Hồ sơ toàn diện về các công thức Secretome từ tế bào gốc dịch ối của người trong bào thai và chu sinh Phần 1

Xin vui lòng liên hệoscar.xiao@wecistanche.comđể biết thêm thông tin

Trừu tượng:Trước đây, chúng tôi đã báo cáo rằng tế bào gốc chiết xuất từ ​​nước ối c-KIT cộng với htaman thu được từ các mẫu còn sót lại của chẩn đoán trước khi sinh thường quy ở ba tháng cuối thai kỳ (hAFS bào thai) có tiềm năng tái tạo dẫn đến khả năng sống sót, chống xơ sợi và tăng sinh. cũng có thể được phân lập từ các mẫu chất thải lâm sàng của tam cá nguyệt III trong các cuộc sinh mổ theo lịch trình (hAFS chu sinh), do đó cung cấp một giải pháp thay thế dễ tiếp cận hơn khi so sánh với hAFS bào thai. Tuy nhiên, người ta còn biết rất ít về cấu hình nội tiết của hAF trong chu sinh. Dưới đây chúng tôi cung cấp mô tả chi tiết về tổng số chất tiết hAFS (tức là toàn bộ các yếu tố nội tiết hòa tan được giải phóng bởi các tế bào trong môi trường điều hòa, hAFS-CM) và các túi ngoại bào ( hAFS-EVs) bên trong nó, từ các tế bào chu sinh ở thai kỳ giữa thai kỳ so với thai kỳ III. HAFS của thai nhi và chu sinh được đặc trưng và phải điều chỉnh trước tình trạng thiếu oxy để tăng cường tiềm năng của hệ sinh dục. Các công thức hAFS-CM và hAFS-EV được phân tích hàm lượng protein và chemokine / cytokine, và hàng hóa EV được điều tra thêm bằng cách giải trình tự RNA. Kiểu hình của hAFS bào thai và chu sinh, cùng với các công thức bài tiết tương ứng của chúng, chồng chéo lên nhau; tuy nhiên, hAFS của thai nhi cho thấy hoạt động phosphoryl hóa oxy hóa chưa trưởng thành khi so sánh với những người chu sinh. Hồ sơ của hàng hóa nội tiết của họ cho thấy một số khác biệt theo giai đoạn thai kỳ và điều kiện thiếu oxy trước đó. Cả hai nguồn tế bào đều cung cấp các công thức được làm giàu với các yếu tố kích thích tế bào thần kinh, điều hòa miễn dịch, chống xơ hóa và nội mô, và hệ tiết hAFS của bào thai chưa trưởng thành được xác định bằng cấu hình sinh mạch, tái tạo, phân giải pro và chống lão hóa rõ rệt hơn. Cấu hình RNA nhỏ cho thấy sự làm giàu microRNA trong hàng hóa hAFS-EV của thai nhi và chu sinh, với lõi phân giải pro được biểu hiện ổn định như một dấu hiệu phân tử tham chiếu. Ở đây chúng tôi xác nhận rằng hAFS đại diện cho một nguồn hấp dẫn của các yếu tố nội tiết tái tạo; Việc lựa chọn công thức chế phẩm tiết hAFS cho bào thai hoặc chu sinh cho liệu pháp nội soi trong tương lai nên được đánh giá dựa trên tình huống lâm sàng cụ thể.

Từ khóa:nước ối; tế bào gốc; hiệu ứng nội tiết; túi ngoại bào; môi trường điều hòa tế bào; chemokine; cytokine; proteomics; Giải trình tự RNA; microRNA

