Curcumin làm giảm sự hình thành của tế bào gốc trung mô tủy xương Canine trong quá trình mở rộng trong ống nghiệm Phần 2

Xin vui lòng liên hệoscar.xiao@wecistanche.comđể biết thêm thông tin

2.5.Autophagy Inovoloes trong việc tạo ra tác dụng bảo vệ của Cur trong cBMSC Senescence

Để khám phá ảnh hưởng của quá trình tự động nở nang do Cur gây ra đối với quá trình lão hóa cBMSC, mức độ tự động chết được điều chỉnh thông qua việc sử dụng RAP (200 nM) hoặc 3- MA (5 mM). 3- MA thực hiện một hành động ức chế đáng kể về hoạt động autophagic, được biểu hiện bằng sự điều hòa giảm đáng kể biểu hiện mRNA của protein liên kết vi ống 1 chuỗi nhẹ 3 (LC3), gen liên quan đến autophagy (ATG) 7, ATG12, và không 51- như kinase kích hoạt autophagy { {14}} (ULK1); giảm tỷ lệ biểu hiện protein liên kết vi ống 1 chuỗi nhẹ 3 loại Ⅱ / I (LC 3- I / I); và sự biểu hiện của p62 tăng lên so với nhóm chứng (Hình 5A, B). Theo đó, so với nhóm Cur, sự giảm hoạt động tự thực đã được quan sát thấy ở nhóm 3- MA cộng với Cur (Hình 5A, B). Ngược lại, sự gia tăng hoạt động tự thực đã được quan sát thấy ở nhóm RAP, bằng chứng là sự biểu hiện mRNA được điều chỉnh của LC3, ATG12 và ATG7; sự gia tăng chuyển đổi từ LC 3- I sang LC 3- II; và sự suy thoái của p62 (Hình 5A, B).

Thứ nhất, hoạt động tự thực đã được nghiên cứu một cách có hệ thống. Sự hình thành không bào tự thực (còn gọi là thực quản) được đánh giá bằng quan sát hình thái học, và kết quả chỉ ra rằng có nhiều không bào tự thực và chấm LC3 hơn trong nhóm Cur và nhóm RAP so với nhóm đối chứng, trong khi số lượng không bào tự thực giảm và ít chấm LC3 hơn được quan sát thấy trong các nhóm 3- MA và 3- MA cộng với Cur (Hình 5C, E). các nhóm 3- MA và 3- MA cộng với Cur (Hình 5D). Kết quả cho thấy Cur và RAP có tác dụng tích cực tương tự đối với việc kích hoạt autophagy và hoạt động autophagic bị ngăn chặn bởi 3- MA.kích thước dương vật cistanche,Tuy nhiên, tác động ức chế của 3- MA đối với tính năng autophagy có thể được giải cứu một phần nhờ việc sử dụng Cur.

Vui lòng bấm vào đây để biết thêm

Để xác nhận liệu autophagy có tham gia vào quy định của CB MSc lão hóa hay không, chúng tôi đã kiểm tra thêm các kiểu hình liên quan đến lão hóa sau khi thúc đẩy hoặc ngăn chặn autophagy thông qua điều trị bằng thuốc. Kết quả cho thấy rằng số lượng tế bào SA - - gal dương tính trong nhóm Cur và RAP giảm, trong khi số lượng tế bào SA - - gal dương tính tăng lên được quan sát thấy trong {{5} } Nhóm MA so với nhóm đối chứng. Đáng chú ý là số lượng tế bào SA - - gal dương tính đã tăng lên đáng kể trong nhóm 3- MA cộng với Cur so với nhóm Cur (Hình). Kết quả phân tích RT-qPCR chỉ ra rằng điều trị bằng RAP và Cur đã làm tăng mức độ biểu hiện của SOX -2 và Nanog và giảm mức độ biểu hiện của IL -6, TNF-a, p21 và p16 so với với nhóm kiểm soát. Tuy nhiên, sự ức chế autophagy của 3- MA đã điều chỉnh sự biểu hiện của p16, p21, TNF- và IL -6 (Hình 6C-E). Hơn nữa, so với nhóm đối chứng, hiệu quả hình thành khuẩn lạc của cBMSCs được tăng lên ở nhóm Cur và RAP, trong khi số lượng và kích thước của CFU-F giảm đáng kể ở nhóm 3- MA. Ngoài ra, nó được chỉ ra rằng ảnh hưởng nâng cao của Cur lên số lượng cBMSCs hình thành thuộc địa có thể bị loại bỏ thông qua điều kiện trước với 3- MA (Hình 6B).bột cistancheBằng chứng này chỉ ra rằng RAP và Cur có thể cải thiện sự lão hóa của cBMSC, trong khi 3- MA làm trầm trọng thêm sự lão hóa của cBMSC và làm giảm tác dụng có lợi do Cur gây ra.

