO). Cisplatin (20 µg / ml) được sử dụng làm đối chứng tích cực. Sau đó, phần nổi phía trên được loại bỏ sau khi ly tâm ở 225 xg trong 5 phút ở nhiệt độ phòng và dung dịch MTT 100 µl (0,5 mg / ml trong môi trường RPMI -1640 không có FBS) được thêm vào mỗi giếng và ủ ở 37˚C trong 3 giờ. Các tinh thể formazan được tạo thành được hòa tan trong 200 µl DMSO. Các giá trị mật độ quang học (OD) được đo ở bước sóng 490 nm bằng 96- đầu đọc vi tấm (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, Hoa Kỳ). Khả năng sống sót của tế bào tương đối được tính theo công thức: Khả năng sống sót của tế bào (phần trăm)=(ODtrape / ODunt Treatment) x100 phần trăm. Hình thái của tế bào Eca ‑ 109 được quan sát bằng kính hiển vi huỳnh quang ngược (độ phóng đại, x200) (Nikon Eclipse Ti ‑ E; Nikon Corporation, Tokyo, Japan).
Đối với sự gia tăng của các tế bào lách, chuột C57BL / 6 đã được gây tử vong do trật cổ tử cung, và các lá lách được phân lập. Hỗn dịch đơn bào được tạo ra và tế bào lách được cấy vào 96- đĩa giếng với mật độ 1x1 0 5 tế bào / giếng trong môi trường 100 µl RPMI -1640, sau đó được xử lý với các nồng độ khác nhau (0, 200, 400, 600 và 800 µg / ml) CTPG-W trong 24, 48 và 72 h ở 37˚C với 5% CO2. Sự tăng sinh của tế bào lách được đo bằng xét nghiệm MTT, theo quy trình đã nói ở trên. Chỉ số kích thích=không được điều trị / không được điều trị.
Đo lường quá trình chết rụng và chu kỳ tế bào. Tế bào Eca {{0}} được nuôi cấy trong đĩa 6 0 mm ở mật độ 2,5x1 0 5 tế bào / đĩa trong 24 giờ và được xử lý với các nồng độ khác nhau ({{31} }, 2 0 0, 400, 600 và 800 µg / ml) CTPG-W hoặc 0,4 phần trăm DMSO trong 24 giờ ở 37˚C với 5 phần trăm CO2. Các tế bào được thu thập và nhuộm bằng bộ kit phát hiện apoptosis Annexin V-fluorescein (FITC) / Propidium iodide (PI) (Shanghai Shengsheng Biotechnology Co., Ltd., Thượng Hải, Trung Quốc), theo quy trình của nhà sản xuất. Các mẫu được thu thập bằng phương pháp đo tế bào dòng chảy (BD FACSCalibur; BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA) và được phân tích bởi FlowJo 7.6 (Tree Star, Inc., Ashland, OR, USA). Để phân tích ảnh hưởng của CTPG-W đối với chu kỳ tế bào, tế bào 2,5x105 Eca -109 được cấy vào đĩa nuôi cấy 60 mm và được xử lý bằng CTPG-W (0, 100, 200 và 400 µg / ml) hoặc 0,4 phần trăm DMSO trong 24 giờ ở 37˚C với 5 phần trăm CO2. Tất cả các tế bào được thu hoạch và rửa hai lần bằng PBS lạnh đá (Gibco; Thermo Fisher Scientific, Inc.), sau đó được cố định trong 70% ethanol lạnh ở 4˚C trong 30 phút. Sau khi rửa hai lần bằng PBS lạnh đá, các tế bào được ngâm lại trong dung dịch đệm nhuộm 300 µl PI / RNase (BD Biosciences, San Jose, CA, USA) trong 10 phút ở nhiệt độ phòng. Sự phân bố chu kỳ tế bào được phân tích bằng phần mềm ModFit LT 3.0 bằng phương pháp đo tế bào dòng (BD FACSCalibur).