Vui lòng bấm vào đây để biết thêm

1. Giới thiệu

Y học tái tạo gần đây đã phát triển như một lĩnh vực mới nổi để cung cấp phục hồi chức năng của các mô bị thương bằng một số chiến lược. Khi các phương pháp tiếp cận kỹ thuật mô đã tiến bộ đáng kể trong những năm gần đây, việc nghiên cứu tác động của tế bào gốc đồng thời ngày càng được tăng cường. Tiềm năng điều trị của các tế bào gốc được cấy ghép đã được chứng minh một cách rộng rãi là chủ yếu nhờ các yếu tố hòa tan được tiết ra của chúng, có thể điều phối một vi môi trường hỗ trợ tái tạo trong mô chủ đồng thời kích hoạt các cơ chế phục hồi chức năng nội sinh [1,2]. Do đó, tế bào gốc tiết ra toàn bộ các phân tử dinh dưỡng nội tiết do tế bào giải phóng, cũng như các túi ngoại bào có màng bao bọc ngày càng được đề xuất như một sản phẩm thuốc trị liệu cải tiến bởi nhiều nghiên cứu tiền lâm sàng độc lập nhằm vào tim mạch, thần kinh và / hoặc viêm. dịch bệnh. Theo đó, tế bào gốc có thể được hình dung như một nhà máy sản xuất sinh học để khai thác bí mật trị liệu của chúng bằng cách cung cấp các phương pháp điều trị tái tạo sẵn sàng sử dụng và không có sẵn. Bằng cách áp dụng chiến lược dựa trên tế bào nhưng không có tế bào như vậy, nhiều khía cạnh hạn chế liên quan đến liệu pháp tế bào chuẩn có thể được khắc phục, trong khi vẫn đảm bảo các tác dụng có lợi.cistanche là gìTheo quan điểm này, các tế bào mô đệm trung mô (MSC) đã được thử nghiệm rộng rãi như các ứng cử viên tế bào giả định? Thật vậy, MSC và tế bào gốc / tế bào tiền thân đã được thiết kế và / hoặc được kích thích bởi các chiến lược tiền điều kiện khác nhau để tăng cường khả năng tái tạo và tiềm năng bài tiết của chúng [3,4] với sự quan tâm rõ ràng đến sự liên quan sinh học của các túi ngoại bào được tiết ra (EVs) của chúng.

EVs là các hạt có kích thước nano được giới hạn bởi lớp lipid kép và được tiết ra một cách chủ động bởi tất cả các loại tế bào. EV bao gồm rất nhỏ (<200 nm)="" exosomes,="" medium-sized="" (200-500="" nm)microvesicles="" or="" shedding="" vesicles,="" and="" larger-sized="" apoptotic="" bodies="" (="">500 nm); chúng hoạt động như những bộ truyền tín hiệu sinh học quan trọng của tín hiệu gian bào bằng cách cung cấp hàng hóa phân tử của chúng từ tế bào mẹ đến người phản hồi / đích [5,6]. Do tiềm năng nội tiết đặc biệt của chúng trong việc tạo ra các tác dụng có lợi có thể so sánh với các tế bào gốc của chúng, EV tế bào gốc đã phát sinh như là các lựa chọn điều trị hấp dẫn trong các mô hình tiền lâm sàng của các bệnh, chẳng hạn như thiếu máu cục bộ, viêm hoặc chấn thương, như đã được xem xét rộng rãi trong [{{3 }}]. Từ góc độ tịnh tiến, ngoài tiềm năng điều biến tế bào, tính khả thi của sự cô lập và khả năng tự đổi mới được nâng cao là những khía cạnh chính của nguồn EV điều trị lý tưởng và các yếu tố hòa tan. Trong trường hợp như vậy, MSC của thai nhi và chu sinh có thể cung cấp một lựa chọn thú vị dựa trên tiềm năng sinh sản của chúng và cấu hình chưa trưởng thành về mặt phát triển với các đặc điểm trung gian giữa các sinh vật soma trưởng thành và phôi thai [10,11]. MSC của bào thai có thể được phân lập từ các phần phụ ngoài phôi trong quá trình mang thai dưới dạng lấy mẫu còn sót lại thu được trong quá trình sàng lọc trước khi sinh (tức là, nhung mao màng đệm [12-14] và nước ối [15,16]) hoặc được lấy làm tiền sản chu sinh khi sinh, từ chất thải lâm sàng (tức là màng ối và nhau thai [17-21], các thành phần của dây rốn [22-24] và nước ối đủ tháng [25,26]).

Cistanche có thể chống lão hóa

Đáng chú ý, tế bào gốc từ nước ối của con người (hAFS) đã được đánh giá là chiến lược điều trị đầy hứa hẹn trong y học tái tạo. và đã được chứng minh là đa năng in vitro và in vivo [16,27,28], đóng góp vào dòng tạo máu sau khi cấy ghép tử cung [29], và đưa vào các cơ quan bị thương đồng thời tạo ra các tác dụng điều hòa miễn dịch [26,30] và kích hoạt các phản hồi so sánh nội sinh, như được mô tả toàn diện trong [31]. Nhóm của chúng tôi và những người khác đã chứng minh thêm rằng hAFS giải phóng một nguồn bí mật được làm giàu cao với các phân tử dinh dưỡng hoạt tính sinh học có thể nhắm mục tiêu các cơ chế so sánh khác nhau. Các yếu tố nội tiết hAFS đã được báo cáo là cung cấp các kích thích sinh tồn để dập tắt viêm [32], bảo vệ tim chống lại chứng thiếu máu cục bộ kéo dài [33,34], và độc tính trên tim [35], và kích thích hình thành mạch cục bộ với sự tái nhập chu kỳ tế bào cơ tim [ 34,36]. Vì hầu hết các tác dụng này đã được chứng minh là được tổng hợp lại bằng cách sử dụng hAFS-EV một mình, các nghiên cứu độc lập đã tập trung vào việc mổ xẻ cấu trúc tái tạo của chúng dựa trên các nền bệnh lý khác nhau, bao gồm chấn thương cơ tim và xương, bệnh thận, viêm xương khớp, loãng xương, viêm ruột hoại tử và thoái hóa thần kinh. mô hình [34, 37-44].