Kết hợp lại với nhau, những kết quả này cho thấy rằng sự ức chế autophagy với 3- MA làm tăng tốc độ lão hóa của cBMSCs, trong khi việc kích hoạt autophagy với Cur và RAP làm giảm bớt sự lão hóa của cBMSC (Hình 6F). Đáng chú ý, các tác dụng bảo vệ do Cur tạo ra đã bị suy giảm do tiền xử lý với 3- MA (Hình 6F), cho thấy rằng tự động do Cur gây ra là một cơ chế phân tử tiềm năng để cải thiện sự lão hóa cBMSC.

3. Thảo luận

Các sinh vật liên tục sửa chữa các mô bị thương và làm chậm các quá trình liên quan đến lão hóa do các đặc điểm chức năng riêng biệt của MSCs cư trú rộng rãi trong các mô và cơ quan khác nhau [15]. Thật không may, tuổi tác và bệnh tật là những yếu tố quan trọng đối với sự lão hóa MSC in vivo, và sự khác biệt bên trong và bên ngoài trong môi trường tế bào đẩy nhanh quá trình lão hóa MSC trong nuôi cấy in vitro, cả hai đều ảnh hưởng tiêu cực đến khả năng ức chế miễn dịch, biệt hóa và di cư của chúng, cuối cùng làm giảm hiệu quả của bản thân. -sửa chữa và cấy ghép trong MSCs [7,14, 49-51].chiết xuất cistanche salsaOja và các đồng nghiệp chỉ ra rằng BMSC của con người ngừng tăng sinh ở giai đoạn thứ năm đến thứ chín của quá trình nuôi cấy cấp lâm sàng và biểu hiện các kiểu hình lão hóa điển hình, chẳng hạn như hình thái phì đại và phẳng, kích hoạt các chất ức chế kinase chu kỳ tế bào p16 và p21, tỷ lệ tăng sinh giảm. và hoạt động nâng cao của SA - - gal [52]. Rõ ràng, việc mở rộng trong ống nghiệm chắc chắn dẫn đến sự xuất hiện sớm của lão hóa trong MSCs, được coi là một hệ thống mô hình quan trọng cho nghiên cứu lão hóa tế bào trong ống nghiệm [42, A4, A5]. Nghiên cứu hiện tại của chúng tôi cho thấy rằng cBMSCs trước đoạn thứ 3 có hình thái đồng nhất nhưng đã được quan sát thấy trải qua một loạt thay đổi về hình thái tế bào, sinh lý và biểu hiện gen sau đoạn thứ 6 (Hình 2 và 7), phù hợp với sự lão hóa sớm .

