So Sánh Giữa QPCR Và RNA‑seq Tiết Lộ Những Thách Thức Trong Định Lượng Biểu Hiện HLA Phần 1

trừu tượng

Kháng nguyên bạch cầu người (HLA) lớp I và II locus là những yếu tố thiết yếu của miễn dịch bẩm sinh và thu được. Chức năng của chúng bao gồm trình diện kháng nguyên cho tế bào T dẫn đến đáp ứng miễn dịch tế bào và dịch thể, và điều biến tế bào NK. Ảnh hưởng đặc biệt của chúng đối với kết quả bệnh tật hiện đã được làm rõ bằng các nghiên cứu kết hợp trên toàn bộ bộ gen. Các exon mã hóa rãnh liên kết peptide là trọng tâm chính để xác định tác động của HLA đối với tính nhạy cảm/cơ chế bệnh sinh. Tuy nhiên, mức độ biểu hiện của HLA cũng có liên quan đến kết quả của bệnh, bổ sung thêm một khía cạnh khác cho sự đa dạng cực độ của HLA tác động đến sự thay đổi trong phản ứng miễn dịch giữa các cá nhân.

Có một mối quan hệ chặt chẽ giữa kháng nguyên bạch cầu và miễn dịch. Kháng nguyên bạch cầu đề cập đến phân tử trên bề mặt tế bào bạch cầu của con người, có thể xác định và phân biệt các loại tế bào và mầm bệnh khác nhau. Nó là một phần quan trọng của hệ thống miễn dịch của con người và là một bộ điều chỉnh quan trọng của phản ứng miễn dịch.

Sự khác biệt về kháng nguyên bạch cầu có thể dẫn đến phản ứng miễn dịch khác nhau và tính nhạy cảm với bệnh tật. Ví dụ, một số kháng nguyên bạch cầu có liên quan đến các bệnh tự miễn dịch, bệnh truyền nhiễm và khối u. Sự biểu hiện của một số kháng nguyên bạch cầu cũng liên quan đến chức năng và số lượng tế bào miễn dịch.

Do đó, hiểu được các đặc điểm phân tử của bề mặt bạch cầu của một cá nhân có ý nghĩa rất lớn để đánh giá tình trạng miễn dịch của cá nhân đó cũng như nguy cơ và tiên lượng bệnh. Đồng thời, nó cũng có lợi cho việc xây dựng các biện pháp điều trị và phòng ngừa cá nhân hóa. Từ quan điểm này, chúng ta cần cải thiện khả năng miễn dịch. Cistanche có tác dụng đáng kể trong việc cải thiện khả năng miễn dịch. Cistanche rất giàu chất chống oxy hóa khác nhau, chẳng hạn như vitamin C và caroten. Những thành phần này có thể loại bỏ các gốc tự do, giảm stress oxy hóa và cải thiện sức đề kháng của hệ thống miễn dịch.

Nhấp vào bột chiết xuất cistanche tubulosa

Để ước tính biểu hiện của HLA, các nghiên cứu miễn dịch truyền thống dựa vào PCR định lượng (qPCR). Việc áp dụng các công nghệ thông lượng cao thay thế như RNA-seq đã bị cản trở bởi các vấn đề kỹ thuật do tính đa hình cực đoan ở các gen HLA. Tuy nhiên, gần đây, nhiều phương pháp tin sinh học đã được phát triển để ước tính chính xác biểu hiện HLA từ dữ liệu RNA-seq. Điều này mở ra một cơ hội thú vị để định lượng biểu hiện HLA trong các bộ dữ liệu lớn nhưng cũng đặt ra câu hỏi liệu kết quả RNA-seq có thể so sánh với kết quả của qPCR hay không. Trong nghiên cứu này, chúng tôi phân tích ba loại dữ liệu biểu hiện cho gen HLA lớp I cho một nhóm cá thể phù hợp: (a) RNA-seq, (b) qPCR và (c) biểu hiện HLA-C bề mặt tế bào. Chúng tôi đã quan sát thấy mối tương quan vừa phải giữa các ước tính biểu hiện từ qPCR và RNA-seq cho HLA-A, -B và -C ({{10}}.2 Nhỏ hơn hoặc bằng rho Nhỏ hơn hoặc bằng 0,53 ). Chúng tôi thảo luận về các yếu tố kỹ thuật và sinh học cần được tính đến khi so sánh định lượng cho các kiểu hình phân tử khác nhau hoặc sử dụng các kỹ thuật khác nhau.

từ khóa

HLA · Biểu hiện · PCR · RNA-seq.