Phân tích điện thế màng ty thể (Δψm) và các loại oxy phản ứng (ROS). Để phân tích Δψm, các tế bào Eca {{0}} được xử lý bằng CTPG-W (0, 4 0 0, 600 và 800 µg / ml) hoặc 0,4 phần trăm DMSO cho 24 h ở 37˚C với 5% CO2 và được nhuộm bằng bộ xét nghiệm tiềm năng màng ty thể với JC -1 (Viện Công nghệ Sinh học Beyotime, Thượng Hải, Trung Quốc), theo quy trình của nhà sản xuất, trong 20 phút ở 37˚C . Sau khi rửa hai lần với đệm rửa JC -1 (Viện Công nghệ Sinh học Beyotime), các mẫu được trộn lại với đệm rửa 300 µl JC ‑ 1 và được phân tích bằng phương pháp đo tế bào dòng chảy (BD FACSCalibur). Sự phát huỳnh quang của thuốc nhuộm JC ‑ 1 trong tế bào Eca ‑ 109 cũng được quan sát bằng kính hiển vi huỳnh quang ngược (độ phóng đại, x200; Nikon Eclipse Ti ‑ E). Để phân tích ROS, các tế bào Eca -109 đã được xử lý bằng CTPG-W (0, 400, 600 và 800 µg / ml) trong 2, 4, 6, 12 và 24 giờ, và được nhuộm bằng các loại oxy phản ứng Bộ xét nghiệm (Viện Công nghệ Sinh học Beyotime), theo quy trình của nhà sản xuất, trong 20 phút ở 37˚C. Sau khi rửa ba lần bằng PBS nước đá, các mẫu được thu thập bằng phương pháp đo tế bào dòng chảy (BD FACSCalibur) và phân tích bằng phần mềm FlowJo 7.6.
Hoạt động thu gom gốc 2,2 ‑ diphenyl ‑ 1 ‑ picrylhydrazyl (DPPH). Hoạt tính thu gom gốc tự do của CTPG-W được xác định bằng xét nghiệm gốc tự do DPPH theo quy trình đã công bố với một sửa đổi nhỏ, vì metanol được thay thế bằng etanol để hòa tan DPPH (25,26). Đối với các phép đo ở trạng thái ổn định, 15 0 µl DPPH (1 0 0 mmol / l) trong etanol được trộn với các nồng độ CTPG-W khác nhau (25, 50, 75, 100, 250, 300, 400, 500 và 600 µg / ml) trong 50 µl PBS, và ủ trong bóng tối trong 30 phút ở nhiệt độ phòng. Độ hấp thụ ở bước sóng 517 nm được phát hiện khi có và không có CTPG-W. Tổng cộng 50 µl Vitamin C được sử dụng làm đối chứng tích cực. Hoạt động thu dọn gốc DPPH được tính toán bằng công thức: Thu dọn (phần trăm)=[1- (A sample-Ablank) / A0] x100, trong đó Ablank là độ hấp thụ của đối chứng (không có DPPH), A là độ hấp thụ của mẫu và A0 là độ hấp thụ của PBS với DPPH.