Cistanche có thể chống lão hóa

Ngày càng có nhiều bằng chứng chỉ ra rằng kích thích dược lý là một cách tiếp cận đầy hứa hẹn để cứu MSCs khỏi quá trình lão hóa [53,54]. Với ý nghĩ này, một số hợp chất tự nhiên và tổng hợp đã được nghiên cứu rộng rãi để xác định khả năng chống viêm, chống oxy hóa và chống lão hóa của chúng trong cơ thể sống và trong ống nghiệm [15,55]. Là một hợp chất phenolic có nguồn gốc tự nhiên, Cur đã gây được sự chú ý lớn do những tác dụng có lợi của nó đối với sinh học MSC [36,37,56,57]. Tuy nhiên, các tác động phức tạp của việc phơi nhiễm Cur lên MSCs nên được xem xét cẩn thận trước khi thực hiện các nghiên cứu y sinh học khác nhau. Yang và các đồng nghiệp báo cáo rằng nồng độ cao của Cur (50 và 100 uM) có thể gây ra các tác dụng độc cấp tính ở BMSC của con người trong ống nghiệm, trong khi tiếp xúc liên tục (7 ngày) đến 10uM của Cur sẽ ức chế sự tăng sinh BMSC ở người và gây ra quá trình chết tế bào [58]. Thật thú vị, một nghiên cứu khác chỉ ra rằng điều trị bằng Cur (<20 um)for="" 5="" days="" ameliorates="" h,="" o,-induced="" oxidative="" stress="" in="" human="" adscs[56].="" additionally,="" cur="" preconditioning="" （1="" μm="" and5um）="" for="" 24="" or="" 48h="" can="" help="" to="" maintain="" cellular="" viability="" and="" improve="" the="" lifespan="" of="" rat="" adscs[36,57.="" our="" results="" demonstrated="" that="" cur(1="" um="" and="" 10="" μm）="" was="" able="" to="" maintain="" the="" viability="" of="" cbmscs="" and="" alleviate="" cbmsc="" senescence="" after="" exposure="" for="" 24="" h,="" while="" the="" colony-forming="" efficiency="" of="" cbmscs="" was="" significantly="" decreased="" at="" a="" dose="" of="" 10="" μm（figure="" 3）.="" therefore,="" the="" beneficial="" effects="" of="" cur="" （10="" umd="" may="" be="" attributed="" to="" short-term="" stimulation,="" and="" it="" can="" impair="" the="" proliferation="" potential="" of="" cbmscs="" in="" the="" long="">

Gần đây, các hoạt động sinh học của Cur đã được báo cáo rộng rãi trên các mô hình in vitro hoặc in vivo khác nhau, đặc biệt liên quan đến việc điều chỉnh các đặc tính sinh học của MSC. Hoạt động chống lão hóa của Cur đã được thảo luận thường xuyên, và Cur được phát hiện có tác dụng hữu ích đối với quá trình lão hóa và các bệnh liên quan đến tuổi tác ở cấp độ tổ chức và tế bào. Tuy nhiên, cơ chế điều chỉnh của nó rất phức tạp do liều lượng và dạng Cur khác nhau, cũng như cơ chế lão hóa [19]. Là một cơ chế nội bào chính của quá trình thoái hóa phân tử và luân chuyển bào quan, autophagy đóng một vai trò quan trọng trong việc bảo vệ MSC chống lại các điều kiện căng thẳng và duy trì cân bằng nội môi của tế bào. Việc điều biến autophagy được coi là một chiến lược mới để cải thiện các chức năng MSC [59]. Theo dữ liệu thu thập được từ các nghiên cứu quan trọng, việc Cur thúc đẩy hoặc ngăn chặn hiện tượng autophagy trong các mô hình tế bào khác nhau tạo ra các hiệu ứng bảo vệ tế bào thỏa đáng [38-40].thân cây cistancheDữ liệu của chúng tôi cho thấy sự gia tăng hoạt động autophagic được quan sát thấy sau khi tiếp xúc với Cur, được xác định bằng cách điều chỉnh các gen liên quan đến autophagy (LC3, ULK1, Atg7 và Atg12), thế hệ LC 3- II, tăng số lượng không bào autophagic và các bào quan có tính axit, và mức protein p62 giảm đáng kể (Hình 4). Ngoài ra, lysosome được coi là một bào quan không thể thiếu cho quá trình autophagy, trong khi sự rối loạn điều hòa pH của lysosome và sự thay đổi hoạt động của không bào H cộng với -ATPase (v-ATPase) đã được quan sát thấy trong quá trình lão hóa MSC, do đó thúc đẩy quá trình axit hóa lysosome và autophagy và góp phần để trì hoãn sự lão hóa MSC [60]. Yan và các đồng nghiệp chỉ ra rằng Cur có thể kích hoạt chức năng lysosome của nguyên bào sợi phôi thai chuột (MEF) và gây ra hiện tượng autophagy, đóng vai trò như một tín hiệu sống sót quan trọng [38]. Tương tự, chúng tôi quan sát thấy rằng điều trị Cur tăng cường axit hóa lysosome trong cBMSCs (Hình 4), cho thấy Cur có thể tham gia vào việc kích hoạt chức năng lysosome, điều không thể thiếu để tăng cường hoạt động tự thực.