Giới thiệu

Biểu hiện gen cung cấp một kiểu hình phân tử nằm ở vị trí trung gian giữa biến thể di truyền và các kiểu hình phức tạp, chẳng hạn như tình trạng bệnh tật. Hiểu được cơ sở di truyền của biểu hiện gen có thể là chiến lược để tạo mối liên hệ giữa biến thể di truyền và các kiểu hình phức tạp (GTEx Consortium 2013; Lappalainen et al. 2013), bao gồm tính nhạy cảm với các bệnh tự miễn dịch và truyền nhiễm. Mặc dù nghiên cứu về biến thể di truyền ở locus kháng nguyên bạch cầu người (HLA) và trong khu vực phức hợp tương hợp mô chính (MHC) nói chung, đã được sử dụng để phân tích cơ sở di truyền của một số bệnh phức tạp (Trowsdale và Knight 2013; Dendrou et al . 2018), việc bao gồm các kiểu hình phân tử, đặc biệt là những kiểu hình liên quan đến biểu hiện gen, là tương đối gần đây (Apps et al. 2015; Vince et al. 2016; Ramsuran et al. 2018; Johansson et al. 2022).

Vùng MHC của con người trên nhiễm sắc thể 6p21 thể hiện mật độ gen cao, với các kiểu mất cân bằng liên kết (LD) độc đáo và tính đa hình cực cao (de Bakker et al. 2006; Radwan et al. 2020). Vùng MHC chứa các locus HLA lớp I và II mã hóa các phân tử liên quan đến việc kích hoạt và điều chỉnh phản ứng miễn dịch. Các phân tử HLA lớp I được biểu hiện bởi hầu hết các tế bào có nhân và thường có mặt các peptit nội bào đối với các tế bào T CD8 cộng với. Ngược lại, các phân tử HLA lớp II chủ yếu được biểu hiện bởi các tế bào trình diện kháng nguyên chuyên nghiệp và trình diện cho CD4 cộng với các kháng nguyên ngoại sinh của tế bào T đã được nội hóa bởi quá trình nội bào. Các phân tử loại I cũng được nhận diện bởi các thụ thể trên các tế bào giết người tự nhiên (NK), các thụ thể giống như globulin miễn dịch của tế bào giết người (KIR), tác động đến cả việc giáo dục và kích hoạt các tế bào NK (Colonna và Samaridis 1995; Goodson-Gregg et al. 2020). Sự kết hợp của các kiểu mẫu HLA lớp I khác nhau và các phân tử KIR cụ thể ảnh hưởng đến hoạt động của tế bào NK (và một tập hợp con của tế bào CD8 cộng với tế bào T), dẫn đến các rủi ro khác nhau đối với bệnh ung thư, bệnh truyền nhiễm và khả năng tự miễn dịch (được đánh giá trong Kulkarni et al. 2008).

Các hiệp hội bệnh HLA chủ yếu được quy cho sự khác biệt cụ thể của alen trong việc trình bày kháng nguyên, do tính đa hình rộng rãi trong rãnh liên kết peptide. Tuy nhiên, mức độ biểu hiện của HLA góp phần vào một số mối liên quan được quan sát thấy giữa tính đa hình của HLA và kết quả của bệnh. Mức độ biểu hiện HLA là một công cụ điều chỉnh quan trọng của khả năng tự miễn dịch và sức mạnh của phản ứng miễn dịch qua trung gian HLA đối với bệnh ung thư và nhiễm trùng (được đánh giá trong René et al. 2016).

Có nhiều ví dụ về mối liên quan giữa mức độ biểu hiện HLA và kết quả nhiễm vi-rút. Ví dụ, có nhiều tài liệu chứng minh rằng mức độ biểu hiện HLA-C cao hơn, ở cả mức độ mRNA và protein trên bề mặt tế bào, có liên quan đến việc kiểm soát HIV-1 tốt hơn (Thomas và cộng sự 2009; Kulkarni và cộng sự cộng sự 2011; Apps và cộng sự 2013; Parolini và cộng sự 2018; Bachtel và cộng sự 2018), trong khi biểu hiện HLA-A tăng cao có liên quan đến việc kiểm soát HIV kém (Ramsuran và cộng sự 2018). Sự lây nhiễm -2 SARS-CoV điều hòa quá mức biểu hiện gen HLA-C (Loi et al. 2022) và biểu hiện HLA lớp I trên bề mặt tế bào (Zhang et al. 2021; Arshad et al. 2023), cũng như lớp HLA biểu hiện gen II, bao gồm HLA-DPA1, -DPB1, -DRA và -DRB1 (Wilk et al. 2020).