Phân tích Western blot. Tế bào Eca {{0}} được xử lý bằng CTPG-W (0, 200, 600 µg / ml) hoặc 0,4 phần trăm DMSO trong 24 giờ ở 37˚C với 5 phần trăm CO2. Lần rửa sau hai lần với PBS, các tế bào được ly giải trong dung dịch đệm lọc phân tích kết tủa phóng xạ (Beijing ComWin Biotech Co., Ltd., Bắc Kinh, Trung Quốc) trong 20 phút trên đá. Sau khi ly tâm ở 10, 000 xg trong 10 phút ở 4˚C, các chất nổi phía trên được thu thập và nồng độ protein được phát hiện bằng bộ dụng cụ axit bicinchoninic (Thermo Fisher Scientific, Inc.) theo quy trình của nhà sản xuất. Phân tích Western blot được thực hiện theo mô tả trước đây của chúng tôi (24). Các kháng thể chống lại caspase -7 (cat. No. D120077), caspase -8 (cat. No. D155240), caspase -9 (cat. No. D220078), B lymphoma { {24}} (Bcl -2) - liên kết X (Bax) (mèo. D220073) và Bcl -2 (mèo. D260117) và IgG-peroxidase củ cải ngựa (HRP) chống chuột ) (mèo. số D111050) và IgG-HRP chống thỏ (mèo. số D110058) đã được mua từ BBI Life Sciences (Thượng Hải, Trung Quốc). Các kháng thể chống lại caspase -3 (cat. No. E-AB -10050) và caspase hoạt động -3 (cat. No. E-AB -22115) đã được mua từ Elabscience ( Vũ Hán, Trung Quốc). Các kháng thể khác chống lại caspase -7 (cat. No. 9492), poly (ADP-ribose) polymerase (PARP) (cat. No. 9542), cytochrome c (cat. No. AC909), c-Jun NH { {48}} terminal kinase (JNK) (cat. No. 9252S) và -actin (cat. No. 58169) được lấy từ Cell Signaling Technology, Inc. (Danvers, MA, USA). Tất cả các kháng thể chính và phụ đều được pha loãng theo tỷ lệ 1: 1, 000. Các kháng thể chính được ủ ở 4oC qua đêm và các kháng thể thứ cấp được ủ ở 37oC trong 1 giờ.
Các protein mục tiêu được phát hiện bằng cách sử dụng một bộ xét nghiệm phát quang hóa học nâng cao (Viện Công nghệ Sinh học Beyotime), theo quy trình của nhà sản xuất.
Phân tích thống kê. Ý nghĩa thống kê được tính toán bằng cách phân tích một chiều phương sai với bài kiểm tra sau hoc môn của Tukey và kết quả được phân tích bằng phần mềm GraphPad Prism 5. 0 (GraphPad Software, La Jolla, CA, USA) giữa các nhóm điều trị và nhóm chứng. Tất cả dữ liệu được trình bày dưới dạng giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn. P<0.05 was="" considered="" to="" indicate="" a="" statistically="" significant="">
Cistanche tubulosa phenylethanoid glycoside(CTPG)
Kết quả
CTPG ‑ W ngăn chặn sự phát triển của tế bào Eca ‑ 109. Các thành phần của CTPG-W đã được xác định chất lượng và định lượng bằng HPLC (Hình 1), được so sánh với các tiêu chuẩn của echinacoside và acteoside. Theo thời gian lưu giữ đỉnh và diện tích đỉnh, CTPG-W chứa 39,16 phần trăm echinacoside và 2,44 phần trăm acteoside. Đầu tiên, ảnh hưởng của CTPG-W đến khả năng sống sót của tế bào Eca -109 được xác định bằng xét nghiệm MTT. CTPG-W được hòa tan trong DMSO ở 200 mg / ml và được pha loãng với môi trường RPMI -1640 có chứa 10 phần trăm FBS bất hoạt bằng nhiệt đến các nồng độ đã chỉ định. Tế bào Eca -109 được xử lý bằng CTPG-W và khả năng sống sót của tế bào được phân tích bằng xét nghiệm MTT tại các điểm thời gian được chỉ định. Điều trị CTPG ‑ W làm giảm đáng kể khả năng sống sót của tế bào Eca -109 theo cách phụ thuộc vào liều lượng và thời gian (P<0.001; fig.="" 2a).="" the="" morphology="" of="" eca-109="" cells="" was="" observed="" with="" an="" inverted="" fluorescence="" microscope="" (magnification,="" x200)="" following="" ctpg‑w="" treatment="" for="" 24="" h,="" which="" changed="" notably="" in="" a="" dose-dependent="" manner,="" with="" the="" cells="" shrinking="" and="" becoming="" round="" following="" ctpg-w="" treatment="" (fig.="" 2b).="" these="" results="" indicate="" that="" ctpg-w="" suppresses="" the="" growth="" of="" eca-109="" cells.="" the="" effect="" of="" ctpg-w="" on="" the="" proliferation="" of="" splenocytes="" was="" also="" detected="" with="" an="" mtt="" assay.="" ctpg-w="" significantly="" promoted="" the="" proliferation="" of="" splenocytes="" in="" a="" dose-dependent="" manner="" (fig.="" 2c),="" indicating="" that="" it="" has="" no="" cytotoxic="" effect="" on="">
