Các cơ quan thụ cảm giống thu phí đặc biệt Biểu hiện gen và phản ứng thần kinh đệm ở các vùng não khác nhau của Scrapie tự nhiên Phần 3

Chúng tôi đã nghiên cứu mối tương quan có thể có giữa các dấu hiệu bệnh lý thần kinh của bệnh prion và biểu hiện gen TLR ở bốn vùng não khác nhau của những con cừu bị nhiễm bệnh tự nhiên với phế liệu. Trong tất cả bốn vùng não, chúng tôi đã quan sát thấy sự khác biệt đáng kể về sự lắng đọng PrPSc, bệnh xốp hóa, bệnh astrogliosis và bệnh vi mô ở cừu bị nhiễm bệnh tự nhiên so với cừu đối chứng.

Bệnh Prion hay còn gọi là bệnh chùa, bệnh ăn sáp, v.v., là một bệnh nhiễm virus cấp tính do prion gây ra. Bệnh lây truyền chủ yếu qua việc ăn thực phẩm chưa nấu chín có chứa prion. Khi bị nhiễm prion, nó có thể gây viêm não và tổn thương hệ thần kinh, đồng thời có thể xảy ra các triệu chứng như nhức đầu, nôn mửa và sốt.

Tuy nhiên, khi gặp phải tình huống như vậy, chúng ta không thể mất niềm tin vào trí nhớ của mình vì sự tồn tại của bệnh prion. Hầu hết những người nhiễm bệnh đều có thể bình phục và phục hồi trí nhớ sau khi điều trị.

Tất nhiên, từ góc độ phòng ngừa, chúng ta có thể cố gắng ăn nhiều thực phẩm nấu chín hơn để tránh nhiễm prion. Đồng thời, nếu cảm thấy có bất kỳ triệu chứng nào, bạn cũng nên đến gặp bác sĩ càng sớm càng tốt để tránh tình trạng bệnh trở nên trầm trọng hơn.

Trong cuộc sống hàng ngày, chúng ta có thể thử một số bài rèn luyện trí nhớ đơn giản như đọc sách, lập danh sách, sắp xếp các sự kiện và thông tin, v.v. để cải thiện trí nhớ. Những khóa đào tạo này không đòi hỏi nhiều thời gian và năng lượng nhưng chúng rất quan trọng để duy trì một bộ não khỏe mạnh và chức năng ghi nhớ hiệu quả.

Nói tóm lại, khi gặp phải những căn bệnh như bệnh prion, chúng ta nên đối mặt với nó một cách tích cực, tìm kiếm các biện pháp điều trị và phòng ngừa y tế chuyên nghiệp, đồng thời chú ý đến các bài tập trí nhớ hàng ngày để đảm bảo sức khỏe thể chất và làm việc hiệu quả. Có thể thấy rằng chúng ta cần cải thiện trí nhớ, và Cistanche có thể cải thiện đáng kể trí nhớ vì nó còn có thể điều chỉnh sự cân bằng của các chất dẫn truyền thần kinh, chẳng hạn như tăng mức độ acetylcholine và các yếu tố tăng trưởng, rất quan trọng đối với trí nhớ và khả năng học tập. Ngoài ra, Cistanche cũng có thể cải thiện lưu lượng máu và thúc đẩy việc cung cấp oxy, điều này có thể đảm bảo rằng não có đủ dinh dưỡng và năng lượng, từ đó cải thiện sức sống và sức bền của não.

Bấm vào biết cách cải thiện chức năng não

Những khác biệt này thể hiện rõ nhất ở vùng hành tủy, vùng đuôi nhất. Ngược lại, các tổn thương nhẹ nhất được quan sát thấy ở vỏ não trước, vùng rostralarea nhất. Mô hình tuần tự này phù hợp với lộ trình xâm lấn và lan truyền thần kinh prion khắp hệ thần kinh trung ương, bắt đầu từ các vị trí xâm nhập vào tủy sống và ổ não và cuối cùng đến vỏ não trán [1,5,51].

Thật bất ngờ, khi xem xét sự gần gũi về mặt giải phẫu của chúng, chúng tôi đã quan sát thấy sự lắng đọng và không bào hóa PrPSc giảm mạnh, cũng như sự suy giảm đáng kể về bệnh astrogliosis, khi di chuyển từ đồi thị đến vùng đồi thị, không tuân theo sự tiến triển dần dần của bệnh lý.