Ngoài ra, có mối liên hệ giữa các mức biểu hiện HLA-DPA1 (Ou et al. 2019) và HLA-DPB1 (Thomas et al. 2012; Ou et al. 2021) với khả năng thanh thải HBV; Biểu hiện HLA-DRA với khả năng dễ bị lây nhiễm bởi vi-rút Cúm A ở dơi trong các dòng tế bào người (Karakus et al. 2019); và mối liên hệ sâu rộng giữa các biến thể quy định và mức độ biểu hiện ở gen HLA lớp II, bao gồm HLA-DQA1, -DQB1, -DQB2, -DRB1 và ​​-DRB5 với phản ứng kháng thể chống lại nhiều loại vi-rút phổ biến (Kachuri et al. 2020).

Mức độ biểu hiện của các locus HLA cũng liên quan đến khả năng tự miễn dịch (xem Johansson và cộng sự 2022 để đánh giá). Mức độ biểu hiện HLA-C ở bề mặt tế bào (Apps et al. 2013; Kulkarni et al. 2013), cũng như mức độ HLA-G trên bề mặt tế bào và trong huyết tương (da Costa Ferreira et al. 2021), có liên quan với nguy cơ mắc bệnh viêm ruột. Sự gia tăng biểu hiện HLA-B27 trên bề mặt tế bào đã được quan sát thấy ở những bệnh nhân viêm cột sống dính khớp (Cauli và cộng sự 2002), cũng như biểu hiện tổng thể của HLA loại I ở những bệnh nhân mắc bệnh Graves (Weider và cộng sự 2021). Mức độ biểu hiện của HLA lớp II cũng ảnh hưởng đến nguy cơ mắc các bệnh tự miễn dịch.

Sự biểu hiện gen HLA-DQA1 và -DRB1 và ​​biểu hiện của các phân tử DQ và DR trên bề mặt tế bào được tăng lên trong bạch cầu đơn nhân máu ngoại vi của bệnh nhân bạch biến (Cavalli et al. 2016); các biến thể quy định liên quan đến biểu hiện gen HLA-DQA1, -DQB1 và ​​-DRB1 cao hơn cũng như biểu hiện DQ và DR trên bề mặt tế bào có liên quan đến nguy cơ mắc bệnh lupus ban đỏ hệ thống (Raj và cộng sự 2016); Biểu hiện gen HLA-DRB5 cao hơn ở bệnh nhân xơ cứng bì với bệnh phổi kẽ (Odani et al. 2012); các alen HLA-DRB1 cụ thể được biểu hiện cao ở bệnh nhân viêm khớp dạng thấp (Houtman et al. 2021); và biểu hiện cao hơn của DRB1*15:01 có liên quan đến nguy cơ mắc bệnh đa xơ cứng (Alcina et al. 2012). Do đó, hiểu được sự biến đổi của biểu hiện HLA giữa các cá nhân và cơ chế điều chỉnh mức độ biểu hiện HLA sẽ là chìa khóa để khám phá cơ sở di truyền của các kiểu hình bệnh.

Theo truyền thống, biểu hiện HLA đã được ước tính bằng các kỹ thuật dựa trên kháng thể đối với mức độ biểu hiện ở bề mặt tế bào (Thomas và cộng sự 2012; Apps và cộng sự 2013) hoặc bằng phương pháp PCR định lượng (qPCR hoặc RT-PCR) đối với mức độ phiên mã mRNA (Bettens và cộng sự cộng sự 2014; Ramsuran và cộng sự 2015, 2017). Thật khó để so sánh kết quả giữa các nghiên cứu hoặc thậm chí so sánh các locus HLA khác nhau trong cùng một nghiên cứu vì các quy trình thí nghiệm khác nhau được sử dụng cho từng phân tích và cho từng locus HLA, điều này có thể dẫn đến hiệu quả khuếch đại khác nhau trong qPCR hoặc ái lực của kháng thể trong tế bào học dòng chảy.

