Cistanche Tubulosa bảo vệ các tế bào thần kinh Dopaminergic thông qua việc điều hòa quá trình tự hủy và yếu tố dinh dưỡng thần kinh có nguồn gốc từ tế bào thần kinh đệm: in Vivo và in Vitro-Ⅰ

GIỚI THIỆU

Bệnh Parkinson (PD) là một bệnh thoái hóa thần kinh phổ biến xảy ra ở người cao tuổi với biểu hiện bệnh lý là mất tế bào thần kinh dopaminergic ở vùng chất đen (SN) do thoái hóa. Mức độ nghiêm trọng của bệnh có liên quan đến sự mất tế bào thần kinh dopamine (DA) ở SN, điều này phù hợp với quan điểm cho rằng bệnh thoái hóa thần kinhquá trình diễn ra trong nhiều năm trước khi xuất hiện bất kỳ triệu chứng nào (Sawle và Myers, 1993). Bản chất tiến triển của bệnh gợi ý những khả năng thú vị để can thiệp điều trị bằng cách ngăn chặn quá trình thoái hóa thần kinh tiềm ẩn. Do đó, việc tìm kiếm các hành động mạnh mẽ và cụ thể do trị liệu gây ra của các yếu tố gây suy nhược thần kinh đối với sự sống sót của tế bào thần kinh DA là rất đáng quan tâm.

CISTANCHE TUBULOSA TỰ NHIÊN ĐỂ BẢO VỆ CÁC NEURON DOPAMINERGIC PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Các yếu tố dinh dưỡng thần kinh là các protein thiết yếu, bao gồm yếu tố tăng trưởng thần kinh (NGF), yếu tố dinh dưỡng thần kinh có nguồn gốc từ não (BDNF) và yếu tố dinh dưỡng thần kinh có nguồn gốc từ tế bào thần kinh đệm (GDNF), thúc đẩy tăng trưởng thần kinh, phát triển thần kinh, hướng dẫn sợi trục và chức năng thần kinh. Trong số tất cả các yếu tố dinh dưỡng thần kinh giúp bảo vệ và thúc đẩy quá trình sửa chữa các tế bào thần kinh dopaminergic, GDNF có tác dụng mạnh nhất (Hong và cộng sự, 2008; Rangasamy và cộng sự, 2010; Allen và cộng sự, 2013). GDNF đã được chứng minh là có tác dụng kích thích thần kinh mạnh mẽ đối với tế bào thần kinh DA trong ống nghiệm (Lin và cộng sự, 1993) và phát huy tác dụng bảo vệ thần kinh trong cơ thể. GDNF đã được chứng minh là có thể giải cứu các tế bào thần kinh DA nigral khỏi sự chết tế bào do tổn thương sau khi cắt nách do phẫu thuật hoặc do độc tố ở chuột (Beck và cộng sự, 1995; Kearns và Gash, 1995; Sauer và cộng sự, 1995) và một phần sau đó. quản trị có hệ thốngN-metyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP)ở chuột (Tomac và cộng sự, 1995). Tỷ lệ mắc apoptosis thần kinh tăng lên và giảm tác dụng bảo vệ của các yếu tố dinh dưỡng thần kinh, có khả năng được kích hoạt bởi các yếu tố bệnh lý khác nhau, là nguyên nhân dẫn đến sự thoái hóa của các tế bào thần kinh dopaminergic (Holden và cộng sự, 2006).

