Độc tính thời gian thận khác nhau của bromobenzene và các chất chuyển hóa trung gian của nó ở chuột

Bromobenzene (BB) được biết là mối đe dọa nghiêm trọng đối với sức khỏe con người. Trước đây chúng tôi đã chứng minh rằng BB cho thấy độc tính theo thời gian, nghĩa là dao động hàng ngày về mức độ nghiêm trọng của nhiễm độc gan gây ra ở chuột. Mặc dù BB cho thấy độc tính thận nhẹ, một sự dao động hàng ngày đã không được quan sát thấy trong độc tính này. Điều này có thể được quy cho thực tế là độc tính thời gian do BB gây ra chỉ được quan sát thấy ở gan chứ không phải ởthậnvà rằng thiệt hại do BB gây ra là nổi bật ở gan, che giấu sự biến động hàng ngày của độc tính thận. Để xác nhận hai khả năng này, chúng tôi đã kiểm tra sự dao động hàng ngày của độc tính trên thận do các chất chuyển hóa trung gian BB nhắm vàothận: 3-bromophenol, bromohydroquinone, và 4-bromocatechol. Chuột được tiêm 3-bromophenol, bromohydroquinone hoặc 4-bromocatechol trong phúc mạc tại sáu thời điểm khác nhau trong một ngày (thời gian zeitgeber (ZT): ZT2, ZT6, ZT10, ZT14, ZT18 hoặc ZT22). Tỷ lệ tử vong được theo dõi trong 7 ngày sau khi tiêm. Chuột nhạy cảm hơn với độc tính cấp tính của các chất chuyển hóa này xung quanh phơi nhiễm ZT14 (pha tối) hơn là tiếp xúc với ZT2 (pha sáng). Hơn nữa, những con chuột được dùng với liều 4-bromocatechol không gây chết người cho thấy sự gia tăng đáng kể nồng độ nitơ urê máu trong huyết tương vàThậnmalondialdehyd khi tiếp xúc với ZT14. Hơn nữa, glutathione peroxidase-4, một chỉ số ferroptosis, đã bị suy giảm khi tiếp xúc với ZT14. Những kết quả này cho thấy độc tính của các chất chuyển hóa BB cao hơn trong quá trình tiếp xúc với pha tối và chứng minh lý do tại sao sự biến đổi ban ngày của độc tính trên thận của BB không được quan sát thấy trong báo cáo trước đây của chúng tôi làThậnthiệt hạiđã bịt mặt nạ do tổn thương gan nghiêm trọng.

Bấm vào Cistanche tubulosa Viên nén cho bệnh thận

Từ khóa bromobenzene; biến thể ban ngày; nhịp sinh học; độc tính theo thời gian;thận

GIỚI THIỆU

Bromobenzene (BB) là một thuốc thử công nghiệp nói chung thường được sử dụng làm nguyên liệu thô để tổng hợp dược phẩm, thuốc nhuộm và thuốc trừ sâu.1,2) BB là một chất ô nhiễm hữu cơ gây hại cho môi trường tự nhiên và gây ra mối đe dọa nghiêm trọng cho sức khỏe con người. Một nghiên cứu nói rằng BB gây độc gan nặng và nhẹThậnđộc tính ở chuột.3) Mặc dù bản thân BB, một dạng không chuyển hóa, có độc tính thấp, các chất chuyển hóa trung gian của nó có tác dụng độc hại đối với gan vàthận. CYP450s gan, chẳng hạn như CYP1A2, CYP1B1 và CYP2E1, chuyển hóa BB thành bốn chất chuyển hóa: 3-bromophenol (3-BrP), bromohydroquinone (BrHQ), 4-bromocatechol (4-BrC) và BB-3,4-oxide. BB-3,4-oxide thể hiện độc tính gan cao và các chất chuyển hóa khác cho thấy độc tính trên thận,4–6) chỉ ra rằng các chất chuyển hóa này có các cơ quan đích khác nhau.

Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã nhắm mục tiêu "độc tính theo thời gian" như chúng tôi đã đề xuất trước đây mối quan hệ giữa thời gian dùng thuốc và mức độ nghiêm trọng độc tính của hóa chất.7–9) Nghiên cứu trước đây của chúng tôi đã chứng minh những dao động đáng chú ý hàng ngày về mức độ nghiêm trọng của các phản ứng độc hại đối với BB ở chuột, tức là, chuột chịu được tổn thương gan do BB gây ra trong quá trình phơi nhiễm pha tối (2:00) so với khi tiếp xúc với pha ánh sáng (14:00).8) Mặc dù BB cho thấy độc tính thận nhẹ, chronotoxicity không được quan sát thấy trongthận. Do đó, độc tính thời gian do BB gây ra có thể chỉ được quan sát thấy ở gan chứ không phải ở ganthận. Trong nghiên cứu trước đây của chúng tôi, streptomycin, một loại kháng sinh được biết là gây ra độc tính thận xác định, cho thấy sự thay đổi rõ ràng ban ngày trong độc tính thận gây ra ở chuột.9) Dựa trên dữ liệu có sẵn, chúng tôi đưa ra giả thuyết rằng độc tính theo thời gian do BB gây ra là nổi bật ở gan hơn là ở gan chứ không phải ở ganthận, do đó che giấu sự độc tính thời gian trong cơ quan sau. Các chất chuyển hóa của BB được tạo ra thông qua các con đường trao đổi chất khác nhau xảy ra ở nồng độ thấp và do đó có thể góp phần gây tổn thương thận không đáng kể; Do đó, không thể ước tính độc tính trên thận do chất chuyển hóa BB gây ra trên lâm sàng. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã kiểm tra sự biến đổi ban ngày trong độc tính trên thận của các chất chuyển hóa trung gian BB: 3-BrP, BrHQ và 4-BrC (Hình 1).

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

Điều trị động vật

Chuột ICR đực được mua từ Japan SLC Inc. (Shizuoka, Nhật Bản) và được duy trì trong điều kiện tiêu chuẩn về nhiệt độ được kiểm soát (24 ± 1 °C), độ ẩm (55± 5%) và ánh sáng (chu kỳ sáng / tối 12: 12 giờ, đèn sáng lúc 08: 00), với quyền truy cập miễn phí vào nước và thức ăn. Các phương pháp điều trị thử nghiệm đã được tiến hành bằng cách sử dụng động vật 7 tuần tuổi. Sau khi hoàn thành các thí nghiệm, những con chuột còn sống sót đã bị hy sinh bằng cách sử dụng pentobarbital. Tất cả các thí nghiệm đã được phê duyệt bởi Ủy ban Thử nghiệm và Chăm sóc Động vật Thể chế của Đại học Kinjo Gakuin.

Giao thức thử nghiệm

Đối với xét nghiệm tử vong, chuột ICR đực 7 tuầnold được tiêm một mũi trong phúc mạc (tức là) 500 mg/kg 3-BrP, 180 mg/kg BrHQ, hoặc 220 mg/kg 4-BrC (với thể tích 0,1 mL/10 g trọng lượng cơ thể; Tokyo Kasei Corp, Tokyo, Nhật Bản). Liều lượng này được quyết định theo giá trị LD50 trong bảng dữ liệu an toàn cho mỗi hóa chất. Để tiêm mỗi chất chuyển hóa, chuột được chỉ định vào sáu nhóm năm động vật mỗi nhóm. Các chất chuyển hóa BB được sử dụng tại sáu thời điểm khác nhau (thời gian đồng hồ: 10:00, 14:00, 18:00, 22:00, 02 : 00 và 06: 00), được mô tả là thời gian zeitgeber (ZT): ZT2, ZT6, ZT10, ZT14, ZT18 và ZT22, tương ứng. Chuột điều khiển nhận được cùng một khối lượng nước muối. Tỷ lệ tử vong được theo dõi trong 7 ngày sau khi tiêm.