Một hình thái vi tế bào cụ thể được gọi là microglia hình que đã được quan sát thấy ở gần các tế bào thần kinh hình chóp ở CA3 nhưng không có ở tất cả các vùng giải phẫu thần kinh khác được nghiên cứu.

Theo hiểu biết của chúng tôi, cho đến nay, đặc điểm vi mô này không liên quan đến tình trạng viêm thần kinh do prion kích hoạt, mặc dù một nghiên cứu gần đây đã báo cáo sự hiện diện của vi mô hình que trong tiểu não của bệnh nhân mắc CJD [52].

Mặc dù ít được nghiên cứu kể từ những mô tả đầu tiên vào những năm 1900, nhưng microglia gần đây đã được báo cáo về các rối loạn thần kinh như động kinh, chứng mất trí nhớ thể Lewy, bệnh Huntington và AD, đặc biệt ở các vùng bị tổn thương vừa phải của vỏ não và vùng đồi thị [40,41,53]. Sự biểu hiện kiểu hình và chức năng của microglia hình que vẫn chưa rõ ràng.

Tuy nhiên, thực tế là đặc điểm hình thái này thường trùng khớp với sự hiện diện của các thành phần tế bào thần kinh bị tổn thương hoặc dễ bị tổn thương cho thấy vai trò bảo vệ thần kinh [42,54,55].

Microglia hình que không được cho là có liên quan đến các tổn thương nghiêm trọng, vì sự tiến triển về hình thái amip được mong đợi trong những tình trạng này [56]. Sự hiện diện của rodmicroglia ở vùng hải mã của cừu bị nhiễm bệnh phế liệu, nhưng không có ở các vùng não khác, có thể là dấu hiệu của môi trường bảo vệ thần kinh, phù hợp với tình trạng mất tế bào thần kinh hạn chế được quan sát thấy ở khu vực này.

Phân tích của chúng tôi về biểu hiện TLR cho thấy mối tương quan trực tiếp giữa mức độ nghiêm trọng của tổn thương và sự biểu hiện quá mức của gen TLR trùng khớp với sự tiến triển của bệnh lý thần kinh prion đã đề cập ở trên.

Ngược lại, TLR4 cũng được biểu hiện quá mức ở tất cả các khu vực, bất kể mức độ nghiêm trọng của tổn thương. Sự biểu hiện quá mức của TLR4 ở những vùng tổn thương thần kinh nhẹ hơn (tức là vùng hải mã và vỏ não vùng trán) có thể phản ánh vai trò bảo vệ thần kinh, như đã mô tả trước đây đối với các tế bào thực bào như đại thực bào và vi tế bào thần kinh đệm [23,57]. Sự điều hòa lên của TLR7 đã được báo cáo trước đây trên các mô hình chuột của bệnh prion và bệnh nhân ở người [22,26,31].

Chúng tôi chỉ quan sát thấy sự điều hòa của TLR7 trong hành tủy, khu vực bị tổn thương nặng nề nhất trong đó phát hiện thấy mức độ lắng đọng PrPSc và xốp hóa cao nhất.

Cái chết thần kinh do apoptosis trước đây có liên quan đến kích thích TLR7 [58,59], và sự biểu hiện quá mức của nó trong hành tủy có thể liên quan đến cơ chế này [60]. Mặc dù vai trò của TLR1 trong các bệnh thoái hóa thần kinh vẫn chưa rõ ràng, nhưng sự tham gia của TLR2 vào hoạt hóa vi mô ngày càng được chứng minh trong bệnh xơ cứng teo cơ một bên, MS và AD [61,62].

Trong khi vai trò của các bệnh prion TLR2in chưa được hiểu đầy đủ, các tác dụng có lợi đã được đề xuất: thời gian sống sót giảm ở những con chuột không biểu hiện TLR2 sau khi tiêm vào não bằng vật liệu phế liệu [22].

Sự biểu hiện quá mức của TLR2 và MyD88 cũng có thể là biểu hiện của kiểu hình vi khuẩn tiền viêm, điều này có thể giải thích sự gia tăng TNF- và IL-6 mà chúng tôi quan sát thấy ở đồi thị [8,63].

Điều thú vị là, các thí nghiệm sử dụng tế bào EOC 13.31, một dòng tế bào chuột giống microglia bất tử, đã cho thấy sự rối loạn điều hòa đường phản ứng viêm khi phản ứng với hoạt hóa TLR2 và gợi ý mối liên hệ giữa biểu hiện TLR2 và sự tích tụ microglia ở trạng thái không tối ưu cho quá trình thực bào [26] .