C. tubulosa là một loại thuốc thảo dược có nguồn gốc từ một số loài thực vật thuộc chi Cistanche. Đây là một lựa chọn điều trị chính cho hội chứng suy thận có liên quan chặt chẽ đến nội tiết tố androgen trong y học cổ truyền Trung Quốc (TCM). Cho đến nay, nhiều nghiên cứu lâm sàng và cơ bản về C. tubulosa đã chỉ ra hoạt động của các bệnh thoái hóa thần kinh. Do đó, việc xác định các đơn thuốc bổ thận TCM trong điều trị PD có thể cung cấp một phương pháp điều trị lâm sàng thay thế cho PD.Echinacoside (ECH)là thành phần hoạt tính sinh học chính được tìm thấy trong dược liệu C. tubulosa. Các nghiên cứu đã chỉ ra tác dụng điều trị của glycoside Cistanche và ECH,bằng lời nói(VER) và icariin (ICA) đối với bệnh Alzheimer (AD), PD và các bệnh nhân sa sút trí tuệ mạch máu khác (Urano và Tohda, 2010; Wang và cộng sự, 2013; Wu và cộng sự, 2014). Wu và cộng sự. (2014) cho rằng chiết xuất C. tubulosa chứa đủ ECH và Acteoside đã cải thiện rối loạn chức năng nhận thức do A -42 gây ra thông qua việc ngăn chặn sự lắng đọng amyloid và đảo ngược chức năng thần kinh dopaminergic cholinergic và vùng đồi thị. Tao và cộng sự. (2015) nhận thấy rằngglycoside phenylethanoidtừ C. tubulosa (Ph Gs-Ct) đã ngăn ngừa chứng phù não ở độ cao bằng cách giảm biểu hiện protein và mRNA của AQP4 trong mô não của mô hình chuột.

CHIẾT XUẤT CISTANCHE TUBULOSA TỰ NHIÊN CẢI THIỆN NHỚ PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Các nghiên cứu trước đây đã chỉ ra rằng các hợp chất thảo dược Trung Quốc, bao gồm ba thành phần C. tubulosa, epimedium và rhizoma polygonati, đã làm giảm tổn thương đối với các tế bào thần kinh dopaminergic và tăng mức độ dopamine bằng cách điều chỉnh sự biểu hiện của các yếu tố dinh dưỡng thần kinh (Wu và cộng sự, 2013). Do đó, vẫn chưa biết liệu tác dụng bảo vệ thần kinh do C. tubulosa gây ra có lâu dài hay không và việc giải cứu các tế bào thần kinh DA nigral bằng cách sử dụng GDNF có thể duy trì đáng kể các hành vi vận động liên quan đến triệu chứng của động vật PD ở mức độ nào. Nghiên cứu này sử dụng công thức tăng cường thận TCM, bột nano C. tubulosa, đã nhận được bằng sáng chế quốc gia (số bằng sáng chế: 2011103028541) ở Trung Quốc và trước đây đã cho thấy tác dụng điều trị nhất định trong bệnh PD. Do đó, nghiên cứu hiện tại được thiết kế để kiểm tra tác dụng bảo vệ thần kinh và tái tạo của việc điều trị bằng C. tubulosa và để điều tra quá trình tự hủy trên các tế bào MES23.5 và chuột xác định hành vi, cũng như sự điều chỉnh GDNF, được đo bằng một loạt các xét nghiệm mục tiêu .

NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

Vật liệu, thuốc thử và thiết bị

C. tubulosa được mua từ Tập đoàn Tong Ren Tang Bắc Kinh, Công ty TNHH, Bắc Kinh, Trung Quốc. ECH, VER và ICA đến từ Viện Kiểm soát Thực phẩm và Dược phẩm Quốc gia, Trung Quốc. Dòng tế bào thần kinh dopaminergic MES23.5 là món quà của Giáo sư Biao Chen, Phòng thí nghiệm Sinh học Thần kinh, Đại học Y Thủ đô, Bắc Kinh, Trung Quốc. Năm mươi con chuột đực C57BL / 6 (nặng 20 con25 g mỗi con) được mua từ Shanghai SLAC Laboratory Animal Co., Ltd. (số giấy phép: SCXK2012-0002), Thượng Hải, Trung Quốc.

