Flavanol cacao ăn kiêng tăng cường chức năng của ty thể trong cơ xương và điều chỉnh sự trao đổi chất toàn bộ cơ thể ở chuột khỏe mạnh

Để biết thêm thông tin, liên lạc:tina.xiang@wecistanche.com

trừu tượng: Rối loạn chức năng ty thể được báo cáo rộng rãi trong các bệnh khác nhau và góp phần vào cơ chế bệnh sinh của chúng. Chúng tôi đã đánh giá ảnh hưởng củacacao flavanolsbổ sung vào chức năng của ty thể và toàn bộ quá trình trao đổi chất, và chúng tôi đã khám phá xem liệu chất deacetylase sirtuin -3 (Sirt3) của ty thể có liên quan hay không. Chúng tôi đã khám phá tác động của 15 ngày bổ sung CF đối với loại hoang dã và Sirt 3- / chuột. Chuyển hóa toàn bộ cơ thể được đánh giá bằng phương pháp đo nhiệt lượng gián tiếp, và một bài kiểm tra dung nạp glucose qua đường miệng được thực hiện để đánh giáSự trao đổi đường glucozo. Chức năng hô hấp của ty thể được đánh giá trong các sợi thấm nhập và hàm lượng nucleotide pyridine (NAD cộng và NADH) được định lượng. Ở loại hoang dã, bổ sung CF đã làm thay đổi đáng kể sự trao đổi chất của toàn bộ cơ thể bằng cách thúc đẩy sử dụng carbohydrate và cải thiện khả năng dung nạp glucose. Bổ sung CF gây ra sự gia tăng đáng kể khối lượng ty thể, trong khi sự thích nghi về chất đáng kể xảy ra để duy trì sản xuất H2O2 và stress oxy hóa tế bào. Bổ sung CF làm tăng đáng kể hàm lượng NAD cộng và NADH. Tất cả các hiệu ứng được đề cập ở trên đã bị loại bỏ ở chuột Sirt 3-7. Nói chung, bổ sung CF thúc đẩy quá trình trao đổi chất NAD, kích thích sự trao đổi chất của sirtuins và cải thiện chức năng của ty thể, có khả năng góp phần vào sự thích ứng chuyển hóa toàn bộ cơ thể được quan sát, với khả năng sử dụng carbohydrate cao hơn, ít nhất là một phần thông qua Sirt3.

Từ khóa: flavanols ca cao; Chuyển hóa NAD; khối lượng ti thể; Sự trao đổi đường glucozo; cơ xương

bấm vào để biết thêm thông tin

1. Giới thiệu

Ti thể là các bào quan dưới tế bào có liên quan đến nhiều chức năng của tế bào, chẳng hạn như truyền năng lượng thông qua quá trình phosphoryl hóa oxy hóa ty thể và trong quá trình sản xuất hydrogen peroxide của ty thể hoặc hoạt hóa tế bào chết qua trung gian ty thể [1-3]. Các bằng chứng mới nổi cho thấy rằng rối loạn chức năng ty thể có liên quan đến nhiều bệnh lý và đóng vai trò trung tâm trong quá trình sinh bệnh của chúng [4]. Nhóm của chúng tôi đã báo cáo tình trạng suy giảm ty thể ở bệnh nhân đái tháo đường týp 1 rất lâu trước khi có biến chứng lâm sàng [5]. Hơn nữa, sự suy giảm khả năng oxy hóa của ty thể xảy ra khi lão hóa ngay cả ở những người khỏe mạnh [6]. Do đó, việc xác định các chiến lược để giảm thiểu những rối loạn chức năng này hoặc tăng cường khối lượng ty thể là những cơ hội để ngăn ngừa, hoặc ít nhất để giảm tỷ lệ mắc nhiều chứng rối loạn hoặc tăng khả năng hiếu khí của những đối tượng khỏe mạnh.

Trong bối cảnh này, việc xác định các hợp chất an toàn và tự nhiên giúp tăng cường chức năng của ty thể và chuyển hóa toàn bộ cơ thể có hoặc không có tác dụng phụ hạn chế đang được quan tâm. Trong số các hợp chất tự nhiên,cacao flavanols(CF) được coi là các phân tử đầy hứa hẹn vì việc tiêu thụ chúng được chứng minh là có ảnh hưởng tích cực đến sức khỏe tim mạch, kháng insulin hoặc chức năng miễn dịch [7]. Thật vậy, CF đã được chứng minh là cải thiện sự chuyển hóa glucose, và việc sử dụng CF trong thời gian ngắn sẽ làm tăng độ nhạy insulin, ngay cả ở những bệnh nhân tăng huyết áp không dung nạp glucose [8,9].

Trong số các flavanol, (-) - epicatechin (EPI) là monome thường thấy nhất trong CF, và EPI được coi là phân tử có hoạt tính sinh học và hoạt tính sinh học chính của CF [10]. Một cơ sở bằng chứng nhất quán chỉ ra rằng việc bổ sung EPI cải thiện chức năng ti thể và / hoặc hàm lượng trong cơ xương [11]. Việc bổ sung EPI kích thích nhiều con đường hội tụ trên thụ thể gamma kích hoạt peroxisome kích hoạt thụ thể 1- alpha (PGCl) và các phức hợp phiên mã hạt nhân chính. EPI trực tiếp tăng cường tạo oxit nitric, kích thích quá trình sinh học ty thể [11]. Đồng thời, sirtuins 1 và 3 cũng được kích thích bằng cách bổ sung EPI [11]. Việc sử dụng proanthocyanidins, oligomericflavonoidcó chứa EPI, đã được chứng minh là làm tăng mức nicotinamide adenine dinucleotide (NAD plus) nội bào thông qua sự gia tăng của một số tiền chất cho quá trình tổng hợp NAD và điều chỉnh mức độ mRNA sirtuin -1 trong gan chuột [12]. Họ sirtuin (Sirt), một deacetylase phụ thuộc NAD, bao gồm bảy thành viên khác nhau bởi sự phân bố dưới tế bào, tính đặc hiệu của chất nền và các chức năng tế bào [13]. Sirt1, một thành viên được nghiên cứu rộng rãi của họ này, kích thích quá trình sinh học ty thể bằng cách thúc đẩy quá trình khử oxy hóa PGCl, do đó tăng cường hoạt động phiên mã của nó [14]. Sirte, một cảm biến trao đổi chất quan trọng, đã được kích thích sau khi sử dụng EPI [12, 15-17]. Tuy nhiên, ảnh hưởng của EPI đối với các loài chim sẻ khác vẫn chưa được khám phá. Việc đánh giá hiệu ứng EPI sẽ đặc biệt thú vị trên những con sirtuins nằm trong ty thể (Sirt3, Sirt 4 và Sirt5), được biết là có thể điều chỉnh hoạt động của chu trình Krebs và các enzym của chuỗi hô hấp [18]. Sirt3, được biểu hiện nhiều trong các mô có chu kỳ trao đổi chất cao và hàm lượng ti thể, được quan tâm đặc biệt liên quan đến vai trò quan trọng của nó trong việc duy trì chức năng bình thường của ty thể thông qua quá trình khử lysine protein có thể đảo ngược [19-21] Hơn nữa, Sirt3 đóng một vai trò quan trọng trong điều hòa chuyển hóa toàn bộ cơ thể [20. Sirt3 đã được chứng minh là thay đổi trong cơ xương của các mô hình bệnh tiểu đường loại 1 và loại 2 và các bệnh tim mạch [22,23]. Hơn nữa, người ta cho rằng việc kích hoạt Sirt3 có thể đại diện cho một chiến lược điều trị đầy hứa hẹn để cải thiện chức năng ty thể và sự trao đổi chất [23,24]. Do đó, việc xác định xem Sirt3 có làm nền tảng cho một phần tác dụng có lợi của việc bổ sung CF đối với sự trao đổi chất toàn bộ cơ thể và chức năng của ty thể hay không đang được quan tâm.

Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã sử dụng phương pháp tiếp cận tích hợp để điều tra tác động của việc bổ sung CF trong 15- ngày ở chuột. Chúng tôi giả thuyết rằng việc bổ sung CF sẽ: (i) điều chỉnh sự trao đổi chất toàn bộ cơ thể vàSự trao đổi đường glucozo, (ii) tăng chức năng của ty thể trong cơ oxy hóa và glycolytic trong các sợi thấm qua, và (ii) tăng cường chuyển hóa NAD. Chúng tôi cũng khám phá sự tham gia giả định của Sirt3 trong quá trình sinh học ty thể do CF gây ra và chuyển hóa toàn bộ cơ thể. Giả thuyết của chúng tôi là tác động của CF đối với sự trao đổi chất toàn bộ cơ thể và khối lượng ti thể sẽ bị loại bỏ ở chuột Sirt 3-7.

2. Phương pháp

2.1. Động vật và chế độ ăn uống

Đối với nghiên cứu này, chuột đực 129S1 / SvlmJ 10- tuần tuổi được mua từ Phòng thí nghiệm Jackson (Bar Harbour, ME, Hoa Kỳ). Để xác định xem sirtuins có liên quan đến sự thích nghi về khối lượng và chức năng của ty thể do quản lý CF gây ra hay không, chúng tôi cũng sử dụng 10- chuột đực toàn thân Sirt3 tuần tuổi trên cùng một dòng với loại hoang dã [25]. Sirt3 / chuột được sử dụng để khám phá sự tham gia của Sirt3 trong quá trình sinh học ty thể do CF gây ra và sự thích nghi chuyển hóa toàn bộ cơ thể. Những con chuột được giữ trong phòng ở nhiệt độ điều chỉnh là 23-25 độ và được kiểm soát ánh sáng (12- giờ chu kỳ sáng và tối). Các loài động vật được tiếp cận với thức ăn chow của loài gặm nhấm và ad libitum nước máy.

Sau ít nhất một tuần ở trong cơ sở động vật, động vật thí nghiệm được bổ sung CF thông qua đường uống chiết xuất tự nhiên (302,1 mg / kg thể trọng hai lần một ngày trong 15 ngày) được tiếp tục trong carboxymethylcellulose (Sigma-Aldrich, St. Louis , Mo, Hoa Kỳ). Thành phần của bột cacao được mô tả trong Bảng 1 và được lấy từ Naturex (Quart de Poblet, Tây Ban Nha). Chế phẩm đã được thiết lập bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao và 100 mg dịch chiết tương đương với trung bình 475 mg hạt kén khô. Những con chuột đối chứng nhận được một phương tiện bao gồm hàm lượng theobromine và caffein tương tự được hòa tan trong carboxymethylcellulose bằng đường miệng. Liều hàng ngày được xác định theo hướng dẫn của ngành quy đổi liều dùng cho người thành liều tương đương cho động vật dựa trên diện tích bề mặt cơ thể và chúng tôi nhân liều dùng cho người với 12,3 [26]. Gavage miệng được thực hiện bởi một kỹ thuật viên giàu kinh nghiệm.

2.2. Bộ sưu tập mô1

Hai mươi bốn giờ sau lần ngậm miệng cuối cùng, những con vật không được ăn thịt được gây mê bằng ketamine và xylazine (tương ứng: 100 và 10 mg / kg). Việc thu thập các mô được thực hiện ngay sau khi gây mê. Phần đế và phần trắng của dạ dày đã được cắt bỏ. Các mẫu hoặc được đông lạnh ngay lập tức trong nitơ lỏng và được bảo quản ở -80 độ để phân tích tiếp theo hoặc được sử dụng để chuẩn bị các sợi cơ đã được lột da.

2.3. Đánh giá hoạt động thể chất và trao đổi chất

Đo nhiệt lượng gián tiếp và hoạt động thể chất tự phát được đo bằng Hệ thống giám sát động vật trong phòng thí nghiệm toàn diện (CLAMS; Columbus Instruments, Columbus, OH, USA). Các con chuột được nuôi riêng lẻ trong các buồng ở 28 độ, với ánh sáng từ 0 7h 00 đến 19h 00 và có quyền tiếp cận với thức ăn của loài gặm nhấm và nước máy. Chuột được làm quen với lồng trao đổi chất trong ba ngày trước ngày thu thập dữ liệu đầu tiên. Việc thu thập dữ liệu được thực hiện vào ngày thứ mười lăm của lần bổ sung. Mức tiêu thụ oxy (VO2), sản xuất carbon dioxide (VCO2) và tỷ lệ trao đổi hô hấp (RER) được đo với lưu lượng khí 0. 5 L / phút và không khí mẫu là 0. 4 L / tối thiểu Phần trăm tần số tích lũy tương đối (PCRF) của RER được xác định trong khoảng thời gian 24- h như đã được Riachi et al mô tả trước đây. (2 0 0 4). Một cách ngắn gọn, PCRF được xác định bằng cách cộng tần số của mỗi điểm dữ liệu vào chuỗi tăng trước đó (từ 0,65 đến 1,20 với mức tăng 0,01) [27]. Sự linh hoạt trong trao đổi chất được xác định bởi độ dốc Hill (giá trị H) và phân vị thứ 50 (EC50) của đường cong PRCF và bằng cách đo biên độ RER trong 24 giờ (Riachi và cộng sự.2004). Hoạt động thể chất chung được theo dõi bằng cách sử dụng hệ thống cảm biến vận hành bằng chùm tia hồng ngoại phát hiện hoạt động trục x và trục z. Cả tổng số đếm (mỗi khi một chùm tia bị phá vỡ) và số lượng lưu động (mỗi khi một chùm tia mới bị phá vỡ) đều được đánh giá. Tổng số X (X-TOT) được ghi nhận khi con vật di chuyển theo chiều ngang hơn 0,5 inch và đại diện cho các hoạt động lặp đi lặp lại quy mô nhỏ, chẳng hạn như cào và chải lông. Số lượng lưu động X (X-AMB) đo chuyển động thực tế bằng cách đăng ký số đếm chỉ khi con vật phá vỡ một chùm tia mới. Tổng số Z (Z-TOT) được đăng ký khi xảy ra chuyển động thẳng đứng 1,5 inch, tức là ở phía sau (Abreu-Vieira 2016). Để ước tính carbohydrate và chất béoQuá trình oxy hóatừ VO2 và VCO2, chúng tôi sử dụng bảng thương số hô hấp nonprotein từ Péronnet và Massicotte được sử dụng trước đây trên chuột [28,29].

2.4. Tổng khối lượng cơ thể và chất béo

Tổng khối lượng chất béo và tổng khối lượng nạc được xác định ở những con chuột không được thử nghiệm bằng cách phân tích giao thoa cộng hưởng định lượng sử dụng máy phân tích cộng hưởng từ toàn thân EchoMRI (Hệ thống Y tế Echo, Houston, TX, Hoa Kỳ). Tổng khối lượng chất béo đại diện cho tổng số chất béo trong cơ thể. Tổng khối lượng nạc bao gồm chủ yếu là cơ và các cơ quan bên trong. Khối lượng cơ xương được biết là chiếm phần lớn nhất trong tổng khối lượng nạc.

2.5.Thử nghiệm dung nạp glucose qua đường miệng (OGTT)

Glycemia được đo bằng cách sử dụng một giọt máu thu được từ đuôi với máy đo đường huyết (Accu-Chek Performa, Roche, Argentina). OGTT được thực hiện trên những con chuột được nhịn ăn từ 5 đến 6 giờ. Phép đo được thực hiện vào ngày cuối cùng của lần bổ sung CF. Sau khi đo đường huyết cơ bản (thời gian O), những con chuột sau đó được tiêm cho mỗi os dung dịch glucose 20% trong nước vô trùng với liều lượng 1,5 g glucose · kg trọng lượng cơ thể -1. Đường huyết được đo ở 15, 30, 60,90 và 120 phút sau khi tiêm dung dịch glucose. Diện tích tăng dần của đường cong glucose sau đó được tính toán như một thước đo khả năng dung nạp glucose.

