Xác định Echinacoside trong chiết xuất nước của Cistanche Herba bằng HPLC

Tóm tắt:

Mục tiêu Một phương pháp HPLC được thiết lập choxác định echinacozittrongchiết xuất nước của Cistanchethảo mộc.

Phương pháp Echinacoside được xác định bằng HPLC. Quá trình phân tách được thực hiện trên cột Inertsil ODS-SP C18 với pha động bao gồm acetonitril(A) và dung dịch axit photphoric 0,4%(B), bằng phương pháp rửa giải gradient. Bước sóng phát hiện được đặt ở 333 nm và nhiệt độ cột là 30 độ. Tốc độ dòng là 1,0 mL·phút-1 và thể tích tiêm là 10 µL. Kết quả Mối quan hệ tuyến tính của echinacoside trong phạm vi nồng độ 44.939 7-539.276 4 ug ·mL- 1 là tốt(r=0.999 8). Tỷ lệ thu hồi là 94,59%-105,31% (RSD= 2.93%,n=9). Hàm lượng echinacoside trong dịch chiết nước của cây Cistanche herba là 15,527,7,347,12,267 mg·g{29}}. Kết luận Phương pháp HPLC được thiết lập với độ lặp lại tốt là chính xác, đơn giản và khả thi. Nó phù hợp để xác định echinacoside trong dịch chiết nước của Cistanche Herba.

Từ khóa:HPLC;chiết xuất nước của Cistanche Herba; echinacoside; xác định nội dung

Cistanche Deserticola là một loại thuốc bổ truyền thống của Trung Quốc thường được sử dụng trong thực hành lâm sàng và được gọi là "nhân sâm sa mạc" [1]. Cistanche Deserticola được ghi nhận trong ấn bản năm 2015 của Dược điển Trung Quốc là thân thịt khô với lá có vảy của Cistanche Deserticola YC Ma hoặc Cistanche tubulosa (Schenk) Wight. Nó có vị ấm, ngọt và mặn, hồi về kinh thận và ruột già. Có tác dụng bổ thận dương, bổ huyết, nhuận tràng, nhuận tràng. "Thần Nông Materia Medica" nói rằng nó có thể "làm săn chắc trung tâm, nuôi dưỡng năm cơ quan nội tạng, tăng cường âm và nuôi dưỡng tinh chất". Cistanche Deserticola chủ yếu chứa phenylethanoid glycoside, iridoids và glycoside của chúng, lignans và glycoside của chúng, polysaccharides, hợp chất este và alkaloid [3]. Phenylanol glycoside là thành phần hoạt chất chính của Cistanche Deserticola. Trong số đó, echinacoside và verascoside được liệt kê trong Cistanche Deserticola trong Dược điển Trung Quốc.

Thành phần chỉ định để nhận dạng và xác định nội dung. Các nghiên cứu dược lý [4] cho thấy Cistanche Deserticola có nhiều tác dụng dược lý khác nhau như nhuận tràng, bảo vệ gan, chống loãng xương, chống oxy hóa, chống lão hóa và chống mệt mỏi. Chiết xuất nước Cistanche Deserticola có thể thúc đẩy sự biểu hiện gen protein 2 hình thái xương ở các nguyên bào xương của chuột, phosphatase kháng axit tartrate, Osteocalcin trong huyết thanh của chuột bị cắt bỏ buồng trứng và gen Smad1, mad5, biến đổi yếu tố tăng trưởng-, v.v. trong tủy xương. , có tác dụng chống loãng xương [5-6].

Echinacea có thể thúc đẩy sự tăng sinh của các nguyên bào xương và thúc đẩy sự biệt hóa của tế bào gốc trung mô tủy xương được nuôi cấy trong ống nghiệm thành các nguyên bào xương [7-9]. Trong những năm gần đây, đã có nhiều báo cáo nghiên cứu về việc xác định hàm lượng echinacoside và verascoside trong chiết xuất ethanol Cistanche Deserticola và các chế phẩm hợp chất của nó [10-12], nhưng có rất ít báo cáo về việc xác định hàm lượng các thành phần chỉ số trong Cistanche Deserticola dịch chiết nước. Trong nghiên cứu này, phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) đã được sử dụng để xác định hàm lượng echinaceaside trong dịch chiết nước của Cistanche Deserticola.