MPP+, MTT và glutamine được mua từ Sigma-Aldrich (Carlsbad, CA, USA); Huyết thanh bào thai và môi trường DMEM/F12 được mua từ Gibco Co. (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA); và tiêu chuẩn MPTP, DA và tiêu chuẩn axit homovanillic (HVA) được mua từ Sigma-Aldrich (Carlsbad, CA, USA). -actin, Bax, Bcl2, GDNF, GDNF thụ thể alpha (GFR 1) và kháng thể Ret được mua từ Cell Signaling Technology, Inc. (Beverly, MA, USA); Bộ thuốc thử nhuộm 3,3'-diaminobenzidine (DAB) được mua từ Fuzhou Maixin Biotech., Ltd. (Phúc Kiến, Trung Quốc); và bộ chuẩn bị mẫu gel SDS-PAGE, bộ phát hiện hóa phát quang tăng cường siêu nhạy (ECL) và xét nghiệm axit bicinchoninic (BCA) được mua từ Viện Công nghệ sinh học Beyotime (Bắc Kinh, Trung Quốc).

Nghiên cứu này sử dụng các thiết bị sau: đầu đọc vi bản ELX8{13}}0 (Bio Tek Winooski, VT, USA); tủ ấm CO2 (Heraeus, Hanau, Đức); Hệ thống phân tích hình ảnh gel DOC 2000, bình điện di và bình điện di (Bio-Rad, Hercules, CA, USA); máy phân tích protein DU-650 (Beckman Coulter, Inc., Fullerton, CA, USA); máy ly tâm lạnh tốc độ cao 5417R (Eppendorf, Hamburg, Đức); Máy nghiền bi hành tinh kép SXQM (Trường Sa, Tencan Powder Technology Co., Ltd, Hồ Nam, Trung Quốc); máy trộn trộn MM400 (Retsch GmbH, Haan, Đức); Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao Agilent 1200 (HPLC; Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA); Điện di PowerPac Basic, hệ thống truyền màng PowerPac Basic, máy chụp ảnh hóa phát quang Universal Hood II, hệ thống sao chép ngược RNA S1000 Thermal Cycler (Bio-Rad); Hệ thống phân tích hình ảnh mô và tế bào Motic Med 6.0 (Motic China Group, Co., Ltd, Hạ Môn, Trung Quốc).

Chuẩn bịC. tubulosaBột nano

C. tubulosa được cân, sau đó làm sạch và khử nước. Sau khi nghiền thành bột thông thường, bột mịn C. tubulosa được đưa qua 200-rây lưới và đông khô. Một máy nghiền bi năng lượng cao và chân không được kiểm soát nhiệt độ đã được sử dụng để điều chế bột nano C. tubulosa. Đầu tiên, bột nano C. tubulosa thô được đặt trong một thùng nghiền bi chân không chứa đầy các bi nghiền cacbua. Tỷ lệ giữa các viên bi nghiền và bột nano C. tubulosa dao động từ 15:1 đến 5:1. Để thu được bột mịn, tốc độ và thời gian của máy nghiền bi năng lượng cao được đặt lần lượt là 300 vòng/phút và 20 phút. Bột mịn được cân để xử lý vật liệu có kích thước nano và được xử lý trong máy nghiền trộn với tần số 25/s và dao động trong 20 giây trong ba lần lặp lại. PBS được sử dụng để hòa tan và chuẩn bị dung dịch gốc 25 mg/mL, sau đó là siêu âm 30 phút, hấp khử trùng và cuối cùng bảo quản ở −20◦C.

Kiểm soát chất lượng các thành phần hoạt động củaC. tubulosabằng HPLC

ECH và VER chứa quá trình rửa giải gradient với silica liên kết octadecylsilane làm chất độn, metanol làm pha động A và dung dịch axit formic 0,1% làm pha động B. Bước sóng phát hiện là 330 nm. ICA chứa dung dịch rửa giải gradient với silica liên kết octadecylsilane làm chất độn và acetonitril-nước (30:70) làm pha động. Bước sóng phát hiện là 270 nm. Mẫu, đối chứng và đối chứng âm tính được đo là 10 µL cho mỗi mẫu thử nghiệm.