2.6.qRT-Phân tích PCR

The forward (F) and reverse (R) primers of the selected genes used in this study are presented in Table 2. Total RNA was obtained from pulverized frozen white gastrocnemius muscle using Trizol reagent (Invitrogen Life Technologies, Rockville, MD, USA). The purity, integrity, and quantity of RNA were evaluated using a microplate reader (Synergy H1(Biotek Instruments, Winooski, Vermont). The sample was considered pure when the ratio OD260/OD280 was>1.8. cDNA được tổng hợp từ RNA tổng số （2 μL） bằng cách sử dụng supermix phiên mã ngược iScript cho RT-qPCR (Biorad, Hercules, CA, USA). Tổng sản phẩm RT được phân tích bằng phản ứng chuỗi polymerase định lượng (PCR) sử dụng 2x Platinium SYBR Green qPCR SuperMix-UDG theo thông số kỹ thuật của nhà sản xuất (Invitrogen Lige Technologies, Burlington, Canada). Đạp xe đạt được trong xe đạp CFX96 (Biorad, Hercules, California; điều kiện: 95 độ C trong 10 phút và 40 vòng quay 95 độ trong 30 giây, 55 độ trong 45 giây và 72 độ trong 45 giây). Vào cuối mỗi lần chạy, sự vắng mặt của primer-dimer và sự hiện diện của một amplicon duy nhất được xác nhận bằng cách sử dụng đường cong nóng chảy. Các giá trị chu kỳ ngưỡng (Ct) đã được sử dụng theo phương pháp 2- A △ Ct để phân tích dữ liệu qPCR, vớiß-Actin hoặc HPRT1 như một gen quản lý 【30】. Các giá trị RT-PCR định lượng có liên quan đến các giá trị của nhóm chứng, được đặt thành 1.

2.7. Hoạt động Enzyme

Phép đo hoạt động cụ thể của phức hợp chuỗi vận chuyển điện tử và citrate synthase được thực hiện bằng phương pháp đo quang phổ như đã mô tả trước đây [31]. Cơ dạ dày ruột trắng đông lạnh nghiền thành bột (~ 30 mg) được đồng nhất với máy đồng nhất microbead rung trong 500 uL đệm đồng nhất (120 mM KCl, 20 mM HEPES, 2mM MgCl2, 1 mM EGTA và 5 mg · mL-Iof BSA , pH7,4) sau đó bổ sung 500 μL môi trường nhược trương （25 mM kali photphat và 5 mM MgCl, pH 7,2). Sau đó, các mẫu được gửi đến ba vòng của chu kỳ đông lạnh-tan băng trong nitơ lỏng. Các mẫu được ly tâm trong 10 phút ở 600 × g ở 4 độ, và phần nổi phía trên được giữ trên đá cho đến khi phân tích. Hàm lượng protein được xác định trong phần nổi ba lần bằng cách sử dụng Bộ xét nghiệm protein Pierce BCA (Thermo Scientific, Rockford, IL, USA).

Hoạt tính của citrate synthase (CS) được xác định bằng quang phổ ở bước sóng 412 nm sau khi khử 2 mM 5,5'-dithio-bis (2- axit nitrobenzoic) khi có mặt 0. 1 mM acetyl -CoA và 12 mM axit oxaloacetic trong dung dịch đệm Tris 2 0 0 mM (pH 7,4). Xét nghiệm NADH-decylubiquinone oxidoreductase (phức hợp I) nhạy cảm với rotenone được thực hiện ở bước sóng 340 nm sử dụng chất nhận 2, 3- dimethoxy -5- methyl -6- n-decyl -14- benzoquinone （ 80 μM） và NADH với tư cách là chất cho điện tử （200 μM） trong đệm Tris 10 mM （pH 8,0）. Việc bổ sung 4μM rotenone được sử dụng để định lượng hoạt tính nhạy cảm với rotenone. Hoạt động của phức hợp cytochrome oxidase IV） được thực hiện ở bước sóng 550 nm bằng cách sử dụng 10μM cytochrome c khử 10μM như một chất cho và 2,5 mM n-dodecyl-ß-maltoside để thấm qua cả hai màng ty thể trong dung dịch đệm kali phosphate 100 mM (pH 7,0).

Tất cả các thử nghiệm enzym được xác định trong ba lần và kết quả liên quan đến kết quả của nhóm đối chứng, được đặt thành 100.

2.8. Đánh giá ty thể

Quá trình hô hấp của ty thể và sản xuất H2O2 của ty thể đã được nghiên cứu tại chỗ trong các sợi thấm saponin bằng cách sử dụng cơ dạ dày trắng và cơ duy nhất|1]. Một cách ngắn gọn, các sợi được tách ra dưới kính hiển vi hai mắt trong dung dịch A ở 4 độ (tính bằng mM: 2,77 CaK2 EGTA, 7,23 K, EGTA, 6,56 MgCl2, 2 0 taurine, 0. 5 DTT, 5 { {5 0}} K-methane sulfonat, 20 imidazol, 5,7 Na2 ATP và 15 creatine-phosphate, pH 7,1) và được thấm trong dung dịch A với 50 ug · mL-Iof saponin trong 30 phút ở 4 độ. Chức năng hô hấp của ty thể được xác định trong một máy đo oxy được trang bị điện cực loại Clark (Oxygraph, Hansatech Instruments, Glasgow). Buồng chứa đầy 1 mL dung dịch B (tính bằng mM: 2,77 CaK, EGTA, 7,23 K, EGTA, 6,56 MgCl, 20 taurine, 0,5 DTT, 50 K-metan sulfonat, và 20 imidazol, pH 7,1) và sau khi ghi hàm lượng oxy cơ bản trong buồng, một gói 1-2 mg trọng lượng khô của myofibres đã thẩm thấu được đặt vào trong buồng, sau đó được đóng kín. Sau khi đọc cơ sở, các chất bổ sung sau được thực hiện tuần tự: palmitoyl carnitine và malate （160 μM∶5 mM）, glutamate （10 mM）, succinate （25 mM）, rotenone （0,5 μm）, CCCP không ghép đôi （1 μM）, antimycin -A （8 uM）, và N, N ', N'-tetrametyl-p-phenylenediamine dihydrochloride và ascorbate (0,9: 9 mM). Hô hấp được đo ở 23 độ trong điều kiện khuấy liên tục. Vào cuối mỗi phép thử, sợi được lấy ra cẩn thận khỏi ô xylographic, thấm khô và sấy khô ít nhất 24 h ở ~ 80C để xác định trọng lượng sợi. Tỷ lệ tiêu thụ O2 (JO2) được biểu thị bằng nmol O2 min -1. (Mg trọng lượng khô) -I. Tất cả các phép đo được thực hiện ít nhất là lặp lại.

Sự giải phóng H2O2 ròng do ty thể hô hấp được đo trong các bó sợi thấm qua với đầu dò huỳnh quang Amplex Red （20 μM∶excitation-phát xạ∶ 563-587 nm）, như đã mô tả trước đây [32]. Sau khi chuẩn bị các sợi thấm qua, các mẫu

dành cho phép đo H2O2 được rửa ba lần trong dung dịch đệm Z (tính bằng mM: 11 0 K-Mes, 35 KCl, 1 EGTA, 5 K2HPO4, 3MgCl, 6H2O và 0. 5 mg: mL { {14}} BSA, pH7,3 ở 4 độ). Các bó sợi ({{2 0}}. 3-1. 0 mg trọng lượng khô) được ủ ở 37 độ trong một microcuvette thạch anh có khuấy từ liên tục trong 600 uL dung dịch đệm Z (pH 7,3 ở 37C) bổ sung 1,2 U · mL-I peroxidase cải ngựa. Các kết quả đo huỳnh quang ban đầu được thực hiện trong trường hợp không có bất kỳ chất nền hô hấp ngoại sinh nào. Sau đó, các chất bổ sung sau được thực hiện tuần tự: glutamate (5 mM), succinat (5 mM), rotenone (0,5 uM), ADP (10 mM) và antimycin-A （8 μM）. Vào cuối mỗi thử nghiệm, các sợi được cẩn thận lấy ra khỏi cuvet, thấm khô và làm khô để xác định khối lượng xơ. Tốc độ sản xuất H2O2 được biểu thị bằng AU · min -1. (Mg trọng lượng khô) -I và trên mỗi công suất oxphos tương ứng với hô hấp tối đa của ty thể ở trạng thái phosphoryl hóa. Tất cả các phép đo được thực hiện ít nhất là lặp lại.