Do đó, sự biểu hiện quá mức của TLR2 ở hành não và đồi thị, những khu vực bị tổn thương nhiều nhất trong đó cũng phát hiện thấy mức độ vi mô thực bào quá mức, cho thấy rằng sự thanh thải rối loạn chức năng của PrPSc có thể dẫn đến sự tích tụ kéo dài của PrPSc và tổn thương tế bào thần kinh [9,17].

Những phát hiện của chúng tôi ở vùng hải mã của những con cừu bị nhiễm phế liệu cho thấy một mô hình trái ngược so với các vùng não được phân tích khác, với sự điều hòa giảm TLR1, TLR2 và MyD88 và không có sự thay đổi cytokine.

Điều này có thể chỉ ra rằng microglia phản ứng khác nhau ở vùng hải mã; thực sự, người ta đã chứng minh rằng sự thiếu hụt TLR2 trong nuôi cấy tế bào vi mô nguyên phát, từ chuột sơ sinh (0–3 ngày tuổi) và được kích thích bằng peptide độc ​​thần kinh PrP106-126, chuyển kích hoạt vi mô từ chất độc thần kinh sang kiểu hình bảo vệ thần kinh [63 ].

Tuy nhiên, sự liên quan của peptide PrP106-126 trong bệnh lý prion đã bị nghi ngờ [64]. CD36 là một loại thụ thể nhận dạng mẫu khác, có khả năng nhận biết các phối tử có nguồn gốc nội sinh như peptide hình thành amyloid, đã thiết lập vai trò trong sự hấp thu nội tiết của các thành phần đó [65,66]. Thụ thể này có liên quan đến tình trạng vi mô tiền viêm [67].

Trong ống nghiệm, việc kích thích tế bào BV{0}}, một loại tế bào vi mô bất tử, với PrP106-126 dẫn đến việc điều hòa lại CD36, làm tăng các cytokine tiền viêm và sản xuất iNOS và NO [68,69].

Ngoài ra, việc CD36 nhận biết peptit -amyloid sẽ kích hoạt sự lắp ráp một phức hợp dị tri mớiCD36-TLR4-TLR6 kích hoạt phản ứng miễn dịch bẩm sinh [70,71].

Trong nghiên cứu của chúng tôi, tất cả các khu vực đều cho thấy sự điều hòa tăng đáng kể của CD36 ngoại trừ vùng hải mã. Sự điều hòa tăng của CD36, TLR4 và TLR6 ở những khu vực bị tổn thương nhiều nhất, hành não và hành não, cho thấy sự liên quan của bộ ba này trong việc kích hoạt tình trạng vi mô gây viêm trong phản ứng với nhiễm trùng prion.

Ngược lại, sự vắng mặt của sự biểu hiện quá mức CD36 và TLR6 ở vùng hải mã cho thấy rằng chất dị vòng này không được hình thành, một lần nữa cho thấy môi trường bảo vệ thần kinh ở vùng não này.

Vẫn còn phải giải thích tại sao microglia phản ứng khác nhau ở vùng não này. Trong khi ái tính tế bào đặc hiệu của chủng prion có thể xác định mô hình của microgliosis và astrogliosis, những phát hiện gần đây cho thấy cả hai phản ứng chủ yếu bị ảnh hưởng bởi vùng não [18,72].

Cả microglia và astroglia đều không phản ứng thống nhất trên CNS và phản ứng theo vùng cụ thể này có thể dẫn đến tính dễ bị tổn thương có chọn lọc của một số vùng não trong các bệnh prion [16,18].

Về vấn đề này, người ta đã công nhận rằng phản ứng viêm của microglia đối với nhiễm trùng prion được điều chỉnh bởi quá trình sialylation PrPSc [14,73–75] và quá trình sialylation PrPSc phụ thuộc vào vùng não [18]. Cụ thể, mức độ sialyl hóa PrPSc cao hơn được tìm thấy ở vùng hải mã và vỏ não so với ở đồi thị và thân não, cho thấy vai trò tiềm ẩn trong tính dễ bị tổn thương có chọn lọc của các vùng não này [18,73,75].

Mức độ sialylation PrPSc cao ở vùng hải mã có thể liên quan đến sự sao chép prion bị chậm lại, dẫn đến sự kích hoạt vi mô đặc biệt do prion gây ra ở vùng này, phù hợp với mức độ nhạy cảm giảm của vùng này được ngụ ý bởi những phát hiện của chúng tôi.