Để phân tích các biến thể sinh học trongThậnChấn thương, chuột ICR đực 7 tuần tuổi (5–9 con chuột) được tiêm i.p. 165 mg / kg 4-BrC tại ZT2 hoặc ZT14. Chuột điều khiển đã nhận được cùng một lượng nước muối như mô tả ở trên. Động vật đã được an tử bằng cách sử dụng pentobarbital, và các mẫu huyết tương của chúng được thu thập 24 giờ sau khi tiêm. Các mẫu huyết tương thu được được lưu trữ ở -80 °C. Cácthậntrong số tất cả các loài động vật đã được thu hoạch và bảo quản ở nhiệt độ −80 °C.

Nồng độ Nitơ urê máu trong huyết tương (BUN), Aspartate Aminotransferase (AST) và Malondialdehyd thận (MDA)

Nồng độ BUN và AST trong huyết tương được xác định bằng cách sử dụng THỬ NGHIỆM BUN Wako và transaminase CII-Test Wako (FUJIFILM Wako Chemicals, Osaka, Nhật Bản), theo hướng dẫn của nhà sản xuất.8) TotalThậnNồng độ MDA được đo thông qua xét nghiệm vi mô so màu (Oxford Biomedical Research, MI, Hoa Kỳ), theo hướng dẫn của nhà sản xuất.8)

Phân tích Western Blot

Các mẫu protein (50 μg) được chiết xuất từthậnđược phân tách thông qua điện di gel natri dodecyl sulfate-polyacrylamide 10% natri dodecyl sulfate-polyacrylamide.10) Các kháng thể chính được sử dụng như sau (tất cả được pha loãng 1: 1500): protein tương tác thụ thể chuột (RIP) 1 kháng thể đơn dòng, kháng thể đơn dòng RIP3 của chuột và kháng thể đơn dòng glutathione peroxidase 4 (GPX4) chuột (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, Hoa Kỳ); thỏ phân cắt kháng thể đa dòng caspase-3 (Công nghệ tín hiệu tế bào); và kháng thể đơn dòng β-actin chuột (Medical &Biological Laboratories Co., Ltd., Aichi, Nhật Bản).

Phân tích thống kê

Nhiều so sánh đã được thực hiện bằng cách sử dụng thử nghiệm sau hoc Tukey-Kramer. Tất cả các phân tích thống kê được thực hiện bằng phần mềm SPSS 25.0 (Chicago, IL, Hoa Kỳ). Kết quả với p< 0.05="" were="" considered="" statistically="">

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã so sánh độc tính theo thời gian của ba chất chuyển hóa trung gian BB (3-BrP, BrHQ và 4-BrC) được biết là gây raThậntính độc. Chúng tôi fifirst đã điều tra hiệu quả của thời gian tiêm trên tỷ lệ tử vong do chất chuyển hóa trung gian BB gây ra. Hình 2 cho thấy số lượng động vật sống sót và thời gian sống trung bình (MST) 7 d sau tiêm. Khi 3-BrP được sử dụng ở ZT10 và ZT14, tất cả những con chuột đã chết (0%) trong vòng 4 giờ (Hình 2A). Ngược lại, khi 3-BrP được sử dụng ở ZT6 và ZT22, ba con chuột (60%) sống sót; khi được sử dụng tại ZT2 và ZT18, số lượng chuột sống sót lần lượt là một và hai (20 và 40%). Sau khi dùng BrHQ, cái chết của chuột chỉ được quan sát thấy trong vòng 4 giờ sau khi dùng thuốc ở tất cả các nhóm ZT. Ở mức 7 d sau khi dùng thuốc, không có con chuột nào sống sót trong các nhóm ZT14 và ZT18 và ba (60%) sống sót trong nhóm ZT2 và ZT6. Trong nhóm ZT10 và ZT 22, số lượng chuột sống sót lần lượt là hai và một (40 và 20%), (Hình 2B). Sau khi dùng 4 BrC, tất cả những con chuột đã chết trong vòng 3 d khi được dùng liều ở ZT14 hoặc ZT18 (0%) và chỉ một hoặc hai (20 hoặc 40%) sống sót ở các nhóm ZT khác (Hình 2C). MST gần như phù hợp với số lượng chuột sống sót trong tất cả các nhóm (Hình 2D – F). Những kết quả này cho thấy độc tính theo thời gian gây chết người của ba chất chuyển hóa trung gian BB. Sau khi dùng ZT14 (pha tối), cả ba chất chuyển hóa đều cho thấy độc tính cao. Điều thú vị là các kiểu độc tính theo thời gian của các chất chuyển hóa BB này khác với các mô hình của chính BB, nghĩa là những con chuột tiếp xúc với BB trong pha tối có độ nhạy cảm với độc tính thấp hơn.8) Trước đây chúng tôi đã báo cáo rằng streptomycin, cho thấy độc tính của thận, có độc tính cao sau khi tiếp xúc với pha tối và ít độc hại hơn sau khi tiếp xúc với pha sáng.9) Những phát hiện này của các nghiên cứu trước đây không mâu thuẫn với những phát hiện của nghiên cứu hiện tại, cho thấy rằng sự khác biệt về độc tính của BB và ba chất chuyển hóa trung gian BB được quy cho các cơ quan đích của chúng. BB nhắm vào gan, trong khi các chất chuyển hóa trung gian của nó nhắm vàothận.