Autophagy chủ yếu là một cơ chế bảo vệ tế bào và ngày càng có nhiều bằng chứng chỉ ra rằng các đặc tính chống lão hóa của các hợp chất tự nhiên và tổng hợp có tương quan với điều chế autophagy [29,54,61,62]. Tuy nhiên, tác động của điều chế autophagy lên sự lão hóa MSC và các cơ chế tương ứng vẫn chưa được đánh giá và khám phá đầy đủ. Các báo cáo ban đầu đã chỉ ra rằng autophagy là một cơ chế chủ yếu là bảo vệ tế bào và mức độ autophagy tăng lên có thể trì hoãn sự lão hóa của tế bào bằng cách giảm sự tích tụ của các chất chuyển hóa độc hại và phục hồi chức năng của các bào quan [63]. Điều thú vị là, các cuộc điều tra gần đây cũng đã chỉ ra rằng số lượng không bào tự thực và các protein liên quan đến quá trình tự thực (LC {7}} II, ATG7 và ATG12) tăng lên được quan sát thấy trong thời kỳ MSC lão hóa, trong khi sự ức chế quá trình tự thực với bafilomycin A1 và {{11 }} MA đã được chứng minh là làm giảm tỷ lệ phần trăm tế bào SA - - gal dương tính và biểu hiện của p16 và p21 [35]. Để làm sáng tỏ thêm mối quan hệ giữa autophagy do Cur gây ra và ảnh hưởng của nó đối với cBMSCsenescence, autophagy đã được điều chỉnh bằng cách xử lý trước với rapamycin hoặc 3- MA. Rõ ràng, hoạt động tự thực thi được 3- MA làm suy yếu, trong khi RAP và Cur (1 uM) được chứng minh là tăng cường đáng kể hoạt động tự động thực (Hình 5). Phù hợp với các báo cáo trước đây [5], các phát hiện của chúng tôi cũng chứng minh rằng sự ức chế tự động hấp thụ bởi 3- MA đã tăng tốc quá trình lão hóa tế bào trong cBMSCs. cBMSCs được hiển thị. Theo đó, khi autophagy bị ức chế bởi 3- MA, các tác dụng bảo vệ do Cur gây ra đã giảm xuống (Hình), cho thấy rằng tự động do Cur gây ra là một cơ chế phân tử tiềm năng để cải thiện sự lão hóa cBMSC (Hình 7).

Trong các điều kiện sinh lý, hiện tượng autophagy xảy ra ở mức cơ bản trong tất cả các tế bào nhân thực để duy trì cân bằng nội môi của tế bào. Tuy nhiên, các điều kiện căng thẳng khác nhau có thể dẫn đến hiện tượng autophagy bất thường, có ảnh hưởng đến số phận của tế bào trừ khi autophagy được phục hồi ở mức tối ưu [41,44,64]. Bằng chứng của chúng tôi đã xác nhận rằng tự động hấp thụ do Cur gây ra có tác dụng hữu ích trong việc điều chỉnh quá trình lão hóa cBMSC. Trong trường hợp này, các yếu tố kích thích gây căng thẳng đa dạng và các thiết lập ngoại bào cần được xem xét cẩn thận trước khi điều trị Cur, và sẽ rất thú vị khi điều tra xem liệu tự sướng do Cur gây ra có thể cải thiện một cách chọn lọc chức năng của MSCs với liều lượng và thời gian xác định trước hay không. Ngoài ra, hệ thống phân phối curcumin dựa trên công nghệ nano đã thể hiện mức độ hòa tan trong pha nước và sinh khả dụng tốt hơn [65,66]; nó có thể là một công cụ đầy hứa hẹn để trì hoãn và chống lại sự lão hóa của MSC. Câu trả lời cho câu hỏi liệu autophagy có phải là cơ chế cơ bản chính trong việc trì hoãn sự lão hóa của MSC hay không vẫn cần thêm chi tiết sẽ được cung cấp bởi các nghiên cứu trong tương lai.