Nuôi cấy tế bào và xét nghiệm MTT để đo lường khả năng tồn tại của MPP+-Tế bào được xử lý

Các tế bào MES23.5 được cấy với 5% huyết thanh thai nhi, 1% glutamine, 2% 5{11}}× dung dịch Sato và môi trường DMEM/F12 với 2% penicillin/streptomycin. Chúng được ủ ở 37◦C trong tủ ấm 5% CO2 với độ ẩm bão hòa. Các tế bào được phân lập và di chuyển bằng 0,25% trypsin và huyền phù tế bào được thu hoạch trong giai đoạn tăng trưởng logarit. Các tế bào biệt lập có mật độ 1 × 105 được gieo vào các đĩa giếng 96-được phủ polylysine, sau đó bổ sung các nồng độ cuối cùng khác nhau (6,25, 12,5, 25, 50, 100, 200, 400 và 800 µmol/L ) của phương tiện MPP+. Các tế bào MES23.5 được ủ trong môi trường nuôi cấy bình thường trong 24 giờ và 48 giờ được sử dụng làm đối chứng âm tính trong các thí nghiệm in vitro. Các tế bào từ các nhóm điều trị khác nhau được ủ bằng thuốc thử MTT trong 4 giờ. Dung dịch trong các giếng sau đó được loại bỏ và 150 µL DMSO được thêm vào và khuấy trộn trong 10 phút. Độ hấp thụ của từng mẫu ở bước sóng 570 nm được đo bằng máy đọc vi bản tự động. Tỷ lệ khả năng tồn tại của tế bào (%)=độ hấp thụ trung bình của nhóm thử nghiệm/độ hấp thụ trung bình của nhóm đối chứng âm × 100%.

Các nồng độ liên quan của môi trường MPP+ đã được thêm vào để xử lý trong 24-giờ trong tế bào MES23.5 bằng cách sử dụng phương pháp tương tự như đối với nuôi cấy in vitro. Sau khi xử lý, dung dịch trong giếng được loại bỏ. Môi trường chứa các nồng độ khác nhau (10, 50, 100, 200, 250, 500 và 1000 µg/mL) của bột nano C. tubulosa đã được thêm vào tế bào MES23.5 trong các giếng khác nhau và để ủ trong 24 giờ và 48 giờ. Các tế bào MES23.5 được ủ trong môi trường nuôi cấy bình thường trong 24 giờ và 48 giờ được sử dụng làm đối chứng âm. Các tế bào MES23.5 được ủ trong môi trường MPP+ được sử dụng làm phương tiện. Các phép đo được thực hiện ba lần cho mỗi mẫu. Độ hấp thụ của nhóm điều trị và nhóm đối chứng tương ứng được đo để tính toán khả năng sống của tế bào.

CHIẾT XUẤT CISTANCHE TUBULOSA TỰ NHIÊN CHỐNG MỆT MỎI PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Biểu hiện TH được đo bằng phương pháp hóa mô miễn dịch