Mặc dù bằng chứng có thể hỗ trợ việc dịch thuật lâm sàng của hAFS-EVs cho liệu pháp nội tiết trong tương lai, nhưng điều quan trọng là phải xem xét rằng hầu hết các nghiên cứu này chủ yếu điều tra tiềm năng điều biến của hAFS thai nhi thu được trong quá trình sàng lọc trước khi sinh ba tháng cuối. giai đoạn chu sinh có đối ứng (tức là từ phần c của tam cá nguyệt III) vẫn chưa được khám phá chi tiết. HAFS chu sinh ở tam cá nguyệt thứ ba đã cho thấy các đặc tính điều hòa miễn dịch đặc biệt so với hAFS ở tam cá nguyệt thứ ba và thứ ba [26], đồng thời duy trì tiềm năng tái tạo nội mô có liên quan [25].cần bao nhiêu cistancheĐáng chú ý, báo cáo gần đây về hình thái không đồng nhất của hAFS bào thai [45] đã cung cấp những hiểu biết mới về nguồn gốc và hồ sơ biểu hiện gen của chúng.bioflavonoidsĐiều này hoàn toàn làm sáng tỏ giá trị tái tạo của các phần tế bào khác nhau của hAFS [46]. Do đó, đặc điểm toàn diện của các quần thể con khác nhau của hAFS đang thu hút sự chú ý ngày càng tăng. Trước đây, chúng tôi đã báo cáo rằng kích thích không có oxy và huyết thanh trong 24 giờ đại diện cho một chiến lược hiệu quả để tăng cường tiềm năng nội tiết của hAFS thai 3 tháng [34,35,37]. Vì còn rất ít thông tin về thành phần của chất tiết từ hAFS 3 tháng giữa thai kỳ, ở đây chúng tôi báo cáo sự so sánh toàn diện giữa hAFS Ⅱ so với 3 tháng cuối thai kỳ và các phần cơ thể tiết của chúng (bao gồm cả mũ-EV), để giải quyết ảnh hưởng của giai đoạn mang thai và tế bào thiếu oxy tiền điều hòa về đặc điểm tế bào và chất tiết.

2. Kết quả

2.1. HAFS qua thai trình bày một sự phù hợp kiểu hình gần với thai nhi có

Không có sự khác biệt có liên quan về mặt thống kê nào được đánh giá cao về tuổi hiến tặng giữa các mẫu nước ối ở 3 tháng giữa thai kỳ và chu sinh 3 tháng cuối. C-KIT * hAFS của bào thai (f-hAFS từ mẫu nước ối 3 tháng cuối thai kỳ) và c-KIT * hAFS chu sinh (p-hAFS từ chất thải lâm sàng nước ối ở 3 tháng giữa thai kỳ) xác nhận các đặc điểm tương tự với hình thái giống nguyên bào sợi và hình bầu dục (Hình 1A) và kiểu hình mô đệm trung mô (dữ liệu không được hiển thị), như đã báo cáo trước đây [16,25]. Cả f-hAFS và p-hAFS được nuôi cấy trong ống nghiệm cho đến đoạn 5 đều cho thấy mức độ lão hóa không đáng kể từ sự hoạt hóa - - galactosidase (SA - - Gal) liên quan đến lão hóa trong khoảng 4 phần trăm tế bào (Hình 1B) . Cả f-hAFS và p-hAFS đều có mức độ đồng biểu hiện cao của các dấu hiệu trung mô CD107a và CD146, gần đây đã được báo cáo là xác định kiểu hình tiết nhiều [47]. Các ô CD107at CD146 * đại diện cho phần lớn dân số f-hAFS (khoảng 64 phần trăm, * p<0.05), while="" p-hafs="" showed="" a="" lower="" enrichment="" for="" this="" subpopulation,="" approximately="" 52%="" of="" total="" cells,="" yet="" this="" disparity="" was="" not="" statistically="" significant="" (figure="">