4. Vật liệu và Phương pháp

4.1.Đối tượng

Các mẫu xương chân mày được thu thập từ 6 con chó cái trưởng thành khỏe mạnh ở nông thôn Trung Quốc (12- tháng tuổi). Tất cả các nghiên cứu đã được phê duyệt bởi Ủy ban chăm sóc và sử dụng động vật của Khoa Đại học Nông nghiệp Tứ Xuyên (phê duyệt số {3}}) và được tiến hành theo các tiêu chuẩn đạo đức của luật bảo vệ động vật của Cộng hòa Nhân dân Trung Hoa.

4.2. Chuẩn bị dung dịch Curcumin

Cur (HPLC Lớn hơn hoặc bằng 98 phần trăm, số CAS: 458-37-7; Solar Science & Technology Co., Ltd., Bắc Kinh, Trung Quốc) đã được hòa tan trong DMSO với nồng độ trong kho là 2 0 mmol / L. được lọc qua màng lọc vi xốp hữu cơ 0,22 μm và được bảo quản ở -80 độ. Các dung dịch Cur khác nhau được chuẩn bị trong môi trường để nghiên cứu trong ống nghiệm.

4.3. Nuôi cấy tế bào và mở rộng

cBMSCs được lấy từ tủy xương. Các tế bào được nuôi cấy trong một môi trường hoàn chỉnh bao gồm Phương tiện Đại bàng Biến đổi có hàm lượng glucose thấp của Dulbecco (LG-DMEM, Gibco Grand Island, NY, USA), 10% huyết thanh bò thai (FBS, TransGen Biotech Co., Ltd., Bắc Kinh, Trung Quốc ), và 1 phần trăm penicillin / streptomycin. Ở mức hợp lưu 80-90 phần trăm, các tế bào kết dính được giải phóng với Giải pháp tiêu hóa Trypsin (Beyotime Biotechnology Co., Ltd., Thượng Hải, Trung Quốc) và được mở rộng thêm với tỷ lệ 1: 2-1: 3 [67 ].

4.4. Curie tăng trưởng tế bào

Để xác định khả năng tăng sinh của cBMSCs trong các đoạn (P) 3,6 và 9, các tế bào đã được gieo hạt trong ba 48- đĩa giếng (2500 tế bào / giếng). Sau 48 giờ ủ, các tế bào được giải phóng bằng Dung dịch tiêu hóa Trypsin và được đếm bằng máy đo huyết cầu. Quy trình đếm tế bào được lặp lại sau mỗi 48 giờ và duy trì trong 14 ngày.

4.5 Phát hiện kiểu miễn dịch của cBMSCs bằng phương pháp đo lưu lượng tế bào

Trong đoạn thứ 3, cBMSCs được rửa sạch bằng PBS và trypsinized. Các tế bào (3 × 105 tế bào / mL) được tái đình chỉ trong đệm nhuộm và huyền phù tế bào （100 μL） được ủ với các kháng thể đơn dòng đánh dấu huỳnh quang FITC, PE hoặc APC chống lại các kháng nguyên bề mặt CD45, CD34, và ITGB1 (eBioscience, San Diego, CA, Hoa Kỳ) và CD31, CD90 và CD105 có nhãn không huỳnh quang (Công ty TNHH công nghệ sinh học tổng hợp. Bắc Kinh, Trung Quốc) trong 15 phút ở 4 độ. Các tế bào được rửa sạch bằng PBS và ủ với IgG kháng thỏ liên hợp FITC trong 15 phút ở 4 độ. Các kháng nguyên bề mặt được phát hiện bằng phương pháp đo tế bào dòng chảy (FACS Calibur, Becton Dickinson, San Jose, CA, USA). Phân tích dữ liệu được thực hiện với phần mềm CytExpert.