Các công nghệ thông lượng cao như RNA-seq cung cấp ước tính biểu hiện cho tất cả các gen trong bộ gen, bao gồm cả gen HLA, do đó cho phép đánh giá biểu hiện HLA trong bối cảnh toàn bộ bộ gen. Tuy nhiên, những công nghệ này mang lại nhiều thách thức khi được sử dụng để ước tính mức độ biểu hiện của các gen HLA. Ngoài các thành kiến ​​được chứng minh rõ ràng liên quan đến các thử nghiệm RNA-seq (ví dụ: hiệu ứng lô, chuẩn bị thư viện, nội dung GC ('t Hoen et al. 2013), khó khăn trong việc ước tính mức độ biểu hiện của gen HLA xuất phát từ thực tế là quá trình định lượng liên quan đến sự liên kết của các lần đọc ngắn với bộ gen tham chiếu, không cung cấp một đại diện đầy đủ về sự đa dạng allelic của HLA.

Do đó, một số lần đọc có thể không khớp do có nhiều khác biệt liên quan đến bộ gen tham chiếu (Brandt et al. 2015). Ngoài ra, các gen HLA là một phần của họ gen được hình thành sau các vòng sao chép liên tiếp và thường chứa các đoạn rất giống nhau giữa các parolog, do đó dẫn đến sự sắp xếp chéo giữa các gen và định lượng sai lệch về mức độ biểu hiện. Những khó khăn này đã thúc đẩy sự phát triển của các quy trình tính toán (xem Johansson và cộng sự 2022 để xem xét) giải thích cho sự đa dạng HLA đã biết trong bước căn chỉnh và đã được chứng minh là cung cấp các mức biểu hiện chính xác cho các gen HLA (Boegel và cộng sự 2012; Lee và cộng sự 2018; Aguiar và cộng sự 2019; Gutierrez-Arcelus và cộng sự 2020; Darby và cộng sự 2020).

Mặc dù cả hai phương pháp RNA-seq và qPCR đều ước tính biểu hiện HLA bằng cách định lượng mức độ phong phú của các bản phiên mã, nhưng các phương pháp này liên quan đến các quy trình xử lý thử nghiệm và tin sinh học khác nhau. Theo hiểu biết của chúng tôi, việc so sánh định lượng kết quả từ RNA-seq với kết quả thu được từ qPCR đối với gen HLA chưa được thực hiện. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã tìm cách so sánh các kỹ thuật và kiểu hình phân tử khác nhau để định lượng biểu hiện HLA lớp I, lưu ý rằng không có kỹ thuật nào có thể được coi là tiêu chuẩn vàng. Để giảm tác động của biến thể kỹ thuật và sinh học khi so sánh các nghiên cứu khác nhau, chúng tôi đã thực hiện xét nghiệm RNA-seq trên một nhóm 96 cá thể có ước tính biểu hiện qPCR (đối với HLA-A, -B, -C) và cho một tập hợp con cũng có biểu hiện bề mặt tế bào dựa trên kháng thể HLA-C. Quá trình định lượng RNA-seq được thực hiện với một quy trình được thiết kế riêng cho HLA, cho phép ước tính biểu thức chính xác, giảm thiểu sai lệch của các phương pháp tiêu chuẩn dựa trên một bộ gen tham chiếu duy nhất.

Nguyên liệu và phương pháp

Mẫu

Các mẫu máu được lấy từ 96 người hiến máu khỏe mạnh đã đăng ký tham gia chương trình hiến tặng tự nguyện tại Phòng thí nghiệm Nghiên cứu Ung thư Quốc gia Frederick (FNLCR). Có được sự đồng ý bằng văn bản từ tất cả các đối tượng và mẫu vật được ẩn danh theo các quy trình được IRB phê duyệt của Viện Ung thư Quốc gia. RNA được chiết xuất từ ​​​​các tế bào đơn nhân máu ngoại vi mới phân lập (PBMC) bằng cách sử dụng bộ RNeasy Universal (Qiagen). RNA được xử lý bằng DNAse không chứa RNAse để loại bỏ DNA bộ gen. Tổng số RNA được chiết xuất từ ​​​​PBMC đã được định lượng bằng HT RNA Lab Chip (Caliper, Life Science). Tất cả các mẫu có điểm chất lượng RNA lớn hơn 8 đều được sử dụng trong phân tích biểu hiện gen.