Khả năng lưu giữ canxi của ty thể (CRC) được đánh giá trong các sợi ma cơ dạ dày màu trắng như đã mô tả trước đây [33]. Tóm lại, các sợi được ủ trong một microcuvette thạch anh dưới sự khuấy liên tục trong 6 0 0 μL đệm CRC （trong mM∶250 sucrose, 10 MOPS, 0,005 EGTA và 10P; -Tris, pH7,3). Sau đó, các sợi được tiếp xúc với một xung đơn 20 nM của Ca2 cộng. Những thay đổi về nồng độ canxi ngoài tế bào được theo dõi bằng phương pháp đo flo bằng Canxi xanh 5N (1 mM: phát xạ kích thích: 505-535 nm). Độ nhạy của lỗ chân lông chuyển tiếp thẩm thấu (PTP) được đánh giá bằng cách đo thời gian cần thiết để mở PTP, và CRC được lấy làm tổng lượng Ca 'tích lũy bởi ty thể trước khi giải phóng. Vào cuối mỗi phép thử, sợi được lấy ra khỏi cuvet một cách cẩn thận, thấm khô và sấy khô để xác định khối lượng sợi. Giá trị CRC được biểu thị bằng nM của Ca2 cộng với mỗi mg trọng lượng khô.

2.9. Phân tích Western Blot

Protein từ dạ dày ruột trắng và cơ soleus được pha loãng trong bộ đệm Laemmli và được tách ra trên gel polyacrylamide đúc sẵn Mini-PROTEAN TGX 1 0 phần trăm (Biorad); một tiêu chuẩn nội bộ đã được tải trên mỗi gel. Tách điện di được thực hiện ở 2 0 0 V trong 35 phút trong bộ đệm di chuyển (25 mM TrisBase, 0. 2 M glycine và 1 phần trăm SDS (p / v)). Công nghệ Stain-Free (SF) chứa hợp chất tri halo độc quyền phản ứng với protein, khiến chúng có thể phát hiện được thông qua việc tiếp xúc với tia cực tím. Hình ảnh SF được thực hiện bằng phần mềm ChemiDoc MP Imager and Image Lab4. 0. 1 (Biorad, Hercules, California, USA) với thời gian kích hoạt vết bẩn là 5- phút và do đó, tổng số các mẫu protein đã được hiển thị. Protein sau đó được chuyển trên tấm nitrocellulose 0,2 um bằng Hệ thống truyền Turbo Trans-Blot (Biorad). Chất lượng chuyển giao được kiểm soát bằng màng hình ảnh sử dụng công nghệ SF. Sau bước chuyển, các protein cacbonyl được tạo dẫn xuất bằng cách pha loãng dinitrophenylhydrazine trong 2N HCL và cuối cùng được rửa sạch bằng metanol. Các màng được chặn bằng sữa khô không béo 5% trong nước muối đệm Tris có chứa Tween -20 (TBST: 15 mM Tris / HCl, pH7,6,140 mM NaCl và 0,05% Tween -20) cho 1 giờ ở nhiệt độ phòng. Sau đó, các màng được ủ ở 4 độ qua đêm hoặc 2 giờ ở nhiệt độ phòng với các kháng thể chính sau: kháng thể chính protein carbonyl (Anti-DNP; #STA -308, Cell Biolabs) và SOD2 (# Ab13533, Abcam). Sau ba lần rửa 10 phút trong TBST, màng được kiểm tra với các kháng thể thứ cấp cho protein carbonyl (HRP-liên hợp; #STA -308, Cell Biolabs) và SOD2 (liên kết IgG-HRP chống thỏ; # 7074, Tín hiệu tế bào) trong dung dịch ngăn chặn trong 2 giờ ở nhiệt độ phòng và cuối cùng được rửa sạch bằng TBST. Việc pha loãng các kháng thể sơ cấp và thứ cấp được tối ưu hóa cho từng kháng thể. Phát hiện hóa chất phát quang được thực hiện bằng cách sử dụng ECL Clarity (Biorad) và chụp ảnh được thực hiện với ChemiDocMP. Tất cả các hình ảnh được phân tích bằng phần mềm Image Lab 4.0.1. Bình thường hóa cường độ tín hiệu protein được thực hiện sau khi định lượng tổng mức protein tương ứng trên ảnh SF, mẫu kiểm soát và chất chuẩn nội.

2.10. Đo lường NAD

Tổng mức NAD và NADH được đo trong dạ dày ruột trắng đồng nhất bằng cách sử dụng bộ dụng cụ thương mại (#K 337-100, Biovision, Hoa Kỳ) và làm theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Tóm lại, tổng số NAD (NADt=NADt và NADH) đã được trích xuất. Đối với mỗi mẫu chiết xuất, một nửa mẫu được gia nhiệt đến 60 độ trong 30 phút để phân hủy NADt trong khi vẫn giữ nguyên NADH. Cả hai mẫu NADt và NADH đều được trộn với enzym chu trình NAD, và độ hấp thụ được đo ở bước sóng 450nm. NADt và NADH được định lượng bằng cách so sánh với đường chuẩn NADH và chuẩn hóa thành mg protein. Cuối cùng, tỷ lệ NAD cộng (NADt-NADH) với NADH đã được tính toán. Tất cả các thử nghiệm được thực hiện trong ba lần.

2.11. Số liệu thống kê

Dữ liệu được báo cáo là trung bình ± độ lệch chuẩn (SD). Độ chuẩn của dữ liệu được đánh giá bằng cách sử dụng bài kiểm tra độ chuẩn của D'Agostino-Pearson. Phân tích dữ liệu được thực hiện bằng phép thử t của Sinh viên và ANOVA hai chiều (nhóm và thời gian) cho các phép đo lặp lại, tiếp theo là bài kiểm tra sau học của Bonferroni bằng cách sử dụng Prism8.4.1 (Phần mềm GraphPad, San Diego, CA, Hoa Kỳ). Đã áp dụng mức hai mặt 5 phần trăm cho lỗi loại I.

3. Kết quả

3.1. Thành phần cơ thể và sự trao đổi chất toàn bộ cơ thể

Mười lăm ngày bổ sung CF, ở chuột kiểu hoang dã (WT), không làm thay đổi trọng lượng cơ thể (p =0. 0 91), khối lượng nạc (p =0. {24} } 73) và khối lượng chất béo được đánh giá bằng EchoMRI (p =0. 89; Hình 1A). Tỷ lệ tiêu thụ O2 được biểu thị trên mỗi khối lượng nạc cao hơn đáng kể trong chu kỳ tối (8 ± 8 phần trăm, p =0. 0 42), trong khi tỷ lệ này vẫn tương tự trong chu kỳ sáng (p =0 .392; Hình 1B.). Không có thay đổi nào trong hoạt động vận động (dữ liệu không được hiển thị). Chuột .CF cho thấy mức tiêu thụ năng lượng toàn cơ thể tăng đáng kể 15 ± 15 phần trăm (p =0. 0 42; Hình 1C) và trong lượng thức ăn (0,08 ± 0,01 so với 0,11 ± 0,01 g trên mỗi khối lượng nạc, tương ứng với nhóm CF và WT, p=0. 013, Hình 1D).