1 chất liệu

1.1 Dụng cụ

LC-20Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao AT, SPD-20Máy dò, SIL-20Bộ lấy mẫu tự động, CTO-10Lò cột ASvp, trạm sắc ký lỏng dung dịch LC, Tập đoàn Shimadzu của Nhật Bản; Cân phân tích điện tử MES125P-OCE-DU, Công ty Sartorius, Đức; Máy bơm chân không đa năng tuần hoàn nước SHZ-D (Ⅲ), Henan Yuhua Instrument Co., Ltd.; Hệ thống tuần hoàn làm mát dàn bay hơi quay RC2B SO25, dàn bay hơi quay RV 10 D S96, Công ty IKA, Đức; DK-S26

Bồn tắm nước có nhiệt độ không đổi bằng điện, Công ty TNHH Thiết bị Thí nghiệm Jinghong Thượng Hải; Máy nước siêu tinh khiết dòng UPR, Sichuan Youpu Ultrapure Technology Co., Ltd.

1.2 Dược liệu và thuốc thử

Dược liệu Cistanche Deserticola được mua từ Công ty TNHH Y học cổ truyền Trung Quốc Lĩnh Nam Quảng Châu, số lô: 1801001, 1806001, 181001. Tu Xingming, trưởng dược sĩ cổ truyền Trung Quốc tại Bệnh viện liên kết thứ ba của Đại học Y học Trung Quốc Quảng Châu, đã xác định được nó như thân thịt khô với lá có vảy của Cistanche Deserticola YCMa. Mẫu được bảo quản tại Phòng Kiểm nghiệm Thuốc của Bệnh viện Trực thuộc Số 3 của Đại học Y học Trung Quốc Quảng Châu; Chất tham chiếu Echinacea Glycoside, hàm lượng 89,7%, Viện Kiểm soát Thực phẩm và Dược phẩm Trung Quốc, số lô: 111670-

201706; acetonitril là chất tinh khiết về mặt sắc ký (Merck, Đức); metanol và axit photphoric tinh khiết về mặt phân tích (Tianjin Fuyu Fine Chemical Co., Ltd.); nước là nước siêu tinh khiết.

2 Phương pháp và kết quả

2.1 Chuẩn bị dịch chiết nước của Cistanche Deserticola

Lấy bột thô của dược liệu Cistanche Deserticola, thêm lượng nước cất gấp 1{2}} lần, đun nóng và hồi lưu để chiết hai lần, mỗi lần 1 giờ, lọc, gộp dịch lọc và cô đặc dịch lọc bằng thiết bị bay hơi quay thành hàm lượng thuốc thô là 0,100 g·mL-1 và bảo quản ở nhiệt độ 4 độ để sử dụng sau.

2.2 Điều kiện sắc ký và sự phù hợp của hệ thống

Cột sắc ký: Cột Inertsil ODS SP C18 (150 mm × 4,6 mm, 5 μm); Pha động: acetonitril (A)-0.4% dung dịch axit photphoric (B), rửa giải gradient: 0 ~ 5 phút, 17%

MỘT; 5 ~ 25 phút, 20% A; 25 ~ 30 phút, 17% A; bước sóng phát hiện: 333 nm; nhiệt độ cột: 30 độ; tốc độ dòng chảy: 1,0 mL·phút-1;

Thể tích tiêm: 10 µL. Trong các điều kiện sắc ký này, độ phân tách giữa các pic thành phần lân cận lớn hơn 1,5 và số lượng đĩa lý thuyết dựa trên đỉnh echinaceaside không được nhỏ hơn 4,000. Sắc ký đồ được thể hiện trong Hình 1.

2.3 Chuẩn bị dung dịch

2.3.1 Dung dịch chất đối chiếu Cân một lượng thích hợp chất đối chiếu echinacoside, cân chính xác, cho vào bình định mức 10 mL, thêm metanol để hòa tan và chuẩn bị dung dịch chất đối chiếu chứa 898,794 ug echinaceaside mỗi ml, 4 độ Lưu lại để sử dụng sau.

2.3.2 Giải pháp kiểm tra

Đo chính xác 2,0 mL dịch chiết nước Cistanche Deserticola, làm bay hơi đến khô trong nồi cách thủy, thêm metanol để hòa tan, pha loãng đến vạch trong bình định mức 10 mL, lắc đều và lọc bằng thu được màng vi xốp 0,22 μm.