gõ HLA

Các alen HLA được xác định bằng trình tự Sanger. Ngoài ra, chúng tôi đã chạy HLApers (Aguiar et al. 2019) và Kourami (Lee và Kingsford 2018) để suy ra các alen HLA trực tiếp từ RNAseq và kiểm tra sự đồng thuận với các cuộc gọi dựa trên trình tự Sanger. Nếu chúng tôi xem xét các cuộc gọi nhất quán giữa HLApers và Kourami, chúng tôi chỉ quan sát thấy 10 điểm không phù hợp với các cuộc gọi Sanger trong số 288 so sánh (3 cá thể loci × 96). Hầu hết trong số chúng (n=5) cho thấy sự hỗ trợ từ RNA-seq đối với một alen rất gần với alen được xác định bởi trình tự Sanger, do đó chúng tôi đã chọn giữ các cuộc gọi dựa trên RNA-seq. Đối với 3 kiểu gen, chúng tôi quan sát thấy các cuộc gọi đồng hợp tử từ RNA-seq có khả năng là do một alen không được biểu hiện và chúng tôi giữ các cuộc gọi từ trình tự Sanger. Điều này không ảnh hưởng đến ước tính biểu thức, vì không có lần đọc nào phù hợp với alen không được phát hiện qua RNA-seq. Đối với một kiểu gen, chúng tôi đã quan sát thấy sự hỗ trợ tốt cho cách gọi dị hợp tử trong khi trình tự Sanger được gọi là đồng hợp tử. Trong trường hợp đó, chúng tôi giữ cuộc gọi dựa trên RNA-seq vì nó giải thích rõ hơn các lần đọc quan sát được. Đối với một cuộc gọi alen, chúng tôi đã xem xét lỗi của các cuộc gọi dựa trên RNA-seq do phạm vi đọc không đủ.

PCR định lượng (qPCR)

Các mức phiên mã HLA mRNA cho HLA-A, -B và -C được đo bằng qPCR trong một thử nghiệm đảm bảo sự khuếch đại không thiên vị của các alen chung ở mỗi locus trong khi tránh sự khuếch đại của tất cả các locus khác. Các đoạn mồi được sử dụng là: HLA-A (F, GCTCCCACTCCATGAGGTAT; R, AGTCTG TGACTGGGCCTTCA); HLA-B (F, ACTGAGCTTGTG GAGACCAGA; R, GCAGCCCCTCATGCTGT); HLA-C (F, CTGGCCCTGACCGAGACCTG; R, CGCTTGTAC TTCTGTGTCTCC). Phiên mã ngược được thực hiện bằng cách sử dụng bộ RNA-to-cDNA công suất cao (Hệ thống sinh học ứng dụng). Quá trình khuếch đại HLA và cDNA của gen 2 microglobulin (B2M) được thực hiện bằng cách sử dụng hỗn hợp tổng thể xanh Power SYBR (Hệ thống sinh học ứng dụng), trên máy ABI 7900HT. Trình tự mồi cho B2M được mô tả trong Bảng S4 của Kulkarni et al. (2013). Mức biểu hiện trung bình của từng gen HLA đã được chuẩn hóa thành mức biểu hiện của B2M và được tính toán bằng phương pháp 2-∆∆Ct (trong đó Ct là chu kỳ ngưỡng).

Các mức biểu hiện alen cụ thể trung bình của các alen HLA phổ biến được ước tính bằng một mô hình tuyến tính như được mô tả trong Ramsuran et al. (2015). Cụ thể, chúng tôi đã lập mô hình biểu hiện dưới dạng hàm tuyến tính của hai alen do mỗi cá thể mang và trích xuất tác động của từng alen đối với biểu hiện gen. Chúng tôi đã thực hiện bước này trong R (xem phần Tính khả dụng của mã).

biểu hiện bề mặt

Biểu hiện bề mặt tế bào HLA-C được đo trên CD3 cộng với các tế bào từ PBMC mới được phân lập bằng phương pháp tế bào học dòng chảy sử dụng kháng thể đơn dòng đặc hiệu HLA-C DT9 (Apps et al. 2013). Đối với phân tích HLA-A trong một nhóm nhỏ các cá thể mang A*03 và A*11, chúng tôi nhuộm các tế bào bằng kháng thể 0554HA (One Lambda, Inc.).

RNA-seq

chuẩn bị RNA

RNA-seq đã được thực hiện trên RNA được lưu trữ ở −80 độ . Tổng RNA được định lượng bằng cách sử dụng Xét nghiệm Qubit RNA HS (Thermo Fisher). Chất lượng RNA được đánh giá bằng thiết bị 2100 Bioanalyzer và Bộ Agilent 6000 RNA Pico (Công nghệ Agilent). Đối với mỗi mẫu, 500 ng RNA tổng số đã được sử dụng làm đầu vào để chuẩn bị toàn bộ thư viện đã cạn kiệt rRNA phiên mã. Một thư viện có dây nối với bộ điều hợp đã được chuẩn bị với Bộ công cụ KAPA HyperPrep (KAPA Biosystems, Wilmington, MA) bằng cách sử dụng Bộ điều hợp mã vạch DNA Bioo Science NEXTfex™ (BioScientifc, Austin, TX, USA) theo giao thức do KAPA cung cấp.