Điều thú vị là, những phát hiện trước đây cho thấy vùng hải mã có thể được bảo vệ khỏi nhiễm độc thần kinh prion trong nhiễm trùng CJD tự nhiên [76,77], và các nghiên cứu bệnh lý thần kinh chi tiết về các trường hợp CJD đã báo cáo các tổn thương nhẹ hơn ở vùng hải mã so với các vùng não khác [76].

Cụ thể, vùng vỏ não, chủ yếu bao gồm vùng hải mã, dường như tương đối ít so với các vùng vỏ não khác trong CJD [77]. Sự tham gia nhẹ ở vùng hải mã được mô tả trong bệnh CJD tự nhiên phù hợp với những phát hiện hiện tại ở những con cừu bị nhiễm bệnh Scrapie một cách tự nhiên.

Điều thú vị là, sự bảo vệ một phần này chống lại ít nhất hai bệnh prion tự nhiên xảy ra ở vùng hải mã, đây là vùng phát sinh chủng loại lâu đời nhất của vỏ não và bao gồm loại mô vỏ não cơ bản nhất.

Sẽ cần phải có các nghiên cứu sâu hơn để khám phá mối liên quan của mối tương quan này. Tóm lại, kết quả của chúng tôi cho thấy bệnh lý thần kinh đặc biệt nhẹ ở vùng hải mã của những con cừu bị nhiễm phế liệu tự nhiên, được đặc trưng bởi mức độ xốp hóa, lắng đọng PrPSc và astrogliosis thấp hơn dự kiến. -sự lây lan của các vết xước.

Hơn nữa, sự hiện diện ở vùng hải mã của một hình thái vi mô đệm độc quyền, microglia hình que, có thể đóng vai trò bảo vệ thần kinh [54], cùng với hồ sơ biểu hiện gen thụ thể nhận dạng mẫu riêng biệt (gen TLR và CD36), giúp phân biệt rõ hơn vùng não này với vùng giải phẫu thần kinh khác. vùng ở cừu bị nhiễm phế liệu tự nhiên.

Những phát hiện này cho thấy mức độ bảo vệ thần kinh chống lại nhiễm trùng prion tự nhiên ở vùng hải mã đáng được nghiên cứu thêm. Các bệnh thoái hóa thần kinh do protein cuộn sai bao gồm một vòng luẩn quẩn của viêm bao gồm tích lũy protein không khớp, kích hoạt thần kinh đệm và giải phóng các chất trung gian gây viêm thần kinh đệm, làm trầm trọng thêm sự lắng đọng protein và viêm thần kinh.

Việc làm gián đoạn vòng luẩn quẩn này bằng cách nhắm mục tiêu kích hoạt microglia bằng cách sử dụng các chất ức chế TLR cụ thể ở giai đoạn bệnh cụ thể có thể là một cách tiếp cận đầy hứa hẹn để hạn chế tình trạng viêm thần kinh hơn nữa. Những phát hiện của chúng tôi nêu bật sự điều hòa giảm TLR2 như một mục tiêu tiềm năng cho cách tiếp cận như vậy, vì điều này có thể tạo ra sự thay đổi trong microglia từ kiểu hình gây độc thần kinh sang kiểu hình bảo vệ thần kinh [63].

Cuối cùng, trong khi đã đạt được tiến bộ lớn trong việc mô tả tính đa dạng của kiểu hình thần kinh đệm bằng cách sử dụng mô hình chuột mắc các bệnh thoái hóa thần kinh, liệu mô hình chuột có phản ánh trung thực các khía cạnh chính của bệnh prion hay không vẫn còn là vấn đề tranh luận [78,79].

Kết quả của chúng tôi trong mô hình biến đổi gen tg338 đã tái tạo các dấu hiệu bệnh lý phổ biến của nhiễm prion, bao gồm sự lắng đọng PrPSc rõ rệt, bệnh xốp hóa thần kinh, bệnh astrogliosis và bệnh vi mô.

Tuy nhiên, những con chuột bị nhiễm bệnh có biểu hiện quá mức đáng kể của TLR1 và TLR2 và có xu hướng biểu hiện quá mức TLR7. Mặc dù sự điều hòa của các gen này trước đây đã được mô tả ở các mô hình chuột khác bị nhiễm bệnh phế liệu [22,26], nhưng mô hình này trái ngược với những phát hiện của chúng tôi ở não buồng trứng. Đáng chú ý, trong não chuột, chúng tôi quan sát thấy không có sự thay đổi nào trong biểu hiện của TLR4, gen có sự thay đổi lớn nhất về biểu hiện được quan sát thấy ở các mẫu cừu.

