Cistanoside của Cistanche Herba cải thiện tình trạng tổn thương sinh sản ở nam giới do thiếu oxy thông qua việc ức chế stress oxy hóa-Ⅰ

Giới thiệu

Hiện tại, khoảng 48,5 triệu (15%) cặp vợ chồng trong độ tuổi sinh sản trên toàn thế giới bị ảnh hưởng bởi vô sinh, trong đó 40-50% trường hợp được cho là do vô sinh nam, một tình trạng có liên quan chặt chẽ đến các yếu tố môi trường và lối sống. Bằng chứng cho thấy tính nhạy cảm của tinh hoàn động vật có vú với áp suất oxy thấp là yếu tố gây ra một số dạng vô sinh ở nam giới. Như đã chứng minh trong các nghiên cứu trước đây, quá trình sinh tinh trùng bị suy giảm và giảm sút khi tiếp xúc với tình trạng thiếu oxy do hạ huyết áp.

CISTANCHE TUBULOSA TỰ NHIÊN ĐỂ CẢI THIỆN CHỨC NĂNG TÌNH DỤC PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Để khám phá cơ chế cơ bản, các nghiên cứu đã chỉ ra rằng việc tiếp xúc với tình trạng thiếu oxy giảm áp làm tăng sản xuất các loại oxy phản ứng (ROS). ROS đóng vai trò quan trọng trong hệ thống sinh sản nam giới. Ở mức độ thấp, chúng cần thiết cho hoạt động của tinh trùng, phản ứng thể cực và phản ứng tổng hợp tinh trùng-tế bào trứng [10]. Tuy nhiên, ROS quá mức có thể gây ra tổn thương DNA nhân/ty thể của tinh trùng và tổn thương peroxid hóa màng huyết tương, do đó là yếu tố căn nguyên chính gây ra bệnh.tăng nguy cơ vô sinh nam. Do đó, sự tích tụ ROS do thiếu oxy có thể là một nguyên nhân gây vô sinh nam.

Cistanches Herba, một loại cây thuốc ký sinh lâu năm, phân bố rộng rãi ở những vùng khô cằn và được sử dụng rộng rãi do có tác dụng dược lý. Trong số tất cả các nội dung hiệu quả củaCistanches Herba, PhG được coi là thành phần hoạt động chính. Cho đến nay, 34 PhG đã được phân lập từCây Cistanches. Cistanoside(Cis), một PhG hoạt động được phân lập từCistanches Herba, đã nhận được sự chú ý vì tác dụng chống oxy hóa của nó.

Xem xét tác dụng chống oxy hóa của Cis và vai trò của ROS trong điều trị vô sinh nam do thiếu oxy gây ra, Cis được coi là một loại thuốc tiềm năng để điều trị bệnhvô sinh nam do thiếu oxy. Tuy nhiên, một số báo cáo đã đề cập đến tác dụng chống oxy hóa của Cis chiết xuất từ ​​Cistanches Herba trong điều trị vô sinh nam do thiếu oxy hoặc các con đường truyền tín hiệu liên quan. Trong nghiên cứu này, các mô hình thí nghiệm thiếu oxy in vitro và in vivo đã được xây dựng và đánh giá các thành phần tác dụng của các Cis khác nhau.

Nguyên liệu và phương pháp

Nuôi cấy tế bào và thuốc thử

Dòng tế bào sinh tinh của chuột GC{0}}spg (GC-1) được mua từ Bộ sưu tập Văn hóa Kiểu Mỹ (ATCC) và nuôi cấy trong DMEM (Invitrogen, Hoa Kỳ) bổ sung 10% huyết thanh bào thai bò, 1% L-glutamine (100 mM), penicillin (100 U/mL) và streptomycin (100 ug/ mL) ở 37 độ trong tủ ấm tạo ẩm với 5% CO2. Cis (Cis-A, B, C, H) được mua từ Công ty TNHH Công nghệ sinh học Thành Đô Gelipu (Trung Quốc).