Tiếp theo, chúng tôi đã kiểm tra ảnh hưởng của thời gian tiêm đến mức độ nghiêm trọng của độc tính nội tạng bằng cách sử dụng liều không gây chết người là 4-BrC (165 mg / kg). Khi tử vong sớm trong vòng 4 giờ đã được quan sát bằng cách tiêm 3-BrP và BrHQ, được mô tả như trên, chúng tôi chỉ chọn 4-BrC cho các thí nghiệm tiếp theo. Để thuận tiện cho thử nghiệm, chúng tôi đã chọn ZT2 và ZT14 làm thời gian tiêm. Trong nhóm ZT2, nồng độ BUN trong huyết tương, một chỉ số về độc tính trên thận, không tăng sau khi phơi nhiễm 4 BrC; tuy nhiên, mức BUN đã tăng lên rõ rệt trong nhóm ZT14 (Hình 3A). Song song với BUN, chúng tôi đã đo mức AST trong huyết tương, một chỉ số về nhiễm độc gan. Chúng tôi nhận thấy rằng dùng 4-BrC không ảnh hưởng đến nồng độ AST trong huyết tương cả trong ZT2 và ZT14 (Hình 3B), cho thấy rằng 4-BrC chỉ độc hại đối vớithận. Ngoài ra, chúng tôi ước tính mức độ MDA như một chỉ số stress oxy hóa trongthận. Việc sử dụng 4-BrC làm tăng đáng kể mức MDA thận ở các nhóm ZT14 và ZT2. Tuy nhiên, mức MDA trong nhóm tiêm ZT2 thấp hơn đáng kể so với nhóm ZT14 (Hình 3C).

Cho đến nay, các con đường chết tế bào khác nhau như apoptosis, hoại tử và ferroptosis đã được báo cáo.11) Ngoài ra, người ta đã báo cáo rằng sự chết tế bào do 4-BrC gây ra chủ yếu qua trung gian qua hoại tử.6) Để điều tra loại chết tế bào do 4-BrC gây ra, chúng tôi đã phân tích mức độ protein liên quan đến chết tế bào: caspase-3 bị cắt cho quá trình apoptosis, RIP1 / RIP3 cho hoại tử và GPX4 cho bệnh ferroptosis. Không có thay đổi rõ ràng nào được quan sát thấy ở mức caspase-3, RIP1 và RIP3 bị phân cắt ở bất kỳ nhóm nào, cho thấy rằng quá trình apoptosis và hoại tử không được gây ra bởi 4-BrC (Hình 4). Ngược lại, sự giảm mức GPX4 đã được quan sát thấy sau khi dùng 4-BrC ở ZT14 (Hình 4). Chúng tôi đã không quan sát thấy hoại tử thận do 4-BrC gây ra bằng phân tích mô bệnh học (dữ liệu không được hiển thị). Điều này cho thấy nồng độ 4 BrC được sử dụng trong nghiên cứu này gây tổn thương thận nhẹ và không dẫn đến hoại tử. Từ những kết quả này, có thể gợi ý rằng 4-BrC gây ra bệnh ferroptosis, cho thấy sự thay đổi ban ngày.

Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã chỉ ra các chất chuyển hóa trung gian BB gây ra độc tính theo thời gian trongthận. Ngược lại, kết quả trước đây của chúng tôi cho thấy nhiễm độc thận do BB gây ra. Tuy nhiên, độc tính theo thời gian của thận không được thay đổi giữa pha sáng và pha tối.8) Mặc dù lý do quan trọng cho sự khác biệt giữa nghiên cứu trước đây và hiện tại vẫn chưa rõ ràng, chúng tôi nghĩ rằng nó xảy ra để che giấu độc tính theo thời gian của thận bằng cách gây tổn thương gan nghiêm trọng. Trong thí nghiệm trong tương lai, chúng ta cần đo lượng tích lũy của từng chất chuyển hóa trung gian BB vì những lượng này có thể thay đổi theo CYP và / hoặc mức độ tổn thương.

Nhiều yếu tố sinh học cho thấy nhịp sinh học trong mức độ biểu hiện của chúng. Ví dụ, Xu et al. đã báo cáo sự thay đổi ban ngày trong biểu hiện gen chống oxy hóa gan ở chuột.12) Glutathione (GSH) là một chất chống oxy hóa rất quan trọng để duy trì sức khỏe và bảo vệ chống lại các hợp chất độc hại. Cả 4-BrC và 3-BrP đã được báo cáo là làm cạn kiệt mức GSH thận.4,13) Ferroptosis được đề xuất vào năm 2012 là dạng chết tế bào do elastin gây ra, ức chế nhập khẩu cysteine, dẫn đến suy giảm GSH và bất hoạt GPX4.14) Kết quả của chúng tôi cho thấy GPX4 chỉ bị ức chế tại ZT14 bởi 4-BrC. Do đó, các protein hoặc gen liên quan đến GSH có thể liên quan đến độc tính theo thời gian.

Để kết luận, nghiên cứu hiện tại của chúng tôi chứng minh rằng BB gây tổn thương thận cũng như tổn thương gan thông qua các chất chuyển hóa của nó, chẳng hạn như 3-BrP, BrHQ và 4-BrC. Lý do tại sao sự biến đổi ban ngày của độc tính thận của BB không được quan sát thấy trong báo cáo trước đây của chúng tôi là tổn thương thận đã được che dấu do tổn thương gan mạnh.

THAM KHẢO

1) Lau SS, Tu sĩ TJ. Sự đóng góp của bromobenzene vào sự hiểu biết hiện tại của chúng ta về độc tính do hóa học gây ra. Life Sci., 42, 1259–1269 (1988).

2) Zhao H, Cheng N, He L, Peng G, Liu Q, Ma T, Cao W. Hepatoprotective Tác dụng bảo vệ của mật ong của Apis cerana Fabricius đối với tổn thương gan do bromobenzene gây ra ở chuột. J. Food Sci., 83 tuổi, 509–516 (2018).

3) Vedi M, Sabina EP. Đánh giá tiềm năng bảo vệ gan và nephroprotective của withaferin A trên tổn thương do bromobenzene gây ra ở chuột bạch tạng Thụy Sĩ: có thể liên quan đến rối loạn chức năng ty thể và viêm. Tế bào Biol. Toxicol., 32, 373–390 (2016).

4) Dankovic DA, Billings RE. Vai trò của 4-bromophenol và 4-bromocatechol trong liên kết cộng hóa trị bromobenzene và độc tính trong tế bào gan chuột bị cô lập. Toxicol (bằng tiếng Anh). Appl. Pharmacol., 79, 323–331 (1985).