Những phát hiện mâu thuẫn này có thể là kết quả của các con đường lây nhiễm khác nhau và/hoặc mức độ biểu hiện protein prion ở chuột tg338 [80,81]. Tuy nhiên, kết quả cuối cùng của chúng tôi chỉ ra rằng việc cấy phế liệu vào não ở chuột tg338 quá khổ không tái tạo lại phản ứng miễn dịch được quan sát thấy trong nhiễm trùng phế liệu tự nhiên.

4. Vật liệu và phương pháp

4.1. Cừu bị nhiễm Scrapie và kiểm soát

Hai mươi mốt con cừu Rasa Aragonesa cái (từ 2–6 tuổi) đã được đưa vào nghiên cứu này. Tất cả đều được xác định kiểu gen cho đa hình PRNP, như đã báo cáo trước đây [82], và được phát hiện là hiển thị kiểu gen ARQ/ARQ. Động vật đối chứng (n=8) đã được chọn từ một đàn không có trường hợp phế liệu nào được báo cáo.

Động vật bị nhiễm phế liệu (n=13) được lấy từ đàn bị ảnh hưởng bởi phế liệu và đã được chẩn đoán bằng hóa mô miễn dịch (IHC) của sinh thiết niêm mạc trực tràng. Nhiễm trùng được xác nhận bằng xét nghiệm miễn dịch sau khi chết đối với PrPSc trong obex theo các tiêu chí đã được công bố [83].

Các con vật đã được phú dưỡng bằng cách tiêm quá liều thuốc an thần vào tĩnh mạch và mất máu.

Vào thời điểm an tử, tất cả những con cừu bị nhiễm phế liệu đều có dấu hiệu lâm sàng ở mức độ nghiêm trọng khác nhau: một số con có biểu hiện ban đầu như ngứa lưng và hai bên sườn sau khi bị kích thích bằng ngón tay và tình trạng cơ thể giảm nhẹ, trong khi những con khác biểu hiện các dấu hiệu lâm sàng tiến triển như gãi tự phát ở da. rễ đuôi, vùng thắt lưng và các chi, các dấu hiệu thần kinh bao gồm mất điều hòa và run đầu, nghiến răng, rụng len và sụt cân nhiều [84].

4.2. Nhiễm chuột Tg338

Để đánh giá các biểu hiện gen TLR trong não của mô hình chuột Scrapie, chuột tg338 10 tuần tuổi (n=8) (biểu hiện quá mức VRQ/VRQ PrPC buồng trứng 8- đến 10-gấp [ 85]) được tiêm nhóm não từ cừu Rasa Aragonesa bị nhiễm phế liệu tự nhiên ở giai đoạn lâm sàng.

Những con chuột được tiêm 20 uL chất cấy phế liệu (pha loãng 2% w/v trong PBS) vào bán cầu não phải dưới gây mê bằng isoflurane. Việc tiêm nội sọ được thực hiện bằng cách sử dụng ống tiêm 50 µL và kim 25G. Sau khi tiêm chủng, chuột được tiêm dưới da buprenorphine (0,3 mg/kg) để gây giảm đau.

Để kiểm soát, chuột tg338 (n=8) đã được tiêm chất đồng nhất não từ một con cừu âm tính phế liệu theo quy trình tương tự được mô tả ở trên. Những con chuột này được theo dõi sự phát triển của các dấu hiệu lâm sàng và bị tiêu hủy do trật khớp cổ tử cung khi xuất hiện các dấu hiệu giai đoạn cuối của bệnh như mất điều hòa nghiêm trọng và không có khả năng ăn uống.

Những con chuột bị nhiễm chất cấy dương tính với phế liệu có thời gian sống sót trung bình là 187 ± 26 dpi.

4.3. Bộ sưu tập mô

Các mẫu từ CNS được thu thập và chia dọc thành hai nửa; một loại được cố định trong formalin đệm trung tính 10% để phân tích mô bệnh học và hóa mô miễn dịch, còn loại kia được đông lạnh trực tiếp và duy trì ở -80 ◦C để phân tích protein hoặc được ổn định trong Dung dịch RNAlaterTM (InvitrogenTM, Waltham, MA, USA) để chiết RNA, sau đó đông lạnh và bảo quản ở −80 ◦C.

4.4. Trình tự PRNP

DNA được tách chiết từ các mẫu máu bằng bộ chiết tách DNA mô Speedtools (Biotools, Madrid, Tây Ban Nha) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Khuếch đại PCR và giải trình tự đã được thực hiện như mô tả trước đây [82].