CTPG ‑ W gây ra quá trình apoptosis ở tế bào Eca ‑ 109. Để điều tra xem CTPG-W có ngăn chặn sự phát triển của tế bào Eca -109 thông qua cảm ứng apoptosis hoặc hoại tử hay không, các tế bào được xử lý bằng các nồng độ CTPG-W khác nhau. Sau 24 giờ, tế bào Eca {5}} bị chết rụng và hoại tử được phát hiện bằng phương pháp nhuộm Annexin V / PI. Như được mô tả trong Hình 3A, các tế bào Annexin V- / PI plus được tạo thành tế bào hoại tử, và các tế bào Annexin V plus / PI plus và Annexin V plus / PI- được tạo thành tế bào apoptotic. CTPG-W chủ yếu gây ra quá trình tự chết của tế bào Eca -109 theo cách phụ thuộc vào liều lượng, mặc dù tế bào Eca {12}} bị hoại tử cũng tăng lên đáng kể khi điều trị 600 và 800 µg / ml CTPG-W (P<0.001 at="" 600="" µg/ml="" and=""><0.05 at="" 800="" µg/ml).="" consistently,="" the="" levels="" of="" pro-apoptotic="" bax="" and="" anti-apoptotic="" bcl-2="" in="" eca-109="" cells="" were="" upregulated="" and="" downregulated,="" respectively,="" upon="" ctpg-w="" treatment="" (fig.="" 3b).="" the="" results="" indicated="" that="" ctpg-w="" primarily="" inhibited="" the="" growth="" of="" eca-109="" cells="" through="" the="" induction="" of="">
CTPG ‑ W gây ra sự bắt giữ chu kỳ tế bào ở pha S trong Eca ‑ 1 0 9 tế bào. Sự xáo trộn của chu kỳ tế bào ung thư sẽ ngăn chặn sự phát triển của tế bào và thúc đẩy quá trình chết rụng (27). Sự phân bố của chu kỳ tế bào trong các tế bào Eca -109 được phát hiện khi nhuộm PI sau xử lý CTPG-W trong 24 giờ. Quan sát thấy rằng các tế bào trong pha S tăng lên và các tế bào trong pha G0 / G1 cho thấy sự giảm đáng kể tổng thể khi điều trị CTPG ‑ W (P<0.05; fig.="" 4),="" indicating="" that="" ctpg-w="" arrests="" the="" eca-109="" cell="" cycle="" at="" the="" s="">
CTPG ‑ W giảm Δψm và tạo ra sự giải phóng cytochrome c. Quá trình chết rụng có thể được gây ra bằng con đường phụ thuộc vào ty thể (28,29). Các thành viên ủng hộ và chống apoptotic của họ protein BCL -2 đóng vai trò quan trọng trong việc điều chỉnh tính toàn vẹn của màng ti thể (30,31). Sau khi xử lý CTPG-W trong 24 giờ, Δψm được đánh giá bằng cách sử dụng phương pháp nhuộm JC ‑ 1. Tập hợp JC ‑ 1 (huỳnh quang đỏ được phát hiện trong FL ‑ 2) sẽ phân hủy thành đơn phân (huỳnh quang xanh được phát hiện trong FL -1) khi Δψm đang giảm (32). Như được mô tả trong Hình 5A, tần số của các tế bào FL -1 cộng với FL -2- / cộng tăng đáng kể theo cách phụ thuộc vào liều lượng, cho thấy rằng Δψm của tế bào Eca ‑ 109 giảm. Sự thay đổi huỳnh quang trong tế bào Eca ‑ 109 cũng được quan sát bằng kính hiển vi huỳnh quang ngược (Hình 5B). Với sự gia tăng nồng độ của CTPG ‑ W, huỳnh quang đỏ giảm và huỳnh quang xanh lá cây tăng lên, điều này phù hợp với dữ liệu từ phép đo dòng chảy. Người ta cũng quan sát thấy rằng mức độ cytochrome c trong dịch bào đã tăng lên đáng kể (Hình 5C), đó là kết quả của việc giảm Δψm. Điều này củng cố kết luận rút ra từ số lượng tế bào FL -1 cộng với FL -2- / cộng tăng lên mà Δψm giảm do điều trị CTPG-W. Người ta đã báo cáo rằng JNK có thể điều chỉnh sự hoạt hóa của họ protein BCL -2 gây ra sự giải phóng cytochrome c (33-35). Nó cũng được xác định rằng mức độ JNK đã được điều chỉnh đáng kể sau khi điều trị CTPG-W (Hình 5C). Kết quả chỉ ra rằng CTPG-W có thể gây ra quá trình apoptosis của tế bào Eca -109 thông qua con đường phụ thuộc vào ty thể.