Hình 1. Thai nhi có và chu sinh có đánh giá kiểu hình. (A) Hình ảnh đại diện của hAFS bào thai (f-hAFS, bảng bên trái) và hAFS chu sinh (p-hAFS, bảng bên phải) được nuôi cấy trong ống nghiệm trong điều kiện tiêu chuẩn; thanh tỷ lệ: 2 0 0 um. (B) Phân tích dấu hiệu tuổi già beta-galactosidase (SA - - Gal, màu xanh lam) qua phương pháp nhuộm hóa tế bào trên f-hAFS và p-hAFS sau 5 lần nuôi cấy; hình ảnh đại diện được báo cáo trong bảng điều khiển bên trái, thanh tỷ lệ: 200 um. Phần trăm tương ứng của các ô / trường -Gal dương tính được báo cáo trong biểu đồ trong bảng điều khiển bên phải (f-hAFS: 4,12 ± 0,58 phần trăm và p-hAFS: 3,88 ± 2,10 phần trăm; p =0. 1424, n { {24}} thí nghiệm). (C) Kiểu miễn dịch của hAFS biểu hiện dấu hiệu trung mô CD146 và CD107a. Biểu đồ đo tế bào dòng chảy đại diện của f-hAFS và p-hAFS (bảng điều khiển bên trái) và các giá trị tương ứng được đề cập đến các ô CD107a dương tính kép cộng với CD146 cộng với các ô; CD107a cộng với CD146 * f-hAFS: 63,68 ± 5,82 phần trăm, * p =0. 016 so với remaing36,32 ± 5,82 phần trăm f-hAFS (Khác); CD107at CD146 cộng với p-hAFS: 52,07 ± 6,76 phần trăm còn lại47. 93 ± 56,76 phần trăm p-hAFS (Khác); CD107a cộng với CD146 cộng với f-hAFS so với CD107a cộng với CD146 cộng với p-hAFS p =0. 2403, n =4 thử nghiệm. Khác: tổng dung lượng còn lại của CD107a-CD146 ~ hAFS, CD107a ~ CD146 * hAFS và CD107at CD 146- hAFS. Tất cả các giá trị được biểu thị dưới dạng giá trị trung bình ± nửa của các thí nghiệm độc lập. SA - - Gal: galactosidase liên kết với Senescence - -.

2.2.HAFS thai nhi cho thấy sự trao đổi chất khác với hAFS chu sinh

Để đánh giá liệu giai đoạn mang thai có thể ảnh hưởng đến sự trao đổi chất của ty thể hay không, f-hAFS và p-hAFS đã được phân tích trong điều kiện nuôi cấy in vitro tiêu chuẩn bằng các phân tích sinh hóa. Đánh giá quá trình chuyển hóa hiếu khí cho thấy tốc độ tiêu thụ oxy (OCR) và tổng hợp ATP ở f-hAFS thấp hơn so với p-hAFS, cả khi được kích thích bằng pyruvate và malate (P / M; *** p<0.001 for="" ocr,="" and=""><0001, for="" atp="" synthesis),="" and="" with=""><0.01 for="" ocr="" and="" atp="" synthesis,="" figure="" 2a).="" moreover,="" f-has="" displayed="" a="" lower="" oxidative="" phosphorylation="" efficiency="" when="" compared="" to="" p-hafs,="" as="" shown="" by="" thep/o=""><0.001 for="" p/m="" and=""><0001 for="" succinate).="" values="" for="" f-hafs="" were="" lower="" than="" those="" reported="" in="" the="" literature[48],="" and="" suggest="" uncoupling="" between="" oxygen="" consumption="" and="" atp="" production="" (figure="" 2a).="" by="" evaluating="" the="" relative="" contributions="" of="" glutamine,="" long-chain="" fatty="" acid="" oxidation,="" and="" glucose="" in="" oxidative="" phosphorylation="" (oxphos)metabolism,="" we="" noticed="" that="" f-hafs="" were="" sensitive="" to="" the="" addition="" of="" bptes="" (glutaminase="" inhibitor,**="">< 0.01)="" and="" etomoxir(carnitine="" palmitoyl-transferase="" 1a="" inhibitor,=""><0.01), but="" not="" to="" uk5099="" (mitochondrial="" pyruvate="" carrier="" inhibitor).="" by=""><0.0001)and><0.001),but not="" etomoxir,inhibited="" the="" metabolism="" of="" p-hafs="" (figure="" 2b,="" upper="" panel).="" this="" observation="" was="" confirmed="" by="" the="" inhibition="" percentage="" of="" the="" single="" inhibitor="" (figure="" 2b,="" lower="" panel).="" therefore,="" both="" cell="" types="" similarly="" rely="" on="" glutamine="" as="" a="" respiratory="" substrate;="" yet,="" f-hafs="" prefer="" fatty="" acids="" as="" a="" second="" substrate,="" while="" p-hafs="" are="" sustained="" by="" glucose.="" interestingly,="" f-hafs="" showed="" a="" higher="" increment="" of="" glucose="" consumption="" and="" lactate="" release="" when="" compared="" to="" p-hafs=""><0.05><0.001 respectively,="" figure="" 2c),="" which="" indicates="" the="" attempt="" to="" balance="" inefficient="" aerobic="" metabolism="" by="" lactate="" fermentation.="" this="" difference="" could="" also="" explain="" the="" reaction="" of="" f-hafs="" to="" the="" addition="" of="" etomoxir="" and="" uk5099.="" since="" f-has="" favor="" the="" use="" of="" glucose="" during="" anaerobic="" glycolysis(*=""><0.05), they="" are="" likely="" forced="" to="" use="" fatty="" acids="" and="" glutamine="" to="" supply="" the="" aerobic="">