4.6. Thử nghiệm phân biệt trong ống nghiệm

cBMSCs được mạ ở mật độ 5 × 104 tế bào / mL trong 6- đĩa giếng. Tại hợp lưu 70-80 phần trăm, môi trường hoàn chỉnh được thay thế bằng môi trường cảm ứng biệt hóa tạo xương hoặc tạo mỡ và thay đổi 3 ngày một lần (Cvagen, Tô Châu, Trung Quốc). Sự lắng đọng canxi được phát hiện bằng phương pháp nhuộm Alizarin Red S (Solarbio, Bắc Kinh, Trung Quốc) sau 3 tuần cảm ứng tạo xương và sự tích tụ giọt lipid được quan sát bằng phương pháp nhuộm Oil Red O (Solarbio, Bắc Kinh, Trung Quốc) sau 2 tuần cảm ứng tạo mỡ.

4.7.Ảnh hưởng của Cur lên khả năng tồn tại của tế bào

Khả năng tồn tại trên tế bào của cBMSCs được xác định bằng cách sử dụng bộ CCK -8 (Vazyme Biotech Co., Ltd., Nanjing, Trung Quốc).cistanche tubulosa lợi ích và tác dụng phụcBMSCs được nuôi cấy trước trong đĩa giếng 96- trong 24 giờ. cBMSCs được xử lý bằng Cur ở các nồng độ khác nhau (0. 1, 0. 5, 1, 5, và 1 { {14}} umol / L) trong 12 giờ, 24 giờ, 48 giờ và 72 giờ. Tế bào được xử lý bằng 0,1 phần trăm DMSO, được sử dụng làm đối chứng Sau khi ủ với 10 μL dung dịch CCK -8 mỗi giếng trong 2 giờ, mật độ quang học được đo bằng đầu đọc vi tấm ở 450 nm (Thermo Scientific, Waltham, MA, Hoa Kỳ). Khả năng sống sót của tế bào tương đối được tính toán theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

4.8. Thử nghiệm hình thành khuẩn lạc

Hiệu quả tự đổi mới của cBMSCs được phát hiện bằng cách sử dụng xét nghiệm nguyên bào sợi hình thành khuẩn lạc （CFU-F. cBMSCs được gieo hạt （3 × 10² tế bào / giếng） trong 6- đĩa giếng. Sau hai tuần nuôi cấy, các tế bào được cố định với 4% paraformaldehyde trong 30 phút và được quan sát dưới kính hiển vi đảo ngược (LX73, Olympus Corporation, Tokyo, Nhật Bản) sau khi nhuộm với 1% tinh thể tím trong 10 phút. Đối với CFU-F, hơn 50 ô đã được đếm. Hiệu suất CFU-F được tính như sau:

Hiệu suất CFU-F=số lượng CFU-F / số hạt (300 tế bào) [68].

4.9. Thử nghiệm nhuộm Beta-Galactosidase

Hoạt động của men -galactosidase (SA - - gal) liên quan đến lão hóa trong cBMSCs được ước tính bằng cách sử dụng bộ nhuộm SA - - gal (Beyotime Biotechnology Co., Ltd., Thượng Hải, Trung Quốc) theo hướng dẫn của nhà sản xuất . Sau khi nhuộm, các tế bào được kiểm tra dưới kính hiển vi đảo ngược. Các tế bào nhuộm dương tính được đếm để đánh giá sự lão hóa của tế bào.