CISTANCHE TUBULOSA TỰ NHIÊN ĐỂ CẢI THIỆN CHỨC NĂNG TÌNH DỤC PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Xét nghiệm khả năng sống của tế bào

Khả năng tồn tại của tế bào đã được kiểm tra bằng xét nghiệm bộ đếm tế bào{{0}} (CCK-8). Tóm lại, tế bào GC{2}} được gieo vào các đĩa 96-giếng với tỷ lệ 1,5×103 mỗi giếng và nuôi cấy ở nhiệt độ 37 độ trong 24 giờ. Sau đó, tế bào được xử lý với các nồng độ oxy khác nhau (20%, 15%, 10%, 5%) hoặc các nồng độ khác nhau (2 μM, 0,2 μM, 0,02 μM) Cis (Cis-A, Cis-B, Cis- C, Cis-H) trong thời gian yêu cầu. Sau đó, phần nổi phía trên bị loại bỏ và khả năng sống của tế bào được phát hiện bằng cách sử dụng bộ công cụ CCK{22}} (Dojindo Japan). Độ hấp thụ của mỗi giếng được đo ở bước sóng 450 nm bằng đầu đọc vi bản (BioRad USA). Cuối cùng, khả năng tồn tại của ô được tính theo công thức sau: Khả năng tồn tại của ô=(nhóm ODexperimental - nhóm ODblank)/ (nhóm ODcontrol - nhóm ODblank) × 100%.

Phân tích Western blot

Các tế bào hoặc mô thu hoạch được đồng nhất hóa trong dung dịch đệm RIPA để chiết xuất protein (RIPA Beyotime China; Cocktail Roche Switzerland). Chất nổi trên bề mặt được thu thập và nồng độ protein được kiểm tra bằng phương pháp BCA (Beyotime). Khoảng 40 ug protein chiết xuất từ ​​mỗi mẫu được phân tách bằng SDS-PAGE và được điện hóa trên màng lọc nitrocellulose (NC) (Beyotime China). Màng lọc NC được chặn bằng sữa không béo 5% trong 1,5 giờ và ủ với các kháng thể đặc hiệu (anti-PARP 1:1000, antiCaspase-3 1:1000, anti-Bcl-2 1:1000, anti-Bax 1 :1000, anti-GAPDH 1:1000; tất cả các kháng thể được mua từ Công nghệ Tín hiệu Tế bào, Hoa Kỳ) qua đêm ở nhiệt độ 4 độ. Sau đó, tất cả các màng NC được ủ với kháng thể thứ cấp liên hợp peroxidase cải ngựa tương ứng trong 1,5 giờ ở nhiệt độ phòng và chụp ảnh bằng hệ thống hình ảnh (Tannon, Trung Quốc).

Phát hiện chu kỳ tế bào

Xét nghiệm tế bào học dòng chảy (FCM) đã được thực hiện để phân tích chu kỳ tế bào. Các tế bào được xử lý trong các điều kiện khác nhau trong 72 giờ và được thu hoạch. Sau đó, các tế bào được rửa bằng PBS, cố định trong ethanol 75% và nhuộm bằng propidium iodide (PI). Đối với mỗi mẫu, 1 × 10 tế bào được thu thập và phân tích bằng phương pháp tế bào học dòng chảy (FACS Calibur, BD Bioscatics). Sau đó, tỷ lệ của các ô pha G1/S/G2 và chỉ số tăng sinh [Phase(S+G2)/Phase(G1+S+G2) × 100%] đã được tính toán.

nhuộm Ki-67

Các tế bào được nuôi cấy trong đĩa đồng tâm và được xử lý bằng tình trạng thiếu oxy hoặc các phân nhóm Cis khác nhau trong 72 giờ. Sau khi cố định tất cả các tế bào bằng 4% paraformaldehyde, chúng được ủ bằng kháng thể kháng Ki-67 (1:200, Công nghệ tín hiệu tế bào). Sau đó, tất cả các tế bào được ủ với kháng thể IgG kháng thỏ kết hợp CY-3-tương ứng (1:200, Boster, Trung Quốc) và dung dịch DAPI (1,0 ug/mL, Beyotime). Huỳnh quang được quan sát bằng kính hiển vi đồng tiêu Fluoview FV1000 (Olympus, Nhật Bản).

CHIẾT XUẤT CISTANCHE TUBULOSA HÀNG ĐẦU ĐỂ TĂNG CƯỜNG TESTOSTERONE PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Phát hiện ROS

FCM được giới thiệu để đo nồng độ ROS nội bào bằng DCFH-DA. Các tế bào lơ lửng được gieo vào các đĩa 6-giếng và trải qua các phương pháp xử lý khác nhau. Sau 72 giờ điều trị, các tế bào lơ lửng trong DMEM không huyết thanh với 10 μM DCFH-DA (Beyotime). Sau đó, hàm lượng ROS được xác định bằng cách phân loại tế bào được kích hoạt bằng huỳnh quang trên Hệ thống đo tế bào dòng chảy Beckman Coulter với bước sóng kích thích là 488 nm và bước sóng phát xạ là 525 nm [18].