Bổ sung CF đã làm thay đổi đáng kể sự trao đổi chất toàn bộ cơ thể: tác động chính của RER cao hơn ở nhóm CF được quan sát thấy trong 24 giờ (p =0. 0 23, Hình 2A) và RER trung bình trên 12 giờ cao hơn trong nhóm CF theo chu kỳ sáng và tối (cộng 5 ± 3 phần trăm, p =0. 0 35 và cộng thêm 9 ± 4 phần trăm, tương ứng, p =0. 026). Hơn nữa, bổ sung CF thúc đẩy sử dụng carbohydrate (CHO) (51 ± 13 phần trăm năng lượng tiêu thụ phụ thuộc vào quá trình oxy hóa CHO trong nhóm CF so với 37 ± 12 phần trăm trong nhóm đối chứng trong chu kỳ ánh sáng, p =0. 108 và 71 ± 21 phần trăm trong nhóm CF so với 47 ± 24 phần trăm trong nhóm đối chứng trong chu kỳ tối, p =0. 004; Hình 2B.). Tuy nhiên, khi được biểu thị bằng kJ, không có sự khác biệt trong quá trình oxy hóa CHO và quá trình oxy hóa axit béo (CHOoxid hóa: 3,7 ± 1,4 kcal · d -1 trong đối chứng so với 4,4 ± 1,7 kcal. Khối lượng cơ thểlean -1. d -1 trong CF, p =0. 33 và quá trình oxy hóa axit béo: 2,3 ± 1,0 kcal · kiểm soát d-Iin so với 2,6 ± 0,87 kcal. khối lượng cơ thểlean -1. d {{ 50}} trong CF, p =0. 608). Phân tích PRCF của RER cho thấy sự gia tăng các giá trị EC50 trong nhóm CF (p =0, 009; Hình 2D) có nghĩa là CF gây ra sự thay đổi hướng tới việc sử dụng nhiều hơn cacbohydrat. Sự giảm độ dốc Hill được quan sát thấy trong nhóm CF (giá trị H: 25,16 ± 4,44 ở nhóm chứng so với 12,79 ± 3,96 ở nhóm CF, p<0.001). moreover,="" the="" rer="" amplitude="" over="" 24h="" was="" increased="" by="" 31±="" 31%="" in="" the="" cf="" group="" (p="0.035)." cf="" supplementation="" improved="" glucose="" tolerance="" following="" oral="" glucose="" administration="" from="" unchanged="" baseline="" blood="" glucose="" levels="" after="" an="" overnight="" fast="" (figure="" 2e,p="0.003)." the="" area="" under="" the="" capillary="" blood="" glucose="" curve="" was="" lower="" in="" the="" cf="" group(1018±135="" vs.="" 1181±="" 170="" mm·120="" min,="" p="0.005;" figure="">

3.2. Chất tạo sinh học ty thể

Chúng tôi đã thử nghiệm tác động của việc bổ sung CF đối với năng lượng của ty thể trong dạ dày ruột trắng và cơ duy nhất ở chuột WT. Hô hấp ti thể cao hơn bằng cách sử dụng chất nền IV phức tạp trong dạ dày ruột trắng và cơ duy nhất đã được quan sát (lần lượt là p =0. 004 và p =0. 028; Hình 3A, B). Không có sự thay đổi nào về tỷ lệ hô hấp CII / CI và CIV / CI được quan sát thấy (p =0. 899 và p =0. 701 đối với bệnh dạ dày trắng và p =0. 693 và p {{ 11}}. 912 cho các cơ soleus, tương ứng, dữ liệu không được hiển thị). Hơn nữa, các hoạt động tổng hợp phức hợp, I, IV và citrate đã tăng lên đáng kể trong cơ dạ dày ruột trắng (tương ứng: cộng 31 ± 27 phần trăm, p =0. 004; cộng 28 ± 38 phần trăm, p =0 .027; cộng 35 ± 38 phần trăm, p=0. 009; cộng 14 ± 13 phần trăm, p =0. 040; Hình 3C). Khả năng của ty thể để oxy hóa palmitoyl-carnitine có xu hướng tăng lên trong dạ dày màu trắng (cộng với 24 ± 12 phần trăm, p =0. 096; Hình 3D), trong khi không có sự khác biệt nào được quan sát thấy ở đế (p =0. 363). Tỷ lệ tương đối của hô hấp được kích thích bằng palmitoyl-carnitine không thay đổi khi được biểu thị theo chức năng của hô hấp phức hợp I (62 ± 11 ở nhóm chứng so với 64 ± 20 ở nhóm CF ở bệnh nhân dạ dày trắng và 70 ± 18 so với 72 ± 16 trong đế). Tiếp theo, chúng tôi khám phá độ nhạy đối với sự mở PTP do Ca cộng với gây ra trong dạ dày ruột trắng. Như thể hiện trong Hình 3E, cả thời gian mở PTP và khả năng lưu ý Ca² đều không được sửa đổi sau khi bổ sung CF (lần lượt là p =0. 608 và p =0. 943).

Đánh giá mRNA của các gen liên quan đến quá trình sinh học ty thể cho thấy 70% điều hòa mRNA NRF1, trong khi không có sự khác biệt nào được báo cáo đối với PGCl, Tfam, CS, ND1, ND2, SDHa và Cox2 (Bảng 3). Chúng tôi đã khám phá, trên một số mẫu, ảnh hưởng của việc bổ sung CF đối với các siêu đơn bội của ty thể (Hình S1, Tài liệu Bổ sung). Phân tích mật độ cho thấy rằng việc bổ sung CF làm tăng hàm lượng chất siêu tổng thể mà không cần điều chỉnh hoặc sắp xếp lại chất lượng. Thật vậy, mật độ hô hấp đã được cải thiện 58% bằng cách sử dụng đầu dò phức hợp I và phức tạp và 93% sử dụng đầu dò phức hợp I. Tương tự, hàm lượng phức I và phức III được nhúng trong siêu đơn giản cao hơn trong nhóm CF.

Bổ sung CF làm giảm phát thải ROS của ty thể. Trong khi sự phát thải H2O2 vẫn không thay đổi ở cả loài dạ dày trắng và loài soleus khi được biểu thị trên trọng lượng khô (Hình 4A, B, tương ứng), thì tốc độ đã giảm khi được biểu thị trên hàm lượng ti thể (Hình 4C). Một tác động tích cực chính của việc bổ sung CF đã được quan sát thấy trong các điều kiện khác nhau ở bệnh dạ dày ruột trắng (p<0.048; figure="" 4c).="" the="" mitochondrial="" h2o2="" emission="" was="" also="" significantly="" reduced="" when="" expressed="" peroxidative="" phosphorylation="" capacity="" assessed="" by="" state="" 4="" respiration="" using="" complex="" i+ii="" substrates="" by="" 26±13%="" in="" the="" white="" gastrocnemius="" (p="0.044)and" by="" 29±12%="" in="" the="" soleus(p="0.024;" figure="">

3.3. Dấu hiệu căng thẳng oxy hóa trong cơ xương

Mức độ căng thẳng oxy hóa protein tế bào ở chuột WT không bị ảnh hưởng bởi sự dẻo dai CF vì hàm lượng tế bào của SOD2 là tương tự trong các nhóm thí nghiệm và đối chứng ở chuột bao tử trắng và soleus (Hình 4E). Hơn nữa, không có sự khác biệt nào được quan sát thấy trong quá trình cacbonyl hóa protein ở loài dạ dày trắng và loài soleus (Hình 4F). Ngoài ra, không có sự khác biệt trong biểu hiện mRNA của catalase và MnSod được quan sát thấy sau khi bổ sung CF (Bảng 3).

3.4 Chuyển hóa.NAD

Tổng số nucleotide pyridine tăng lên sau khi bổ sung CF lên 36 ± 33 phần trăm (p =0. 012). Cụ thể, hàm lượng NAD và NADH tăng trong dạ dày ruột trắng (tương ứng là 69 ± 60 phần trăm, p {{6 }}. 026 và 29 ± 42 phần trăm, p =0. 017; Hình 5A, B) và tỷ lệ NAD cộng / NADH có xu hướng tăng trong nhóm CF (p =0. 084). Không tác động đáng kể đã được quan sát thấy đối với mRNA Sirt3 (p=0. 096), mRNA NMNAT (p=0. 094) và mRNA Sirt1 (p =0. 869; Bảng 3 ).