Ảnh hưởng của CTPG ‑ W đến quá trình tạo ROS nội bào. ROS có thể làm giảm Δψm để tạo ra quá trình apoptosis (36). Để điều tra xem CTPG-W có thể tăng sản xuất ROS hay không, các tế bào Eca -109 đã được xử lý với các nồng độ CTPG-W khác nhau. Tế bào được thu thập tại các mốc thời gian đã chỉ định và nhuộm bằng DCFH-DA. Việc sản xuất ROS nội bào trong tế bào Eca -109 được xác định bằng phương pháp đo tế bào dòng chảy. Như được mô tả trong Hình 6A, 800 µg / ml CTPG-W làm tăng đáng kể sản xuất ROS từ 2-6 giờ và giảm từ 12-24 giờ. Ngoài ra, 400 µg / ml CTPG ‑ W đã tăng đáng kể việc sản xuất ROS từ 12-24 h. Hơn nữa, 200 µg / ml CTPG-W không làm thay đổi đáng kể việc sản xuất ROS. Những thay đổi động của quá trình sản xuất ROS có thể liên quan đến quá trình chết rụng tế bào Eca -109. Người ta cũng xác định rằng CTPG-W có hoạt động quét gốc tự do (Hình 6B), có thể liên quan đến việc giảm sản xuất ROS trong các tế bào Eca -109 được xử lý với 800 µg / ml CTPG-W sau 12 giờ.
CTPG ‑ W điều chỉnh hoạt động của caspase ‑ 3, caspase ‑ 7, caspase ‑ 9 và PARP. Sự giải phóng cytochrome c do giảm Δψm có thể kích hoạt các protease caspase để gây ra quá trình apoptosis (29,30,37). Sau khi xử lý CTPG-W trong 24 giờ, sự kích hoạt của caspase -3, 7, 8, 9 và PARP đã được phát hiện bằng phân tích Western blot. So với đối chứng, các mức caspase phân cắt -9, caspase phân cắt -7, caspase phân cắt -3 và PARP phân cắt, nhưng không phải các mức caspase phân cắt {{ 20}}, được điều chỉnh bằng điều trị CTPG theo cách phụ thuộc vào liều lượng (Hình 7). Những kết quả này chỉ ra rằng CTPG-W làm giảm Δψm và thúc đẩy giải phóng cytochrome c để kích hoạt các caspase gây ra quá trình chết rụng của tế bào Eca -109.