Xác định Peroxid hóa lipid (LPO)

Xét nghiệm các chất phản ứng với axit thiobarbituric (TBARS) đã được thực hiện để phát hiện LPO. Tất cả các bước vận hành được thực hiện theo hướng dẫn (Sigma USA). Nồng độ được tính toán bằng cách sử dụng hệ số dập tắt mol là 1,56×105/(M·cm), hệ số này thu được bằng cách sử dụng malondialdehyde làm chất chuẩn. Kết quả được biểu thị bằng nmol đương lượng MDA/mg protein.

Xác định hoạt độ enzyme

Hoạt tính của enzym đã được kiểm tra bằng cách sử dụng các bộ xét nghiệm bao gồm glutathione reductase (GR), glutathione peroxidase (GPx) và superoxide dismutase (SOD). Tất cả các bước vận hành được thực hiện theo hướng dẫn được cung cấp (Viện kỹ thuật sinh học Nan Jing Jian Cheng Trung Quốc).

Động vật và giao thức thí nghiệm

Chuột Wistar đực trưởng thành (180-220 g, 8 tuổi) được lấy từ trung tâm động vật của Đại học Quân y số 4, Tây An, Trung Quốc. Giấy phép sử dụng động vật được lấy từ Ủy ban Đạo đức Đại học (Số tham chiếu: 20190506). Thí nghiệm trên động vật được thực hiện theo hướng dẫn của trường đại học về việc chăm sóc và sử dụng động vật thí nghiệm.

Tất cả chuột được phép thích nghi trong khoảng 1 tuần trước khi bắt đầu thí nghiệm. Sau khi thích nghi, chuột được phân ngẫu nhiên thành 6 nhóm, mỗi nhóm 5 con. Những con chuột trong nhóm đối chứng được nuôi trong điều kiện áp suất bình thường (PO2: 20%; áp suất không khí: 101,3 kPa), trong khi những con chuột trong nhóm mô hình và nhóm được xử lý bằng Cis được nuôi trong buồng oxy áp suất thấp (áp suất bên trong 61,6 kPa). , tương đương với độ cao 4000 mét so với mực nước biển; PO2: 14,55%) để mô phỏng môi trường thiếu oxy ở độ cao lớn. Tất cả chuột đều được tiếp cận miễn phí thức ăn và nước uống trong lồng nhựa ở điều kiện nhiệt độ 22 ± 2 độ và độ ẩm với chu kỳ sáng/tối 12-h tự động. Những con chuột trong mô hình và nhóm được điều trị bằng Cis vẫn ở trong điều kiện áp suất thấp nhưng được chuyển sang điều kiện áp suất bình thường cứ sau 96 giờ, tại thời điểm đó thức ăn và nước uống được cung cấp cho chúng và chuồng được làm sạch. Thời gian chuyển từ hypobaric sang hypobaric là khoảng 2 giờ. Tất cả các nhóm điều trị đều được điều trị bằng Cis tương ứng (8 mg/kg/ngày) qua đường uống trong 8 tuần, trong khi chuột đối chứng và chuột mô hình được điều trị với một lượng nước bằng nhau.

Sau 8 tuần, chuột bị giết bằng cách gây mê. Tinh hoàn, mào tinh hoàn và túi tinh được tách ra và cân, chỉ số cơ quan được tính theo công thức sau: (trọng lượng cơ quan/khối lượng động vật) × 100%. Sau đó, tinh trùng trong mào tinh hoàn được thu thập và kiểm tra khả năng vận động cũng như hoạt động của enzyme acrosome. Tương tự, các mô tinh hoàn được thu thập để nghiên cứu mô bệnh học và phát hiện hoạt động của ROS, LPO và enzyme chống oxy hóa.

CHIẾT XUẤT CISTANCHE TUBULOSA CISTANCHE HERB TĂNG SỨC MẠNH TÌNH DỤC PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Đánh giá tỷ lệ tinh trùng sống

Mào tinh hoàn được rạch bằng kéo phẫu thuật và dịch huyền phù tinh trùng được chuẩn bị trong nước muối sinh lý bình thường. Để đánh giá tỷ lệ tinh trùng sống, 5 μL huyền phù tinh trùng được trộn cẩn thận với một thể tích vết eosin-Y tương đương. Tinh trùng sau đó được đếm dưới kính hiển vi ánh sáng. Tỷ lệ tinh trùng sống được đánh giá bằng cách tính toán cả tinh trùng nhuộm màu (tinh trùng chết) và tinh trùng không nhuộm màu (tinh trùng sống).