4.10. PCR định lượng thời gian thực phiên mã ngược (RT-qPCR)

RNA tổng số được chiết xuất từ ​​các viên tế bào bằng phương pháp thuốc thử Trizol. cDNA được tổng hợp bằng cách sử dụng bộ thuốc thử PrimeScriptTM RT với gDNA Eraser (Takara, Shiga, Nhật Bản). Các đoạn mồi PCR (Bảng 2) bên cạnh GAPDH tham khảo các nghiên cứu trước đây [67] được thiết kế bằng phần mềm Primer Express (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) dựa trên trình tự cDNA. QPCR được thực hiện bằng cách sử dụng TB Green PCR Mix (Takara, Shiga, Nhật Bản) trên Hệ thống phát hiện PCR thời gian thực cảm ứng CFX96 (Bio-Rad, Richmond, CA, Hoa Kỳ). Các điều kiện phản ứng như sau: 95 độ trong 3 0 s và sau đó là 39 chu kỳ 95 độ trong 5s và 60 độ trong 30 s. Một phân tích đường cong nóng chảy được thực hiện bắt đầu ở 95 độ trong 10 giây, sau đó dao động từ 65 đến 95 độ, tăng 0,5 độ mỗi chu kỳ. GAPDH được sử dụng làm kiểm soát nội bộ để chuẩn hóa tất cả dữ liệu và biểu thức tương đối được tính thông qua phương pháp Ngưỡng chu kỳ so sánh (Ct).

4.11. Theo dõi Lusosomal UIsing LysoTracker

Lyso-Tracker Red (Beyotime Biotechnology Co., Ltd., Thượng Hải, Trung Quốc) được sử dụng để theo dõi lysosome, có thể biểu hiện cường độ huỳnh quang tăng lên khi axit hóa lysosome. Chúng tôi gieo hạt cBMSCs vào 12- đĩa giếng và xử lý chúng bằng Cur trong 24 giờ, sau đó các tế bào được xử lý bằng Lyso-Tracker (60 nM) và Hoechst 33,342 (2 ug / mL) trong 20 phút. Sự phát huỳnh quang được quan sát bằng kính hiển vi huỳnh quang ngược sau khi rửa bằng PBS.

4.12. Miễn dịch huỳnh quang

Các cBMSC (2 × 1 0 4 ô / trang trình bày) được cấy vào các trang trình bày và được cố định bằng 4 phần trăm paraformaldehyde trong 30 phút. Sau khi đồng ủ với 0,5 phần trăm Triton X -100 trong 5 phút (Solarbio, Bắc Kinh, Trung Quốc), các phần được ngâm trong dung dịch chặn trong 30 phút. Chất lỏng kèm theo được loại bỏ và các tế bào được ủ với kháng thể kháng LC3B (1: 1000, Abcam, Cambridge, MA, USA) qua đêm ở 4 độ, sau đó được ủ với kháng thể thứ cấp liên hợp với fluorochrome (Abcam, Cambridge, MA, USA) trong 50 phút ở 37 độ C. Cuối cùng, các tế bào được so màu với DAPI (Công nghệ sinh học Beyotime, Thượng Hải, Trung Quốc) và theo dõi dưới kính hiển vi đồng tiêu.