2.4 Khảo sát mối quan hệ tuyến tính

Đo chính xác {{0}}.25, 0.50, 1.00, 2.00, 2.50, 3.00 mL dung dịch đối chiếu theo mục 2.3.1, cho vào bình định mức 5 mL, thêm metanol đến vạch và lắc đều để thu được nồng độ gradient là 44.{{17} }, 89.879 4. 179.758 8, 359.517 6, 449.397 0, 539.276 4 ug·mL-1 dung dịch đối chiếu, được lọc qua màng vi xốp 0,22 μm. Đo theo các điều kiện sắc ký trong 2.2 và ghi lại diện tích pic. Thực hiện hồi quy tuyến tính với nồng độ khối lượng của chất tham chiếu là hoành độ (X, ug·mL-1) và diện tích pic là tọa độ (Y) và thu được phương trình hồi quy: Y=13 185 .0X-32 273.0, r=0.999 8. Kết quả cho thấy echinacea có mối quan hệ tuyến tính tốt trong khoảng nồng độ 44.939 7 ~ 539.276 4 ug·mL-1.

2.5 Kiểm tra độ chính xác

Lấy dung dịch đối chiếu 539.276 4 ug ·mL- 1, bơm và đo liên tục 6 lần theo các điều kiện sắc ký trong 2.2 và ghi lại diện tích pic. Kết quả cho thấy RSD của diện tích pic echinacoside là 1,81%, cho thấy độ chính xác của thiết bị tốt.

2.6 Kiểm tra độ ổn định

Đo chính xác 2,0 mL dịch chiết nước Cistanche Deserticola, làm bay hơi đến khô trong nồi cách thủy, thêm metanol để hòa tan, pha loãng vào bình định mức 10 mL, lắc đều, lọc bằng {{ 7}}.22 μm màng vi xốp, tuân theo các điều kiện sắc ký trong mục 2.2 và đặt ở vị trí 0 và 2 tương ứng. , 4, 8, 12, 24 h đo tiêm, ghi lại diện tích pic. Kết quả cho thấy RSD của diện tích pic echinacoside là 1,16% cho thấy dung dịch thử có độ ổn định tốt trong vòng 24 giờ.

2.7 Kiểm tra độ lặp lại

Đo chính xác 2,0 mL dịch chiết nước Cistanche Deserticola và chuẩn bị song song 6 dung dịch thử theo phương pháp trong 2.3.2. Bơm mẫu để đo theo các điều kiện sắc ký trong 2.2 và ghi lại diện tích pic. Kết quả cho thấy RSD củaechinacosidenồng độ khối lượng là 1,28% cho thấy phương pháp có độ lặp lại tốt.

2.8 Thử nghiệm thu hồi mẫu

Đo chính xác 9 phần 1.0 mL chiết xuất nước Cistanche Deserticola, thêm 0.8, 1.0 và 1,2 mL dung dịch đối chiếu (1,552 mg·mL{11) }}), cho bay hơi đến khô trong nồi cách thủy, thêm metanol để hòa tan và điều chỉnh vào bình định mức 10 mL; Lắc đều và lọc qua màng vi xốp 0,22 μm để chuẩn bị dung dịch thử có nồng độ cao, trung bình và thấp. Chuẩn bị song song 3 bản sao của mỗi nồng độ. Đo theo các điều kiện sắc ký ở 2.2. Ghi lại diện tích pic và tính độ thu hồi mẫu. Tỷ lệ. Kết quả được thể hiện ở Bảng 1.

2.9 Xác định hàm lượng mẫu

Đo chính xác 3 phần 2.0 mL dịch chiết nước Cistanche Deserticola, làm bay hơi đến khô trong nồi cách thủy, thêm metanol để hòa tan, pha loãng vào bình định mức 10 mL, lắc đều, lọc bằng màng vi xốp 0,22 μm và đo theo các điều kiện sắc ký trong 2.2. Ghi lại diện tích pic và tính hàm lượng echinaceaside. Kết quả được thể hiện ở Bảng 2.

Bảng 1 Kết quả kiểm tra độ thu hồi của echinacoside

Bảng 2 Kết quả xác định hàm lượng echinacoside trong dịch chiết nước cây Cistanche Herba