Chiết xuất Cistanche tubulosa
Thảo luận
CHM truyền thống có thể gây ra quá trình chết theo chương trình của tế bào ung thư thực quản thông qua các con đường khác nhau, bao gồm thụ thể chết bên ngoài, con đường căng thẳng trong ty thể và mạng lưới nội chất (29). Nghiên cứu trước đây của chúng tôi đã chứng minh rằng CTPG, là thành phần chính của C. tubulosa, đã ức chế sự phát triển của tế bào u hắc tố B 16- F1 0 thông qua việc cảm ứng quá trình chết theo con đường phụ thuộc vào ty thể (24). Trong nghiên cứu này, tác dụng chống khối u của CTPG-W trên tế bào Eca -109 đã được nghiên cứu và người ta xác định rằng CTPG-W đã ngăn chặn sự phát triển của tế bào Eca -109, gây ra quá trình chết rụng và bắt giữ chu kỳ tế bào, giảm Δψm, tăng giải phóng cytochrome c và các caspase hoạt hóa. CTPG và CTPG-W có thể gây ra quá trình apoptosis và bắt giữ chu kỳ tế bào ở các tế bào ung thư. Tuy nhiên, các cơ chế chính xác là khác nhau do các thành phần khác nhau của CTPG (26,64 phần trăm echinacoside, 10,19 phần trăm acteoside và 1,71 phần trăm isoacteoside) và CTPG-W (39,16 phần trăm echinacoside và 2,44 phần trăm acteoside). CTPG đã bắt giữ các tế bào B 16- F10 ở pha G0 / G1, nhưng CTPG-W đã bắt giữ các tế bào Eca -109 ở pha S (24). Sản xuất ROS được tăng lên tùy thuộc vào liều lượng của CTPG, nhưng nó chỉ ra sự thay đổi theo cách phụ thuộc vào thời gian bởi liều cao CTPG ‑ W, tăng đáng kể khi bắt đầu điều trị CTPG-W (2-6 h) và giảm đáng kể sau 12 giờ so với đối chứng. Một lý do có thể là thành phần chính của CTPG-W là echinacoside. Một số nghiên cứu đã báo cáo rằng echinacoside có thể ức chế sản xuất ROS và quá trình chết rụng do ROS gây ra để phát huy tác dụng bảo vệ thần kinh và chống lão hóa của nó (38-40). Tương tự, hoạt động thu dọn gốc tự do đã được quan sát thấy trong nghiên cứu này. Do đó, người ta suy đoán rằng một số thành phần, bao gồm verbascoside, iso-verbascoside và salidroside trong một liều lượng cao CTPG-W có thể ngay lập tức tạo ra ROS để gây ra quá trình apoptosis của tế bào Eca -109 (41,42), và sau đó ROS được quét bởi echinacoside. Một lý do có thể khác cho sự khác biệt trong sản xuất ROS của CTPG và CTPG-W là các dòng tế bào khác nhau đã được sử dụng trong nghiên cứu này và một nghiên cứu trước đó (24). Dong và cộng sự (43) báo cáo rằng echinacoside có thể gây ra quá trình apoptosis của các tế bào ung thư đại trực tràng SW480 ở người thông qua việc tạo ra các tổn thương DNA oxy hóa mà không làm tăng nồng độ ROS.
Xử lý CTPG-W làm giảm Δψm và gây ra sự giải phóng cytochrome c, thúc đẩy sự phân cắt của caspase -9 (28). Nhất quán, mức caspase phân cắt -9 được điều chỉnh bằng cách xử lý CTPG-W. Sau đó, caspase hoạt động -9 có thể kích hoạt caspase -3 để tạo ra quá trình chết rụng (44). Các mức caspase phân cắt -3 cũng được điều chỉnh bằng cách xử lý CTPG-W. Tuy nhiên, caspase -8 không được kích hoạt bởi CTPG-W, cho thấy rằng con đường thụ thể chết bên ngoài không tham gia vào quá trình chết rụng do CTPG-W gây ra. Những quan sát này chỉ ra rằng CTPG-W gây ra quá trình apoptosis của tế bào Eca -109 thông qua việc kích hoạt con đường phụ thuộc vào ty thể.
PARP đóng vai trò quan trọng trong sự ổn định của hệ gen và có thể bị phân cắt bởi các caspase hoạt động, đặc biệt là caspase -3 và -7 (45). Người ta xác định rằng phương pháp điều trị CTPG-W đã kích hoạt caspase -3 và -7, có thể phân cắt PARP để ức chế quá trình sửa chữa DNA và gây ra quá trình apoptosis.