2.3 Điều hòa trước về độc tố không ảnh hưởng đến thai nhi và chu sinh có khả năng tồn tại và duy trì hoạt động bài tiết của chúng

Để xác định công thức chế tiết hAFS, các tế bào được nuôi cấy trong điều kiện không có huyết thanh để tránh bất kỳ sự ô nhiễm nào từ FBS. Trước đây, chúng tôi đã chỉ ra rằng điều kiện nuôi cấy không có huyết thanh (SF) và 1% O2 trong 24 giờ không làm thay đổi đáng kể khả năng tồn tại của hAFS bào thai Ⅱtrimester (f-hope), trong khi chúng hỗ trợ giải phóng các yếu tố nội tiết tái tạo trong môi trường điều hòa tế bào của chúng (hAFS-CM) và trong túi ngoại bào (hAFS. EVs) [34,35,37,49]. Trong tài liệu này, ngoài việc xác định cấu hình các phân đoạn bí mật p-hAFS lần đầu tiên, chúng tôi đánh giá xem liệu p có biểu hiện hành vi tương tự trong cùng một chế độ điều kiện trước hay không, sử dụng điều kiện nuôi cấy normoxic làm đối chứng. Khả năng tồn tại của f-hAFS và p-hAFS được phân tích sau 24 giờ trong các cài đặt sau: điều kiện không độc hại (20 phần trăm O2) trong môi trường nuôi cấy kiểm soát hoàn toàn (Ctrl) (Ctrlf-hAFSnormo và Ctrl p-hAFSnormo), điều kiện không độc hại trong môi trường SF (SF f-hAFSnormo và SF p-hAFSnormo), tình trạng thiếu oxy (1 phần trăm O2) trong môi trường kiểm soát hoàn toàn (Ctrlf-có hypo và Ctrl p-hAFSnypo), và tình trạng thiếu oxy trong môi trường SF (SF f-có hypo và SF p -has hypo, Hình 3A). Chúng tôi xác nhận rằng khả năng tồn tại của f-have không bị thay đổi trong cả điều kiện Ctrl và SF và trong điều kiện kích thích thiếu oxy, với hơn 80 phần trăm (lên đến gần 88 phần trăm) tổng số tế bào không bị ảnh hưởng. Tế bào apoptotic sớm và muộn dao động từ ca. 13 phần trăm đến 18 phần trăm trong điều kiện SF, không có bất kỳ sự liên quan có ý nghĩa thống kê nào. Tương tự như vậy, khả năng sống sót của chu sinh nằm trong khoảng 80-92 phần trăm, và các tế bào apoptotic sớm và muộn chiếm tới 18 phần trăm trong điều kiện SF. p-hAFS chỉ bị ảnh hưởng nhẹ trong điều kiện thiếu oxy và SF kết hợp; thực sự, mặc dù điều kiện trước không ảnh hưởng đến sự sống sót của tế bào khi p-hAFS được nuôi cấy trong môi trường hoàn chỉnh, điều kiện SF tương ứng cho thấy sự gia tăng ca. 4- gấp (* p<0.05) of="" late="" apoptotic="" cells(figure="">