5) Lau SS, Monks TJ, Gillette JR. Xác định 2-bromohydroquinone là chất chuyển hóa của bromobenzene và o-bromophenol: ý nghĩa đối với độc tính thận do bromobenzene gây ra. J. Dược phẩm. Exp. Ther., 230, 360–366 (1984).

6) Rush GF, Newton JF, Maita K, Kuo CH, Hook JB. Độc tính trên thận của các chất chuyển hóa phenolic bromobenzene ở chuột. Độc chất học, 30, 259–272 (1984).

7) Miura N, Yoshioka H, Nishimori A, Ohtani K, Hasegawa T, Hwang GW, Ikeda M, Nonogaki T. Phân tích đa chiều về độc tính thời gian ở gan do cadmium và ở chuột gây ra. J. Toxicol (bằng tiếng Anh). Sci., 42, 597–604 (2017).

8) Yoshioka H, Nonogaki T, Fukuishi N, Shinohara Y, Hwang GW, Ohtani K, Miura N. Chronotoxicity của tổn thương gan do bromobenzene gây ra ở chuột. J. Toxicol (bằng tiếng Anh). Sci., 42, 251–258 (2017).

9) Yoshioka H, Tominaga S, Shinohara Y, Hwang GW, Maeda T, Miura N. Chronotoxicity của tổn thương thận do streptomycin gây ra ở chuột. Biol. Pharm. Bull., 43, 53–58 (2020).

10) Yoshioka H, Ichimaru Y, Fukaya S, Nagatsu A, Nonogaki T. Tác dụng tăng cường của acetaminophen và độc tính gan do carbon tetrachloride gây ra được trung gian bằng cách kích hoạt protein tương tác thụ thể ở chuột. Toxicol (bằng tiếng Anh). Mech. Phương pháp, 28, 615–621 (2018).

11) Kim EH, Wong SW, Martinez J. Hoại tử và bệnh được lập trình: Chúng tôi làm gián đoạn chương trình thường xuyên của bạn để mang lại cho bạn viêm hoại tử. Cái chết tế bào khác nhau., 26, 25–40 (2019).

12) Xu YQ, Zhang D, Jin T, Cai DJ, Wu Q, Lu Y, Liu J, Klaassen CD. Biến thể ban ngày của biểu hiện gen chống oxy hóa gan ở chuột. PLOS ONE, 7, e44237 (2012).

13) Các nhà sư TJ, Hinson JA, Gillette JR. Bromobenzene và độc tính p-bromophenol và liên kết cộng hóa trị in vivo. Life Sci., 30, 841–848 (1982).

14) Dixon SJ, Lemberg KM, Lamprecht MR, Skouta R, Zaitsev EM, Gleason CE, Patel DN, Bauer AJ, Cantley AM, Yang WS, Morrison B 3rd, Stockwell BR. Ferroptosis: một dạng chết tế bào không phổ biến phụ thuộc vào sắt. Cell, 149, 1060–1072 (2012).

Hiroki Yoshioka, a, b, # Sarah Tominaga, a, # Mai Nishikawa, một Shinohara Yasuro, một Nakao Makoto, một Masae Yoshikawa, một Maeda Tohru,*, a và Nobuhiko Miura *, c

Cao đẳng Dược, Đại học Kinjo Gakuin; 2–1723 Omori, Moriyama-Ku, Nagoya 463–8521, Nhật Bản: b Trung tâm Nghiên cứu Sọ mặt, Trung tâm Khoa học Y tế Đại học Texas tại Houston, Trường Nha khoa; 1941 East Road, Houston, TX 77054, Hoa Kỳ: và cDepartment of Health Science, Yokohoma University of Pharmacy; 601 Momono-Cho, Totsuka-Ku, Yokohama 245–2006, Nhật Bản. Nhận ngày 30/8/2020; chấp nhận ngày 25 tháng 2020 năm XNUMX

để biết thêm thông tin: Ali.ma@wecistanche.com