Xác định hoạt tính enzyme acrosome của tinh trùng

Xét nghiệm hoạt động của enzyme acrosome trong tinh trùng được sử dụng để đánh giá enzyme acrosome của tinh trùng [19]. Kết quả trong mỗi nhóm được tính bằng công thức sau: Hoạt tính enzyme Acrosome (μIU)=(Nhóm ODExperiment - nhóm ODBlank)/(247,5×10) × 106.

Kết quả

Ảnh hưởng của tình trạng thiếu oxy lên tế bào GC-1

Để xác định ảnh hưởng của tình trạng thiếu oxy đối với tế bào mầm, trước tiên chúng tôi đã kiểm tra những thay đổi về khả năng sống sót của tế bào sau khi điều trị thiếu oxy với các nồng độ oxy khác nhau (20%, 15%, 10% và 5%) trong 1, 3, 5 và 7 ngày tương ứng. Kết quả xét nghiệm CCK{8}} cho thấy rằng so với nhóm đối chứng (nồng độ oxy 20%), các tế bào tiếp xúc với tình trạng thiếu oxy có khả năng sống sót giảm đáng kể (P < 0,01; Hình 1A). Hơn nữa, tỷ lệ sống sót của chúng tỷ lệ nghịch với nồng độ oxy và giảm dần theo thời gian cảm ứng. Để tránh tác động gây độc tế bào quá mức, nồng độ oxy 10% và thời gian cảm ứng 3-ngày đã được chọn làm tiêu chí mô hình thiếu oxy cho các thí nghiệm in vitro tiếp theo.

Sau đó, nhuộm FCM và nhuộm miễn dịch huỳnh quang được thực hiện để đánh giá thêm sự thay đổi tăng sinh của tế bào GC{{0}} trong điều trị thiếu oxy. Kết quả cho thấy tình trạng thiếu oxy có thể gây ra sự bắt giữ tế bào GC-1 ở pha G1, do đó làm giảm sự xâm nhập của tế bào vào pha S và ức chế sự sao chép DNA. Do đó, tình trạng thiếu oxy làm giảm đáng kể chỉ số tăng sinh của tế bào GC-1 (P <0,01; Hình 1B). Nhuộm Ki-67 dương tính là một dấu ấn sinh học cụ thể khác của các tế bào đang tăng sinh. Do đó, chúng tôi cũng đã kiểm tra tỷ lệ tế bào dương tính Ki{8}}có hoặc không có điều trị thiếu oxy. So với nhóm đối chứng, điều trị thiếu oxy làm giảm đáng kể tế bào Ki{9}}dương tính, như trong Hình 1C.

Tiếp theo, chúng tôi nhằm mục đích nghiên cứu chế độ ức chế khả năng sống sót của tế bào GC{0}} do tình trạng thiếu oxy gây ra. Như đã báo cáo trong tài liệu, mức độ ROS tăng lên khi chuột tiếp xúc với môi trường thiếu oxy giảm áp [8, 20]. Do đó, nồng độ ROS nội sinh trong các tế bào GC-1 được đo bằng xét nghiệm FCM. Kết quả cho thấy mức ROS cao hơn trong tình trạng thiếu oxy so với nhóm oxy bình thường (P <0,01; Hình 1D). ROS tích lũy gây ra sự suy giảm DNA rõ rệt, từ đó gây ra sự kích hoạt con đường apoptosis của tế bào và có thể là yếu tố căn nguyên chính làm tăng nguy cơ vô sinh nam [21, 22]. Tiếp theo, chúng tôi đã phát hiện tác động kích hoạt apoptotic của tình trạng thiếu oxy trên các tế bào GC-1 bằng phương pháp nhuộm TUNEL. Như được hiển thị trong Hình 1E, việc điều trị bằng tình trạng thiếu oxy dẫn đến sự gia tăng huỳnh quang TUNEL so với nhóm đối chứng, cho thấy sự gia tăng tỷ lệ apoptosis trong nhóm mô hình.

Vì tổn thương tế bào do ROS gây ra thường do HĐH gây ra nên chúng tôi đã thử nghiệm thêm hệ điều hành của các tế bào GC-1. Như được trình bày trong Hình 1F, mức LPO của các ô GC-1 trong nhóm mô hình đã tăng lên rõ rệt so với mức LPO của các ô GC-1 trong nhóm kiểm soát. Những phát hiện này cho thấy tổn thương tế bào GC-1 do thiếu oxy có thể liên quan đến HĐH, nguyên nhân là do sự tích lũy ROS.