Hình 2. Đặc điểm trao đổi chất củaAFS bào thai và chu sinh. (A) Tỷ lệ tiêu thụ oxy (OCR), tổng hợp ATP thông qua tổng hợp F 1- F.ATP và tỷ lệ P / O trong f-have và-have khi có sự hiện diện của pyruvate cộng với malate (P / M) hoặc succinate (Succ); *** p =0. 0005, ** p =0. 0012, **** p<><0.0001.(b)ocr and="" atp="" synthesis="" in="" presence="" of="" bptes,="" etomoxir,="" and="" uk5099(upper="" panel)="" was="" sequentially="" added="" during="" the="" experiments="" to="" evaluate="" the="" relative="" contributions="" of="" glutamine,="" long-chain="" fatty="" acid="" oxidation="" and="" glucose="" in="" oxphos="" metabolism="" in="" f-hafs="" and="" p-hafs.for="" ocr="" experiments:="" f-hafs+bptes**p="0.0014;for" f-hafs="" +="" etomoxir**p="0.0088;for" p-hafs=""><0.0001;for><0.0001. for="" atp="" experiments:="" f-hafs="" +="" bptes****=""><0.0001; for="" f-hafs＋etomoxir**p="0.0013;for"><0.0001;for p-hafs="" +="" uk5099="" **=""><0.0001).>cistanche ÚcSo sánh tỷ lệ phần trăm ức chế tổng hợp OCR và ATP trong f-và-hAFS do các chất ức chế được chỉ ra ở trên được báo cáo trong bảng dưới B. Đối với các thí nghiệm OCR: hAFS cộng với Etomoxir **** p<0.0001; for="" hafs="" +="" uk5099="" ****=""><0.0001. for="" atp="" experiments:=""><0.0001;for hafs="" +uk5099="" ****=""><0.0001).(c) glucose="" consumption,lactate="" release="" and="" anaerobic="" glycolysis="" yield,="" used="" as="" markers="" of="" the="" anaerobic="" glycolysis,="" in="" f-hafs="" and="" p-hafs.="" all="" values="" are="" expressed="" as="" mean="" ±="" use.m="" of="" n="4" independent="" experiments;*p="">

Sau đó, chúng tôi đánh giá năng suất của các phân đoạn secretome thu được từ f-hAFS so với p-hAFS dựa trên sự làm giàu protein. Tổng số có chất tiết, vì toàn bộ các yếu tố nội tiết do tế bào tiết ra, ở đây được biểu thị bằng hAFS-CM. Nồng độ protein của f-hAFS-CM và p-hAFS-CM trong môi trường SF sau điều kiện tiền điều hòa tế bào thiếu oxy so với tình trạng không nhiễm độc kiểm soát như ban đầu (cụ thể là f-hAFS-CMnormo, f-hAFS-CMNypo, P has-CMnormo, và p -hAFS-CMHypo,) được đánh giá bằng xét nghiệm BCA và đo trên 10§ tế bào.cistanchCác kết quả thu được cho thấy rằng f-has-CM và p-hAFS-CM cho thấy xu hướng tích cực như nhau trong quá trình làm giàu protein sau khi mồi thiếu oxy (f-hAFS-CMnypo'166.1 0 ± 22,13 ug / 1 0 ô độ; p-hAFS-CMNypo∶182,3 0 ± 29,71 ug / 1 0 ô độ） so với các ô đối ứng không độc hại của chúng (f-hAFS-CMnormo: 105,50 ± 19,89 ug / ô 10 độ; p- hAFS-CMhypoi 91,12 ± 24,39 ug / tế bào 10 độ）. Tương tự, nồng độ protein bề mặt của hAFS-EVs được đo bằng f-have-EVSnormo, f-hAFS-EVShypo, p-hAFS-EVSnormo và p-hAFS-EVShypo EV cho thấy năng suất tương đương khi thu được từ f-hAFS hoặc p-hAFS. Đối với công thức hAFS-CM, xu hướng tích cực trong việc tăng hàm lượng protein trên f-hAFS-EV và p-hAFS. EV được đánh giá cao sau khi kích thích giảm oxy qua điều kiện không độc hại tương ứng （f-hAFS-EVSHypo∶2,03 ​​± 0,67 ug / ô 10 độ và ô p-hAFS-EVSHypo∶1,85 ± 0,47 ug / 10 độ; f-have-EVsnormo∶1,28 ± 0,36ug / ô 10 độ và p -hAFS-EVsnormo∶1,19 ± 0,31 ug / ô 10 độ, Hình 3C).