Khi bột nano C. tubulosa ở mức 100, 200 và 250 µg/ml, tỷ lệ sống sót của tế bào tăng lên đáng kể (Hình 2G). Vì vậy, trong các thí nghiệm tiếp theo, chúng tôi đã thử nghiệm ba nồng độ: nhóm liều thấp, liều trung bình và liều cao. Ba lần lặp lại đã được thử nghiệm cho từng nhóm C. tubulosa. Các tấm phủ được phủ polylysine đã khử trùng được đặt vào các đĩa giếng. Tiếp theo, 5 × 10 tế bào được gieo vào mỗi giếng và ủ trong 24 giờ. Môi trường tươi thông thường được thay thế trong nhóm đối chứng bình thường và nồng độ cuối cùng của môi trường 100 µmol/L MPP+ được thay thế trong các nhóm xử lý còn lại để ủ trong 24 giờ. Sau đó, môi trường tươi thông thường được thay thế trong các nhóm phương tiện và đối chứng thông thường, và nồng độ cuối cùng là 100, 200 và 250 µg/mL C. tubulosa nanopowder được ủ với các tế bào trong 24 giờ ở liều thấp, trung bình và cao. Nhóm điều trị C. tubulosa tương ứng. Các tế bào MES23.5 trong các nhóm khác nhau được rửa ba lần trong PBS để loại bỏ phần nổi phía trên và cố định thêm trong 4% paraformaldehyde trong 15 phút. Sau khi rửa bằng PBS, các tế bào được ủ bằng chất ức chế peroxidase ở 37◦C trong 30 phút và sau đó được rửa lại bằng PBS. Dung dịch Triton X-100 0,2% được sử dụng để tăng tính thẩm thấu cho tế bào trong 10 phút, sau đó rửa bằng PBS. Huyết thanh dê bình thường được thêm vào từng mẫu và ủ ở nhiệt độ phòng trong 30 phút. Sau đó, huyết thanh dê bình thường được loại bỏ và kháng thể chính được pha loãng theo tỷ lệ 1:400 trong PBS được thêm vào từng mẫu và ủ ở 4◦C qua đêm. Các tế bào trong nhóm đối chứng âm tính được ủ với PBS ở nhiệt độ 4◦C qua đêm. Sau khi rửa bằng PBS, các tế bào được ủ với kháng thể thứ cấp được dán nhãn biotin trong buồng ẩm ở 37◦C trong 20 phút. Sau đó, mỗi mẫu được rửa trong PBS và dán nhãn bằng liên hợp peroxidase-streptavidin cải ngựa (dung dịch làm việc C) ở 37◦C trong 20 phút. Sau khi rửa bằng PBS, các tế bào được nhuộm bằng thuốc thử DAB trong bóng tối khoảng 1–10 phút và sự phát triển màu nâu được theo dõi dưới kính hiển vi ánh sáng. Sau đó, mỗi mẫu được rửa hai lần trong nước cất trong 1–2 phút và hạt nhân được nhuộm tương phản bằng dung dịch hematoxylin trong 0,5–1 phút. Sau khi rửa kỹ từng mẫu trong nước, các tế bào được ngâm trong cồn axit clohydric 1% để phân biệt và dung dịch amoniac 1%, sau đó rửa kỹ các tế bào trong nước. Các tế bào từ mỗi mẫu sau đó được khử nước trong ethanol 70% trong 2 phút, ethanol 80% trong 2 phút, ethanol 90% trong 2 phút hai lần, ethanol 95% trong 2 phút hai lần và 100% ethanol trong 2 phút hai lần. Sau đó, các tế bào được ngâm trong dung dịch xylen trong 2 phút hai lần và gắn trên một phiến kính có nhựa trung tính. Dưới kính hiển vi ánh sáng, mỗi mẫu được chụp ảnh và chọn ngẫu nhiên 5 trường thị giác hiệu quả để xác định biểu hiện của các protein được chọn trong tế bào thần kinh dopaminergic được biểu thị bằng cường độ của các hạt màu nâu và để bán định lượng hàm lượng protein bằng giá trị màu xám trung bình của nó .

Tỷ lệ apoptosis của tế bào MES23.5 được đo bằng phương pháp tế bào học dòng chảy

Các tế bào bám dính được rửa một lần bằng PBS. Để phân lập tế bào, một lượng dung dịch trypsin không chứa EDTA thích hợp được thêm vào ở nhiệt độ phòng và dung dịch được hút nhẹ bằng pipet để cho phép các tế bào bám dính tách ra. Sau đó, môi trường nuôi cấy tế bào được thêm vào để ngăn chặn quá trình trypsin hóa. Hỗn hợp này được chuyển sang ống ly tâm mới và sau đó ly tâm trong 5 phút với tốc độ 1500 vòng / phút để thu thập các tế bào biệt lập. Sau khi loại bỏ phần nổi phía trên, viên tế bào được trộn lại nhẹ nhàng bằng cách sử dụng PBS và các tế bào được đếm. Khoảng 1 × 105 đến 5 × 105 tế bào được treo lại được ly tâm trong 5 phút ở tốc độ 1500 vòng / phút và phần nổi phía trên được loại bỏ. Năm microlit dung dịch liên kết Annexin V-FITC đã được thêm vào viên tế bào để nhẹ nhàng huyền phù lại tế bào. Thêm 5 µL Annexin V-FITC khác vào và trộn kỹ. Năm microlit dung dịch propidium iodide đã được sử dụng để nhuộm tế bào bằng cách ủ ở nhiệt độ phòng trong 10 phút ngay trước khi đo tế bào dòng chảy.