CTPG-W cũng ngăn chặn sự phát triển của tế bào ung thư biểu mô tế bào gan BEL -7404 theo liều lượng và thời gian (dữ liệu chưa được công bố). Mặc dù CTPG-W ức chế sự phát triển của tế bào Eca -109 và BEL -7404, nó thúc đẩy sự gia tăng của tế bào lách, có thể là do hàm lượng polysaccharid (~ 50 phần trăm) trong CTPG-W (46 ). Tương tự, một số nghiên cứu đã báo cáo rằng polysaccharid có thể thúc đẩy sự gia tăng của tế bào lách (46-49). Trong mô hình chuột, người ta xác định rằng CTPG ‑ W làm tăng đáng kể chỉ số lá lách so với nhóm đối chứng, nhưng không ảnh hưởng đến trọng lượng cơ thể và các chỉ số cơ quan khác bao gồm tim, gan, thận và phổi (dữ liệu chưa được công bố), chỉ ra rằng CTPG-W không có tác dụng gây độc tế bào đối với các tế bào bình thường.
Nói chung, dữ liệu chỉ ra rằng CTPG-W ức chế sự phát triển của tế bào Eca -109 bằng cách cảm ứng quá trình apoptosis thông qua con đường phụ thuộc vào ty thể.
lợi ích cistanche: chống apoptosis
Sự nhìn nhận
Các tác giả xin cảm ơn Tiến sĩ Jianhua Yang (Đại học Y khoa Baylor) đã đánh bóng bản thảo.
Kinh phí
Nghiên cứu này được hỗ trợ bởi Kế hoạch 5 năm cho Dự án Đấu thầu Sinh học Kỷ luật Chính lần thứ 13 (tài trợ số 17SDKD0202), Đại học Sư phạm Tân Cương và Phòng thí nghiệm Trọng điểm về Ứng dụng và Quy định Đa dạng Sinh học Môi trường Đặc biệt ở Tân Cương (tài trợ số XJTSWZ -2017-04) cho JL và Quỹ tài trợ của Quỹ Khoa học Tự nhiên Quốc gia Trung Quốc (cấp số 31760260) cho XW.
Sự sẵn có của dữ liệu và vật liệu
Dữ liệu và tài liệu được sử dụng và phân tích trong nghiên cứu này có sẵn từ tác giả tương ứng theo yêu cầu hợp lý.
Tác giả đóng góp
CF, AA, YY và QC đã thực hiện các thí nghiệm. LX, JLv và XW đã phân tích dữ liệu và các số liệu đã chuẩn bị. JinyuL và JinyaoL thiết kế dự án và viết bản thảo.
Phê duyệt đạo đức và đồng ý tham gia
Tất cả các thí nghiệm trên động vật đã được sự chấp thuận của Ủy ban về Đạo đức của Thí nghiệm Động vật của Phòng thí nghiệm Trọng điểm về Tài nguyên Sinh vật và Kỹ thuật Di truyền Tân Cương (phê duyệt, số BRGE-AE001; Đại học Tân Cương).
Sự đồng ý của bệnh nhân để xuất bản
Không áp dụng.
Lợi ích cạnh tranh
Nhiều tác giả tuyên bố rằng họ không có hứng thú với việc cạnh tranh.
Người giới thiệu
Wu CR, Lin HC và Su MH: Đảo ngược bởi dung dịch nướcchiết xuất của Cistanche tubulosatừ những thiếu sót về hành vi trong mô hình chuột giống bệnh Alzheimer: Sự liên quan đến sự lắng đọng amyloid và chức năng dẫn truyền thần kinh trung ương. BMC bổ sung Altern Med 14: 202, 2014.
Li J, Aspire A, Gao L, Huo S, Luo J và Zhang F:Phenylethanoid glycoside từ Cistanche tubulosaức chế sự phát triển của tế bào B 16- F10 cả in vitro và in vivo bằng cách cảm ứng quá trình apoptosis thông qua Con đường phụ thuộc vào ty thể. J Cancer 7: 1877-1887, 2016.
Brand-Williams W, Culver ME, và Berset C: Sử dụng phương pháp gốc tự do để đánh giá hoạt động chống oxy hóa. LWT-Food Sci Technol 28: 25-30, 1995.