3.5. Phản ứng trao đổi chất trong cơ thể và tế bào sau khi bổ sung CF trong Bụi bẩn 3- / Chuột

Chúng tôi đã kiểm tra ảnh hưởng của việc bổ sung CF trên chuột Sirt {{0}}. Thành phần cơ thể như trọng lượng, khối lượng nạc và khối lượng mỡ không khác biệt giữa nhóm CF và nhóm chứng (p=0. 52, p =0. 66, p =0. 45, tương ứng; Hình 6A). Tương tự, năng lượng tiêu thụ hàng ngày không bị ảnh hưởng bởi việc bổ sung CF ({{1 0}}. 38 ± 0. {{4 0}} 1 Kcal.lean cơ thể khối lượng -1. ngày -1 trong các đối chứng so với 0. 39 ± 0. 01 khối lượng cơ thể Kcal·lean -1. ngày -1 trong CF, p =0. 502; Hình 6B). RER tương tự nhau giữa cả hai nhóm trong chu kỳ sáng và tối (p =0. 301; Hình 6C), và quá trình oxy hóa cơ chất không bị ảnh hưởng bởi việc bổ sung CF (44 ± 17 phần trăm năng lượng tiêu thụ phụ thuộc vào quá trình oxy hóa CHO trong nhóm chứng so với 50 ± 11 phần trăm ở nhóm CF trong pha sáng, p =0. 209 và 65 ± 19 phần trăm ở nhóm đối chứng so với 77 ± 21 phần trăm ở nhóm CF trong pha tối, p=0. 395; Hình 6D). Độ linh hoạt trao đổi chất được đánh giá bằng biên độ RER trong 24 giờ vẫn tương tự giữa hai nhóm (0,19 ± 0,05 ở nhóm chứng so với 0,20 ± 0,03 ở CF, p =0. 604), trong khi độ dốc PRCF giảm ở nhóm CF (Giá trị H: 17,77 ± 4,38 trong kiểm soát so với 12,79 ± 3,93 trong CF, p =0. 039).

Tiếp theo, chúng tôi so sánh ảnh hưởng của việc bổ sung CF đối với các hoạt động của enzym ty thể. Việc bổ sung CF không làm tăng hoạt tính của enzym phức hợp I, I, IV và CS ở Sirt 3- / chuột như đã quan sát trước đây ở WT (tương ứng: p =0. 623, p =0 .629, p =0. 283 và p =0. 791, Hình 6E). Hoạt động của enzym Greater của phức hợp và IV được quan sát thấy ở chuột WT so với chuột Sirt 3-7 sau khi bổ sung CF ( tương ứng: p =0. 027 và P =0. 045)

4. Thảo luận

Trong nghiên cứu này, chúng tôi cung cấp một phân tích tích hợp về tác động của việc tiêu thụ CF. Chúng tôi quan sát thấy rằng việc ăn CF mãn tính đã cải thiện hô hấp của ty thể và giảm sản xuất H2O2, được đánh giá trong môi trường myofibre của chúng, trong khi tính nhạy cảm của việc mở PTP là không thay đổi. Uống CF tăng cường trao đổi chất NAD, hỗ trợ sự tham gia của các con đường sirtuin vào quá trình thích nghi ti thể được quan sát thấy. Chúng tôi cũng quan sát thấy các thay đổi chuyển hóa toàn bộ cơ thể theo hướng có nhiều khả năng hơn để sử dụng carbohydrate làm chất nền chính cho thấy rằng sự thích nghi của ty thể có thể góp phần vào quá trình thích ứng chuyển hóa toàn bộ cơ thể được quan sát thấy.

4.1 trao đổi chất

Việc sử dụng flavanols ca cao trong chế độ ăn uống đã được xác định là một chiến lược hiệu quả để giảm bớt tình trạng không dung nạp glucose, tạo cơ hội cải thiện các bệnh chuyển hóa [34]. Kết quả của chúng tôi phù hợp với các nghiên cứu trước đó đã báo cáo sự gia tăng dung nạp glucose sau khi tiêu thụ flavanols [35,36]. Các cơ chế được đề xuất cho hiệu ứng này liên quan đến sự gia tăng sự chuyển vị của GLUT4 tới màng tế bào, sự gia tăng sự phosphoryl hóa AMPK và sự điều hòa biểu hiện gen UCP -2 trong cơ xương [8,37] . Hơn nữa, uống CF có liên quan đến cải thiện độ nhạy insulin ở người [8]. Sau 15 ngày tiêu thụ sô cô la đen, sự giảm của mô hình cân bằng nội môi đánh giá chỉ số kháng insulin được quan sát thấy ở những người khỏe mạnh đồng thời với sự gia tăng của chỉ số kiểm tra độ nhạy insulin định lượng và chỉ số nhạy cảm với insulin [8]. Chúng tôi cũng quan sát thấy sự gia tăng đồng thời khả năng dung nạp glucose và sự linh hoạt trong trao đổi chất ở chuột WT, điều này đề cập đến khả năng của một sinh vật để thích ứng với quá trình oxy hóa nhiên liệu đối với sự sẵn có của nhiên liệu [38]. Điều thú vị là, trong khi khả năng oxy hóa ty thể bị suy giảm và quá trình oxy hóa chất nền liên quan có liên quan đến kháng insulin 39, thì việc luyện tập sức bền lại làm tăng hàm lượng ty thể, độ nhạy insulin và sự linh hoạt trong trao đổi chất [38]. Do đó, các kết quả hiện tại là cụ thể cho việc bổ sung CF và không bị ảnh hưởng bởi hoạt động tự phát.

Tác động tích cực của CF đối với tính linh hoạt của quá trình trao đổi chất, cũng như sự gia tăng hoạt động của phức hợp ty thể, đã bị loại bỏ ở chuột Sirt 3-7, cho thấy rằng tác động tích cực của CF xảy ra ít nhất một phần thông qua Sirt3. Những kết quả này hỗ trợ những phát hiện trước đây và vai trò quan trọng của Sirt3 đối với việc điều chỉnh tính linh hoạt của quá trình trao đổi chất [24]. Kết quả của chúng tôi cho thấy rằng sự gia tăng chức năng của ty thể có thể tăng cường sự linh hoạt của quá trình trao đổi chất. Tuy nhiên, bên cạnh chức năng của ty thể, thương số hô hấp cơ bản, tốc độ thải glucose, khả năng lưu trữ lipid của mô mỡ và nồng độ axit béo tự do trong huyết tương cũng được xác định là các yếu tố quyết định tính linh hoạt của quá trình trao đổi chất và cần được xem xét [40]. Các nghiên cứu trong tương lai nên đánh giá sâu hơn các yếu tố quyết định tế bào của sự linh hoạt trao đổi chất để hiểu sâu hơn về nguyên nhân cơ bản của việc tăng cường sự linh hoạt của quá trình trao đổi chất sau khi bổ sung CF.

Đánh giá chuyển hóa toàn bộ cơ thể cho thấy sự gia tăng oxy hóa CHO tương đối sau khi bổ sung CF. Kết quả này trái ngược với một nghiên cứu trước đó báo cáo sự gia tăng phân giải lipid sau khi uống flavanols cấp tính hoặc bổ sung flavan -3- ols trong hai tuần ở chuột [36]. Bên cạnh sự khác biệt về thành phần chiết xuất, những phát hiện mâu thuẫn này có thể là kết quả của các tác động toàn thân của NO. Người ta cũng chấp nhận rằng uống CF kích thích sản xuất hoặc sinh khả dụng của chuyển hóa NO [7]. Một mặt, NO kích thích vận chuyển và hấp thu glucose trong cơ xương. Sự kích thích sản xuất NO trong các myotubes có nguồn gốc từ dòng tế bào bằng insulin hoặc hydrogen peroxide dẫn đến tăng chuyển vị GLUT4, điều này bị giảm khi ức chế nNOS [41]. Hơn nữa, NO có thể làm tăng vận chuyển glucose theo con đường không phụ thuộc insulin, dẫn đến tăng mức độ chu kỳ GMP và AMPK [42], thúc đẩy quá trình oxy hóa glucose trong cơ xương chuột mà không phụ thuộc vào sự sẵn có và oxy hóa axit béo [43]. Mặt khác, NO thúc đẩy quá trình oxy hóa axit béo bằng cách giảm mức độ malonyl-CoA thông qua sự ức chế acetyl-CoA carboxylase và kích hoạt malonyl-CoA decarboxylase trong cơ xương [44]. Trong khi chúng tôi quan sát thấy sự thay đổi theo tỷ lệ tương đối thấp hơn để sử dụng axit béo làm chất nền với CF, không có sự khác biệt nào về các giá trị tuyệt đối được biểu thị bằng kJ. Điều này cho thấy rằng sự gia tăng chi tiêu năng lượng được quan sát khi bổ sung CF phụ thuộc vào sự gia tăng quá trình oxy hóa glucose. Do đó, những kết quả này ủng hộ ý tưởng rằng tiêu thụ CF làm tăng độ nhạy insulin và thúc đẩy quá trình oxy hóa glucose mà không đồng thời ảnh hưởng đến khả năng oxy hóa axit béo. Những kết quả này đặt ra câu hỏi về sự phù hợp của việc sử dụng flavanols ca cao trong bối cảnh của một chế độ ăn nhiều chất béo. Các nghiên cứu trong tương lai nên đánh giá tác động có hại có thể xảy ra của mối liên quan giữa việc bổ sung CF và chế độ ăn nhiều chất béo.