4.13. Phân tích thấm nước phương tây

Các mẫu tế bào được ly giải với dịch mô và tế bào (Solarbio, Bắc Kinh, Trung Quốc) có chứa chất ức chế protease sau khi rửa bằng PBS lạnh đá. Dịch ly giải tế bào chứa 15 ug protein mỗi mẫu được nạp vào gel natri-dodecyl sulfate-polyacrylamide (SDS-PA) (Solarbio, Bắc Kinh, Trung Quốc) và được phân tách bằng điện di. Sau khi chuyển các protein lên màng polyvinylidene fluoride (PVDF), màng này bị chặn không đặc hiệu bằng sữa khô không béo 5% (Solarbio, Bắc Kinh, Trung Quốc) trong 1 giờ ở nhiệt độ phòng. Màng được ủ qua đêm với các kháng thể chính chống LC3B (1: 2 0 00, Abcam, Cambridge, MA, USA), anti-p62 / SQSTM1 (1: 4000, Novus Biologicals, Littleton, NH, USA ), và chống - - actin (1: 1000, Abcam, Cambridge, MA, USA) ở 4 độ, và các đốm màu được rửa sạch bằng TBST (Solarbio, Bắc Kinh, Trung Quốc) trước khi ủ chúng với kháng thể thứ cấp (1 : 2000, Abcam, Cambridge, MA, USA) ở 37 độ trong 1 giờ. Sau đó, các màng được phát triển bằng cách tiếp xúc với thuốc thử phát quang hóa học (Millipore, Billerica, MA, Hoa Kỳ) và được hiển thị bằng Hệ thống hình ảnh ChemiDocTM (Tanon -5200, Thượng Hải, Trung Quốc). Mật độ băng tần được định lượng bằng phần mềm Image-Pro Plus 6.0 (Media Cybernetics, Silver Spring, MD, USA) cho từng nhóm và chuẩn hóa bằng -actin.

4,14. Kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM)

Viên tế bào được tiêu hóa và thu thập vào một ống ly tâm 1,5mL, sau đó được cố định với 2,5% glutaraldehyde (Solarbio, Bắc Kinh, Trung Quốc) trong 2 giờ ở nhiệt độ phòng. Các mẫu được cố định sau bằng 1% osmium tetroxide trong 1 giờ sau khi rửa bằng PBS, sau đó chúng tôi tăng độ khử nước theo cách từng bước trong dung dịch axeton và nhúng chúng vào nhựa epoxy 812 (Công ty TNHH Công nghệ Bắc Kinh Zhongjingkeyi, Bejing, Trung Quốc). Sau đó, các phần 50 nm được thu được từ siêu microtome (EM UC7, Leica Microsystems Co., Ltd., Heidelberg, Đức). Các mặt cắt được nhuộm bằng uranyl axetat (Zhongjingkevi, Bắc Kinh, Trung Quốc) trong 10-15 phút và citrate chì (Zhongjingkei, Bắc Kinh, Trung Quốc) trong 2 phút. Tất cả các mẫu vật đều được xem trên TEM (EM -1400 PLUS, JEOL, Akishima, Tokyo, Nhật Bản).

4,15. Phân tích thống kê

Kết quả thu được từ ba thí nghiệm độc lập và tất cả dữ liệu được hiển thị dưới dạng giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn (SD). Các giá trị thống kê được phân tích bằng IBM SPSs Statistics 25 và được minh họa bằng GraphPad Prism 9. 0 (GraphPad Software, San Diego, CA, USA). Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê được xác định bằng cách sử dụng phương pháp phân tích một chiều (ANOVA) và kiểm định t của Student. giá trị p<0.05 were="" considered="" to="" be="" significant="">

5. Kết Luận

Những phát hiện của chúng tôi làm sáng tỏ mối quan hệ giữa Cur, sự lão hóa cBMSC và quá trình tự chết. Dữ liệu từ nghiên cứu của chúng tôi cho thấy Cur có thể làm giảm bớt trạng thái lão hóa của cBMSCs trong khi kích hoạt quá trình tự động và thúc đẩy quá trình axit hóa lysosome. Hơn nữa, các bằng chứng khác đã chứng minh rằng tự động chết do Cur gây ra là một cơ chế tiềm năng để cải thiện sự lão hóa cBMSC. Cur có thể là một chất kích hoạt và bảo tồn đầy hứa hẹn để cải thiện chức năng của MSC. Theo chúng tôi, tác động tích cực của Cur đối với quá trình lão hóa là không thể bỏ qua. Các nghiên cứu trong tương lai nên tập trung vào tác động của quy định Cur đối với số phận MSC để nâng cao tiềm năng điều trị của MSC trong các bệnh khác nhau, chẳng hạn như tổn thương mô và các bệnh thoái hóa và viêm nhiễm.

Bài viết này được trích từ Int. J. Mol. Khoa học. 2021, 22, 11356. https://doi.org/10.3390/ijms222111356 https://www.mdpi.com/journal/ijms