2.4. EVs giải phóng hAFS trong thai kỳ và chu sinh với hình thái tương tự và phân bố kích thước

Phân tích hình thái bằng kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM) làm tăng mức độ tăng tiết EV cao của cả f-hAFS và p-hAFS (Hình 4). Chúng tôi đã nghiên cứu thêm về kích thước và diện tích của f-hAFS-EVs và p-hAFS-EVs (Hình 4B) sau khi điều hòa trước tình trạng thiếu oxy so với đường cơ sở normoxic. Thai nhi và chu sinh đã tiết ra các EV có kích thước không đồng nhất, trong khoảng 40-250 nm, do đó bao gồm cả exosomes / EV nhỏ và microvesicles / túi rụng. Kích thước trung bình của EVs / trường trong các nhóm khác nhau có thể so sánh được, hAFS-EVs của thai nhi được đo 90-100 nm (f-hAFS-EVsnormo: 104. 00 ± 3. 00 nm; f -have-EVSHvpo: 97,10 ± 10,10 nm) và chu sinh được đo 70-114 nm (p-hAFS-EVsnormo: 94,60 ± 19,53 nm; p-hAFS-EVShypo: 76,43 ± 4. 86 nm, Hình 4B, bảng điều khiển bên trái). Đối với năng suất, hAFS được kích thích trong điều kiện thiếu oxy cho thấy một xu hướng tích cực trong việc tăng số lượng EV nhỏ, mặc dù sự gia tăng này không có ý nghĩa thống kê. f-hAFS-EVStypo đo được 40-70 nm, gần gấp đôi so với đối tác không độc hại của chúng. Perinatal-has-EVSHypo đo được 40-70 nm, 70-100 nm và 100-130 nm gần gấp ba lần số lượng thu được trong nuôi cấy không độc hại (Hình 4B).

Phân tích theo dõi hạt nano (NTA) cho thấy số lượng hạt tăng cao trong cả chế phẩm f-hAFS-EV và p-hAFS-EV, đồng thời xác nhận sự gia tăng EV trong các mẫu thiếu oxy, cũng như được quan sát từ các phân tích trước đó (f-hAFS- EVsnormo: 182 ± 0. 1 0 'hạt / 1 {0 ô độ; f-have-EVshypo: 3,3 0 ± 0,22 × 10 hạt / ô 10 độ ; p-hAFS-EVsnormo: hạt 2,43 ± 0,80 × 10 độ / ô 10 độ; p-hAFS-EVshypo: hạt 3,05 ± 0,62 × 10 độ / ô 10 độ, Hình 4C).

Hình 4. Đặc điểm hình thái của EVs thai nhi và chu sinh. (A) Hình ảnh đại diện của kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM) của f-hAFS và p-hAFS (bảng điều khiển phía trên và phía dưới bên trái, tương ứng, với các mũi tên màu đen cho biết các thể nhiều lỗ trong tế bào chất với EVs / exosomes nhỏ bên trong chúng) và của f -hAFS-EVs và p-hAFS-EVs (bảng điều khiển phía trên và phía dưới bên phải, tương ứng) được phát hành trong điều kiện không có huyết thanh và trong điều kiện tiền điều hòa không độc tính so với thiếu oxy (f-hAFS-EVSnormo; f-have-EVSHypoi p-hAFS-EVSnormo; và f-hAFS-EVshypo, tương ứng), vạch chia độ: 200 nm. (B) Bảng điều khiển bên trái: Phân tích TEM về phân bố kích thước hAFS-EVs; bảng điều khiển bên phải: phân bố số f-hAFS-EV và p-hAFS-EV trên mỗi khoảng kích thước trường từ 40 nm đến 250 nm đã được xem xét; các giá trị được biểu thị dưới dạng trung bình ± bán phần của n =3 thử nghiệm độc lập. (C) Phân tích theo dõi hạt nano cho kích thước và phân bố hAFS. Bảng điều khiển bên trái: hình ảnh đại diện của đầu ra đồ họa; bảng điều khiển bên phải: nồng độ hAFS-EVs được đo dưới dạng hạt 10 độ trên tế bào tiết 10 độ; nm: nanomet; mL: mililit.

2.5 Đặc điểm cấu tạo của bào thai so với chu sinh hAFS Điểm nổi bật Sự khác biệt trong thành phần cơ thể bí mật của chúng theo tuổi thai và điều kiện thiếu oxy

Việc xác định đặc tính proteomic của cả công thức chế phẩm mật f-hAFS và p-hAFS được thực hiện bằng một bệ không có nhãn shotgun, dựa trên sự kết hợp của sắc ký lỏng nano và khối phổ có độ phân giải cao (nLC-HRMS). Bốn mươi tám cấu hình protein được thu nhận bằng cách phân tích lặp lại ba bản sao sinh học của hAFS-CM và có-EVs từ f-hAFS và p-hAFS trong điều kiện tế bào thiếu oxy trước khi đưa vào cơ thể so với điều kiện không nhiễm độc như đối chứng. Tổng cộng có 4179 nhóm protein riêng biệt đã được xác định với ít nhất một peptide duy nhất và có trọng lượng phân tử từ 2 đến 3900 kDa và điểm đẳng điện từ 3,6 đến 13. Một biểu hiện protein trung bình cao hơn trong hAFS-EVs được quan sát khi so sánh với hAFS-CM . Sự sắp xếp của tất cả các danh sách protein thu được được thực hiện trên cơ sở các protein đã được xác định. Đối với mỗi điều kiện thử nghiệm, một danh sách duy nhất đã được tạo ra để chuẩn hóa và tính trung bình [50] các giá trị đối sánh phổ peptit (PSM) được quy cho các protein, đại diện cho số lượng phổ khối lượng được gán cho mỗi và gián tiếp đại diện cho sự phong phú của chúng trong các mẫu. Danh sách đầy đủ các protein được xác định trong công thức hAFS-CM và have-EV được báo cáo trong Bảng S1.