Sự suy giảm rRNA bằng RiboErase

ARN ribôxôm được làm cạn kiệt bằng cách ủ ARN tổng số với các mẫu dò bổ sung cho các trình tự rARN. Sau quá trình lai tạo, RNase H được sử dụng để phân giải rRNA bằng enzym. Việc dọn dẹp và tiêu hóa DNase được thực hiện bằng Kapa Pure Beads và DNase theo giao thức Kapa.

Phân mảnh, tổng hợp cDNA và xây dựng thư viện

Các mẫu thiếu rRNA được phân mảnh ở 85 độ trong 4,5 phút với sự có mặt của magie trước khi tổng hợp sợi thứ nhất và thứ hai và phản ứng A-Tailing. Bộ điều hợp mã vạch DNA NEXTfex (1,5 uM) được nối với cDNA đuôi A với một mã vạch duy nhất cho mỗi mẫu. Các sản phẩm đã được tinh chế bằng Hạt tinh khiết Kapa và 8 chu kỳ Khuếch đại thư viện đã được thực hiện. Sau khi khuếch đại, quá trình dọn dẹp thư viện cuối cùng đã được thực hiện, đồng thời định lượng thư viện và QC được đánh giá bằng cách sử dụng Xét nghiệm Qubit DNA HS (Thermo Fisher) và bộ Agilent DNA HS trên thiết bị 2100 Bioanalyzer.

giải trình tự

Các thư viện giải trình tự ghép kênh thu được đã được sử dụng trong quá trình hình thành cụm trên Illumina cBOT (Illumina, San Diego, CA, USA) và quá trình giải trình tự được thực hiện bằng cách sử dụng Illumina HiSeq 2500 theo các giao thức do Illumina cung cấp cho giải trình tự đầu cuối được ghép nối 2×126 bp. Mỗi bảng điểm được giải trình tự theo độ sâu mục tiêu là 40–50 triệu lượt đọc.

RNA‑seq trên các mẫu mới từ 11 cá nhân

Để điều tra khả năng phân hủy mẫu của vật liệu được lưu trữ ở −80 độ trước khi giải trình tự RNA, một nguồn bất đồng tiềm ẩn với các ước tính qPCR, chúng tôi đã lấy lại máu từ 11 người hiến và thực hiện RNA-seq trên các mẫu mới. Thử nghiệm được thực hiện với cùng phương pháp và chuẩn bị thư viện như trước đây, nhưng được giải trình tự bằng cách sử dụng Illumina NextSeq với số lần đọc 2×150 pb.

Định lượng biểu hiện cho RNA‑seq

bảng điểm tham khảo

Chúng tôi đã sử dụng Salmon (Patro et al. 2017) để ước tính các mức biểu thức cho tất cả các bản phiên mã được chú thích trong cơ sở dữ liệu Gencode v37. Chúng tôi đã sử dụng tất cả các tùy chọn để điều chỉnh độ lệch trên Salmon (độ lệch GC, độ lệch vị trí và độ lệch cụ thể theo trình tự).

Cá nhân hóa

Tương tự như "Bản phiên mã giới thiệu", nhưng với các bản phiên mã HLA được cá nhân hóa theo kiểu gen HLA-A, -B và -C của mỗi cá nhân. Việc cá nhân hóa được thực hiện bằng cách sắp xếp trình tự cho alen HLA của bộ gen tham chiếu với bộ gen để lấy tọa độ. Sau đó, bằng cách sử dụng sự sắp xếp đa trình tự của alen có trên bộ gen tham chiếu với tất cả các alen khác (có sẵn từ bản phát hành IPD-IMGT/HLA 3.43.0 (Robinson và cộng sự 2020)), chúng tôi đã quy kết bộ gen vị trí cho tất cả các alen HLA. Cuối cùng, chúng tôi đã xây dựng một bản phiên mã được cá nhân hóa dựa trên sự kết hợp thông tin về tọa độ bản phiên mã và trình tự của alen HLA. Quy trình này được thực hiện trong R (Nhóm R Core 2020), sử dụng gói Biostrings (Pagès và cộng sự 2020) và gói siêu gọn gàng (Wickham và cộng sự 2019).

For more information:1950477648nn@gmail.com