Phân tích Western Blot chotrong ống nghiệm

Các tế bào được chia thành một nhóm bình thường, nhóm điều trị MPP+, liều thấpC. tubulosanhóm điều trị, nhóm điều trị C. tubulosa liều trung bình và nhóm điều trị C. tubulosa liều cao. Biểu thức của Bcl2 và Bax được đo trong mỗi biểu thức. Tổng cộng 1 × 1{14}}5 ô trên mỗi giếng trong tấm giếng 6-được sử dụng để lập mô hình và xử lý trong mỗi nhóm trước khi thu hoạch tế bào. Một hỗn hợp lysate chứa đệm RIPA, chất ức chế protease và chất ức chế phosphatase được thêm vào để ly giải tế bào trong 30 phút trên đá. Sau khi ly tâm, phần nổi phía trên được sử dụng để phân tích protein. Tổng lượng protein được định lượng bằng xét nghiệm BCA và được phân tách bằng 10% SDS-PAGE. Các protein tách biệt được chuyển vào màng và ủ với dung dịch đệm chặn sữa gầy 5% ở nhiệt độ phòng trong 2 giờ. Sau đó, màng này được ủ trong kháng thể chính (Bcl-2 0.34 mg/ml, Bax 0,11 mg/ml, độ pha loãng 1:200) ở 4◦C qua đêm. Sau bước rửa, màng được ủ trong kháng thể thứ cấp (0,5 mg/ml, độ pha loãng 1:5000) ở 4◦C trong 1 giờ và sau đó trong máy phát triển ECL trong 2 phút để phát triển thông thường. Phần mềm Số Một được sử dụng để phân tích bán định lượng biểu hiện protein.

CISTANCHE TUBULOSA TỰ NHIÊN ĐỂ CHỐNG MỆT MỎI BẢO VỆ GAN PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Mô hình động vật thí nghiệm và quản lý dược phẩm

Năm mươi con chuột đực tuần tuổi không có mầm bệnh cụ thể 8-được chia ngẫu nhiên thành năm nhóm: một nhóm bình thường, nhóm điều trị MPTP (Phương tiện), nhóm điều trị bằng C. tubulosa liều thấp, điều trị bằng C. tubulosa liều vừa phải nhóm điều trị C. tubulosa liều cao. Các con vật được nuôi ở nhiệt độ 20–22◦C với quyền tiếp cận thức ăn và nước uống miễn phí. Những con chuột trong nhóm bình thường được tiêm vào màng bụng một lượng nước muối bình thường tương đương trong bảy ngày liên tiếp. Những con chuột trong các nhóm điều trị khác được tiêm MPTP (30 mg/kg/ngày) vào màng bụng trong bảy ngày liên tiếp để thiết lập các phương tiện.

Trong quá trình lập mô hình PD, những con chuột trong nhóm điều trị bằng C. tubulosa liều thấp, liều trung bình và liều cao được tiêm vào dạ dày thể tích lâm sàng tương đương là 4 g/kg/ngày, 8 g/kg/ngày và 16 g/ kg/ngàyBột nano C. tubulosatương ứng trong 14 ngày liên tiếp. Những con chuột trong nhóm đối chứng và nhóm phương tiện được tiêm một lượng nước muối bình thường tương đương vào trong dạ dày trong 14 ngày liên tiếp. Tất cả các quy trình thí nghiệm đã được phê duyệt bởi Ủy ban đạo đức của Đại học Phúc Kiến TCM và được thực hiện theo các nguyên tắc được quốc tế chấp nhận về sử dụng và chăm sóc động vật trong phòng thí nghiệm. Mọi nỗ lực đã được thực hiện để giảm thiểu sự đau khổ của động vật trong nghiên cứu này.