Việc áp dụng phân tích phân biệt tuyến tính (LDA [51]) trong danh sách tổng thể này cho phép chiết xuất các protein có ý nghĩa thống kê (Fratio Lớn hơn hoặc bằng 4,5 và ** p<0.001)to be="" processed="" by="" hierarchical="" clustering.="" figure="" sla="" shows="" a="" clear="" separation="" and="" different="" behavior="" between="" hafs-cm="" and="" have-ev="" fractions="" generating="" two="" main="" branches,="" as="" highlighted="" by="" the="" heatmap="" color="" code.="" a="" further="" subgrouping="" was="" also="" observed="" according="" to="" the="" gestational="" age="" and="" the="" hypoxic="" preconditioning="" adopted.="" the="" fact="" that="" each="" analyzed="" condition="" presented="" a="" unique="" identity="" is="" confirmed="" by="" the="" venn="" diagrams="" (figures="" 5a="" and="" 6a,="" tables="" s1-s3)="" that="" report="" the="" distribution="" of="" proteins="" identified="" with="" a="" frequency="">1 trong các công thức hAFS-CM và có-EV được xem xét riêng biệt. Trong khi khoảng 69,5% và 69,9% protein được chia sẻ tương ứng trong các điều kiện hAFS-EV và hAFS-CM, hàm lượng còn lại xuất hiện độc quyền với các tỷ lệ khác nhau, từ 3,7% đến 13,4%, trong số các công thức.

Để kiểm tra định lượng những thay đổi về protein, một phân tích vi phân không có nhãn đã được thực hiện bằng cách sử dụng phần mềm MAProMa sản xuất tại nhà và áp dụng hai thuật toán, DAve (Trung bình sai phân) và DCI (Chỉ số tin cậy chênh lệch, đại diện cho tỷ lệ và độ tin cậy trong biểu thức vi phân, tương ứng), trên PSM của mọi protein đơn lẻ giữa hai số hạng được so sánh. Sử dụng các bộ lọc nghiêm ngặt cho DAve và DCI để tối đa hóa độ tin cậy của nhận dạng và để xem xét các protein có độ biến thiên lớn hơn mức thay đổi gấp 1,5, so sánh từng cặp giữa f-hAFS-CM so với p-hAFS-CM và của f-hAFS-EVs so với p-hAFS-EVs được tạo ra theo giai đoạn mang thai của tế bào. Tổng số 58 và 109 protein được tìm thấy biểu hiện khác biệt trong các ngăn có-CM và có-EV ở trên, (Hình S1B, C cho các chi tiết được chọn và Bảng S 2- S3 ở dạng mở rộng). Trong số này, 30 protein dẫn đến được điều hòa trong f-hAFS-CM và 28 protein được điều hòa trong p-hAFS-CM (Hình S1B); tương tự như vậy, 44 protein khác biệt dẫn đến được điều chỉnh trong f-have-EVs và 65 được điều chỉnh trong p-hAFS-EVs (Hình S1C). Đáng chú ý, các protein dẫn đến điều hòa tăng trong f-have được coi là điều hòa giảm trong p-có và ngược lại.

các giá trị được báo cáo; xem Bảng S2 để biết danh sách đầy đủ và các thông số chi tiết của các protein được báo cáo. (C) Phân tích làm giàu các quá trình sinh học của các protein được xác định với tần số ít nhất là 2 trong hAFS-CM thai nhi (bảng bên trái) và có-CM chu sinh (bảng bên phải) theo điều kiện trước tình trạng thiếu oxy tế bào. Dựa trên công cụ FunRich, các thuật ngữ bản thể học gen được hiển thị trong biểu đồ thanh báo cáo tỷ lệ phần trăm gen được làm giàu cho từng danh mục (thanh màu hồng cho-have-CMnormo, thanh màu tím cho thanh màu xanh nhạt f-hAFS-CMhypor cho p-hAFS-CMnormo, và bi xanh cho p-hAFS-CMhypo).mua cistancheChỉ các thuật ngữ bản thể học gen với Bonferroni được sửa bằng * p<0.05 are="">

Bài viết này được trích từ Int. J. Mol. Khoa học. 2021, 22, 3713. https://doi.org/10.3390/ijms22073713 https://www.mdpi.com/journal/ijms