4.2 Chức năngMitochondrial

Chế độ ăn uống chứa flavanols ca cao đã được chứng minh là cải thiện chức năng của ty thể, bao gồm (i) quá trình hô hấp của ty thể và các hoạt động của chuỗi vận chuyển điện tử; (i) sự giải phóng H2O2 của ty thể, phản ánh sự sản xuất oxy phản ứng của ty thể (ROS); và (i) khả năng lưu giữ canxi của ty thể phản ánh tính nhạy cảm với việc mở lỗ chuyển tiếp tính thấm của ty thể (mPTP) (để xem lại, xem [11]. Kết quả của chúng tôi phù hợp với các nghiên cứu trước đây; tuy nhiên, nghiên cứu của chúng tôi là nghiên cứu đầu tiên đánh giá tác dụng của Bổ sung CF đối với chức năng của ty thể được đánh giá tại chỗ trong sợi thấm nhập và trong các loại cơ khác nhau. Không giống như các nghiên cứu trước đây về ty thể cô lập, việc đánh giá chức năng của ty thể trong sợi thấm nhập bảo tồn hình thái ty thể, tương tác chức năng với các thành phần nội bào khác [1] và tránh cấu trúc của ty thể Sự gián đoạn trong quá trình phân lập ty thể [32]. Do đó, điều quan trọng là phải nghiên cứu chức năng của ty thể trong các chế phẩm mô nơi cấu trúc ty thể được bảo tồn và tất cả các nhóm ty thể được đại diện để đánh giá tốt hơn đáp ứng với điều trị.

Các nghiên cứu trước đây được thực hiện trong nuôi cấy tế bào hoặc in vivo ở chuột đã chỉ ra rằng việc bổ sung EPI, được coi là phân tử hoạt tính sinh học chính trong CF, làm tăng hô hấp kích thích ADP tối đa (ví dụ: hô hấp ở trạng thái 3) khi ty thể được cung cấp năng lượng với sự kết hợp của năng lượng chất nền nuôi các vị trí khác nhau dọc theo chuỗi hô hấp [45-49]. Phù hợp với những kết quả này, chúng tôi đã quan sát thấy tác dụng chính của việc bổ sung CF đối với quá trình hô hấp của ty thể trong các cơ oxy hóa và glycolytic. Để xác định xem sự gia tăng này có liên quan đến sự gia tăng khối lượng của ty thể hay sự tái tạo lại các phức hợp hô hấp của ty thể, chúng tôi đã đánh giá các siêu đơn vị của ty thể từ cơ tứ đầu. Các cấu trúc siêu phân tử này được cho là làm giảm sản xuất ROS, ổn định hoặc hỗ trợ việc lắp ráp các phức hợp riêng lẻ, điều chỉnh hoạt động của chuỗi hô hấp và ngăn chặn sự kết tụ protein ở màng trong ty thể giàu protein [50-52]. Mặc dù có một số biện pháp hạn chế, phân tích trực quan kết quả (Tài liệu bổ sung) cho thấy rằng việc bổ sung CF gây ra sự gia tăng khối lượng ty thể, thể hiện bằng sự gia tăng ở tất cả các loài siêu đơn bội, thay vì tái tổ chức chuỗi hô hấp cụ thể. Nói chung, những kết quả này gợi ý rằng CF thúc đẩy sự gia tăng khối lượng ti thể mà không có sự thích nghi về chất của sự sắp xếp phức tạp của chuỗi hô hấp.

Trong quá trình hô hấp của ty thể, một lượng superoxide thay đổi được hình thành và có thể được chuyển hóa để tạo thành các loại ROS khác [53]. Mặc dù việc sản xuất quá nhiều ROS từ ty thể có liên quan đến một loạt bệnh lý, nồng độ sinh lý thấp của ROS có thể có những tác dụng có lợi, chẳng hạn như bảo vệ chống lại các tác nhân lây nhiễm và tham gia vào tín hiệu tế bào [2,54]. Các nghiên cứu trước đây được thực hiện in vivo ở loài gặm nhấm và người và các mô hình nuôi cấy tế bào đã báo cáo tác dụng bổ sung CF có lợi đối với việc sản xuất ROS và các hệ thống chống oxy hóa khác nhau [11]. Ví dụ, ngậm miệng với EPId trong 15 ngày làm tăng hoạt động của SOD2 và catalase ở cơ tứ đầu của chuột [17]. Trong khi sản xuất ROS của ty thể chưa được đánh giá rộng rãi, chúng tôi quan sát thấy rằng mức sản xuất ROS tương tự nhau khi các giá trị được thể hiện trên trọng lượng cơ, trong khi sản xuất được giảm xuống khi thể hiện trên khối lượng ty thể, cho thấy rằng sự thích nghi về chất xảy ra để duy trì nồng độ sinh lý của ROS. Hơn nữa, chúng tôi không quan sát thấy bất kỳ ảnh hưởng nào của CF đối với SOD2 cũng như các thiệt hại do ROS gây ra được đánh giá bằng quá trình cacbonyl hóa protein. Trong khi CF tăng cường các nguồn protein chống oxy hóa, bao gồm cả mức SOD2 và catalase được báo cáo rộng rãi [16,17,55], sự thích ứng này không phải lúc nào cũng liên quan đến việc giảm các thiệt hại do ROS gây ra [56-59]. Những dữ liệu này ủng hộ lý thuyết rằng mức sản xuất ROS thấp là cần thiết để cân bằng nội môi tế bào bình thường [2]. Nói chung, những kết quả này cho thấy rằng, đồng thời với sự gia tăng khối lượng ty thể, CF thúc đẩy sự thích nghi về chất của ty thể để tăng cường khả năng chống oxy hóa của nó và duy trì mức sản xuất ROS thấp.

4.3.Phát sinh sinh học vật chất

Khối lượng ti thể là kết quả của sự tác động lẫn nhau giữa quá trình sinh học ti thể và quá trình nguyên phân. Nghiên cứu của chúng tôi tập trung vào quá trình sinh học ty thể được kích hoạt bằng cách tiêu thụ polyphenol [60]. Quá trình sinh học ty thể là quá trình tế bào cải thiện khối lượng ty thể. Quá trình phức tạp và được điều chỉnh cao độ này liên quan đến một số yếu tố phiên mã, các thụ thể hormone hạt nhân và các chất điều hòa phiên mã hoạt động chung để điều phối những thay đổi trong biểu hiện của các gen mã hóa DNA hạt nhân và ty thể [61]. Các nghiên cứu trước đây đã cố gắng xác định (các) con đường nào có thể làm cơ sở cho quá trình sinh học ty thể do bổ sung CF gây ra. Kích thích tín hiệu phụ thuộc NO đã nổi lên như một con đường trung tâm liên quan đến quá trình sinh học ty thể. Bổ sung CF giúp tăng cường tạo NO bằng cách ức chế arginase enzyme phân giải arginine, làm tăng sự sẵn có của L-arginine cho quá trình sinh tổng hợp NO [62,63]. Hơn nữa, sử dụng chất ức chế eNOS, tác dụng kích thích của epicatechin đối với quá trình sinh học ty thể đã bị giảm bớt một phần [17]. Những kết quả này cho thấy sự tham gia của các con đường tín hiệu khác để kích thích quá trình sinh học ty thể.

Gần đây, Aragones et al. (2016) báo cáo rằng proanthocyanidins trong chế độ ăn uống, thành viên của họ polyphenol, tăng cường trao đổi chất NAD cộng với gan bằng cách tăng cường con đường sinh tổng hợp de now o NAD và hoạt động Sirte phụ thuộc vào liều lượng ở chuột [12]. Hơn nữa, gan xuất tiền chất NADt đến các cơ quan khác, chẳng hạn như cơ xương, có khả năng tổng hợp NAD thấp hơn, làm tăng khả năng mở rộng các tác động quan sát được ở gan đến toàn bộ cơ quan [64]. Trong khi một số nghiên cứu báo cáo ảnh hưởng của việc bổ sung CF đối với hàm lượng, hoạt động hoặc mRNA của protein Sirt1 [12, 15-17, 65,66], thì sự tham gia của quá trình chuyển hóa NAD trong quá trình sinh học ty thể sau khi tăng cường CF sử dụng mất hoặc tăng chức năng chưa bao giờ được kiểm tra. Mặc dù một cú knock-out dành riêng cho cơ sẽ thích hợp hơn những con chuột Sirt3 KO toàn thân được sử dụng trong nghiên cứu của chúng tôi, nhưng kết quả của chúng tôi cho thấy rằng CF cải thiện sự trao đổi chất NAD và Sirt3 tham gia vào việc cải thiện hoạt động chuỗi vận chuyển electron ty thể do bổ sung này gây ra. Những tác động tích cực được quan sát thấy đối với hoạt động của phức hợp ty thể sau khi bổ sung CF không được quan sát bằng cách sử dụng chuột Sirt 3-7 và hoạt động phức hợp I và IV nhiều hơn đã được quan sát thấy sau khi chỉ bổ sung CF trong WT. Những quan sát này mở rộng các công trình trước đây cho thấy rằng Sirt3 đóng một vai trò quan trọng trong chức năng của ty thể] 67. Nói chung, những phát hiện này cho thấy rằng sirtuins, thông qua việc điều chỉnh quá trình trao đổi chất NAD, có liên quan đến sự cải thiện khối lượng ty thể được quan sát thấy sau khi bổ sung CF. 4.4.Limits

Hạt ca cao bao gồm hỗn hợp các flavanol đơn chất, oligome và cao phân tử. Trong số các flavanol, EPI dường như là monome polyphenol dồi dào nhất được tìm thấy trong các sản phẩm ca cao, chiếm tới 35% hàm lượng polyphenol [68]. EPI được thành lập như là phân tử hoạt tính sinh học chính mang lại lợi ích cơ bản cho việc bổ sung ca cao và sô cô la [47,69]. Tuy nhiên, các chất chuyển hóa EPI (EPIm) có thể tham gia vào các tác dụng sinh học gây ra EPI được quan sát thấy trong các nghiên cứu in vivo. EPIm có thể đạt nồng độ trong huyết tương cao hơn EPI [70]. Hơn nữa, sự khác biệt chính về EPIm đã được quan sát thấy giữa các loài. Thật vậy, 80% EPIm hiện diện ở người không được phát hiện ở chuột, trong khi sự tương đồng giữa chuột và người được tìm thấy thuận lợi hơn một chút khi hai chất chuyển hóa chính của con người được phát hiện [70]. Chúng tôi đã sử dụng chiết xuất CF được làm giàu có chứa EPI gấp 5 lần so với hạt ca cao chưa lên men [71]. Hơn nữa, hàm lượng EPI đã giảm 10-20 phần trăm khi lên men và giảm phụ thuộc vào nhiệt độ trong quá trình rang [71,72]. Nói chung, những dữ liệu này cho thấy rằng chỉ nên chú ý đến nội dung EPI khi đánh giá lợi ích của việc bổ sung EPI đối với sức khỏe con người và các kết quả hiện tại nên được xem xét thận trọng trước khi ngoại suy các cơ chế cơ bản quan sát được ở người.

5. Kết Luận

Bổ sung CF hàng ngày trong 15 ngày dẫn đến cải thiện chức năng ty thể trong các cơ oxy hóa và glycolytic. Các kết quả hiện tại cho thấy rằng quá trình hô hấp của ti thể tăng lên dẫn đến khối lượng ti thể tăng lên trong khi mức độ sản xuất ROS của tế bào được duy trì, cho thấy sự thích nghi về chất trong ti thể. Cùng với tác động tế bào lên chuyển hóa NO được mô tả trước đây [73], CF điều chỉnh chuyển hóa NAD, kích thích hoạt động của sirtuins. Sirt3 đóng một vai trò trung tâm trong sự thích nghi của ty thể và sự linh hoạt của quá trình trao đổi chất sau khi bổ sung CF. Vì sirtuins gần đây là mục tiêu trong cơ chế bệnh sinh khác nhau, chẳng hạn như bệnh tiểu đường hoặc hen suyễn [74,75l, các nghiên cứu sâu hơn sẽ khám phá mối quan tâm tiềm năng của việc sử dụng CF như một chất kích hoạt tự nhiên của sirtuins.

Người giới thiệu

1. Kuznetsov, AV; Veksler, V .; Gellerich, FN; Saks, V; Margreiter, R .; Kunz, WS Phân tích chức năng ti thể tại chỗ trong các sợi cơ, mô và tế bào đã được thẩm thấu. Nat. Protoc. 2008, 3, 965–976. [CrossRef]

2. Sena, LA; Chandel, NS Các vai trò sinh lý của các loài oxy phản ứng ti thể. Mol Ô 2012, 48, 158–167. [CrossRef]

3. Wacquier, B.; Combettes, L.; Vân Nhiêu, GT; Dupont, G. Tác động qua lại giữa Dao động cộng với Ca2 nội bào và Ca2 cộng với chuyển hóa ti thể được kích thích. Khoa học. Phiên bản 2016, 6, srep19316. [CrossRef]

4. Suomalainen-Wartiovaara, A.; Battersby, BJ Bệnh ti thể: Sự đóng góp của phản ứng căng thẳng của bào quan đối với bệnh lý. Nat. Linh mục Mol. Biol tế bào. 2018, 19, 77–92. [CrossRef]

5. Này, E .; Daussin, F.; Wieczorek, V .; Caiazzo, R.; Matran, R.; Berthon, P.; Nhà đấu giá, J .; Berthoin, S.; Descatoire, A.; LeClair, E.; et al. Cung cấp và sử dụng oxy cho cơ ở bệnh tiểu đường loại 1, từ không khí xung quanh đến chuỗi hô hấp ti thể: Có một bước giới hạn nào không? Chăm sóc Đái tháo đường 2020, 43, 209–218. [CrossRef]

6. Daussin, FN; Boulanger, E.; Lancel, S. Từ ti thể đến chứng giảm co thắt: Vai trò của quá trình viêm và hàm ý của trục phối tử RAGE. Hết hạn. Gerontol. 2021, 146, 111247. [CrossRef] [PubMed]

7. Katz, ĐL; Nhân đôi, K.; Ali, A. Cacao và Sôcôla trong Sức khỏe và Bệnh tật của Con người. Chất chống oxy hóa. Tín hiệu oxy hóa khử. 2011, 15, 2779–2811. [CrossRef] 8. Grassi, D.; Lippi, C.; Necozione, S.; Desideri, G.; Ferri, C. Dùng sô cô la đen trong thời gian ngắn theo sau là sự gia tăng đáng kể độ nhạy insulin và giảm huyết áp ở những người khỏe mạnh. Là. J. Clin. Nutr. 2005, 81, 611–614. [CrossRef] [PubMed]

9. Grassi, D.; Desideri, G.; Necozione, S.; Lippi, C.; Casale, R .; Rightzi, G .; Blumberg, JB; Huyết áp Ferri, C. Giảm và Tăng độ nhạy cảm với insulin ở những đối tượng không dung nạp glucose, tăng huyết áp sau 15 ngày tiêu thụ sô cô la đen có hàm lượng polyphenol cao. J. Nutr. 2008, 138, 1671–1676. [CrossRef]

10. Ottaviani, JI; Mẹ, TY; Heiss, C.; Kwik-Uribe, C.; Schroeter, H.; Keen, CL Cấu hình lập thể của flavanol ảnh hưởng đến mức độ và sự chuyển hóa của flavanol ở người và hoạt động sinh học của chúng trong cơ thể sống. Radic miễn phí. Biol. Med. 2011, 50, 237–244. [CrossRef] [PubMed]