4.5. Hóa mô miễn dịch

Các mô cố định bằng formalin được xử lý theo quy trình mô bệnh học tiêu chuẩn. Các phần mô được nhúng parafin, cắt thành các phần dày 4 µm và nhuộm bằng hematoxylin-eosin (HE) để đánh giá tình trạng không bào và bệnh xốp xơ thần kinh.

IHC để phát hiện PrPSc được thực hiện bằng cách sử dụng kháng thể chính đơn dòng L42 của chuột ở cừu (độ pha loãng 1:500 ở nhiệt độ phòng trong 30 phút) (R-Biopharm, Darmstadt,Đức) và kháng thể đa dòng của thỏ R486 ở chuột (1: 8000, qua đêm ở 4 ◦C)(R. Jackman, chưa xuất bản) như mô tả trước đây [86,87].

Các phần cũng được nhuộm miễn dịch thông thường đối với protein axit fibrillary axit thần kinh đệm đánh dấu tế bào hình sao (GFAP) (1:500; Dako, Glostrup, Đan Mạch) và phân tử bộ chuyển đổi liên kết canxi ion hóa đánh dấu tế bào hình sao 1 (Iba1) (1:1000; Wako, Richmond , VA, USA), theo các giao thức đã được công bố [88]. Tất cả các đánh giá mô học và IHC được thực hiện bởi hai nhà nghiên cứu bệnh học thú y bị mù dữ liệu lâm sàng.

Các đánh giá về bệnh xốp xương và cường độ nhuộm PrPSc được thực hiện bán định lượng và điều chỉnh theo các tiêu chí được mô tả trong các nghiên cứu trước đây: sự tạo không bào của tế bào thần kinh và màng ngoài tim được tính điểm từ 0 (vắng mặt) đến 5 (rất nhiều và hợp lưu) [51], tín hiệu PrPSc đã được định lượng dựa trên mức độ duy trì miễn dịch từ 0 (không ghi nhãn) đến 5 (ghi nhãn đồng nhất cường độ cao) như đã báo cáo trước đây [89] và mức độ dán nhãn miễn dịch GFAP và Iba1 được tính theo thang điểm từ {{ 8}} đến 5 (0=nhuộm màu yếu; 5=dán nhãn miễn dịch đáng kể trên toàn khu vực) như được mô tả [88]. Bốn vùng não đã được đánh giá: vỏ não trước (Fc) đồi thị (Th), sự hình thành vùng đồi thị (Hc) và hành não (Mo), và mỗi vùng được phân tích toàn cầu để tính điểm và được biểu thị bằng đồ họa dưới dạng trung bình ± sai số chuẩn.

4.6. Western Blot

100 mg mô não của từng vùng não (Fc, Th, Hc và Mo) từ 13 con cừu bị nhiễm phế liệu, 8 con có dấu hiệu lâm sàng tiến triển và 5 con có dấu hiệu lâm sàng mới chớm, được đồng nhất hóa trong 1 mL dung dịch đệm ly giải.

Hemencephalon của 8 con chuột bị nhiễm bệnh và 8 con chuột đối chứng được đồng nhất ở mức 10% (w/v) trong dung dịch đệm ly giải. Các mẫu mô là các ống nghiền đã đồng nhất (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) bằng cách sử dụng thiết bị đồng nhất TeSeEPrecess 48 TM (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) và nồng độ protein được đo bằng bộ xét nghiệm Protein PierceTM BCA (ThermoScientificTM, Waltham, MA, USA) theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

Đối với phân tích PrPres, lượng protein bằng nhau từ các chất đồng nhất mô được ủ trong 10 phút ở 37 ◦C với dung dịch proteinase K, như đã mô tả trước đây [90].

Các mẫu thu được được điện di trong Gel Protein CriterionTM XT Bis-Tris 12% (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) và chuyển sang màng PVDF được chặn trong 1 giờ bằng sữa khô không béo 2% trong TBST (Tris- nước muối đệm với 0,1% Tween20).

Để xác định miễn dịch, các màng được ủ qua đêm ở 4 ◦C với kháng thể chính Sha31 (SPI-Bio, Montigny-le-Bretonneux, Pháp) ở nồng độ 1 µg/mL, sau đó ủ 1 giờ ở nhiệt độ phòng (RT) với peroxidase cải ngựa- kháng thể thứ cấp IgG chống chuột liên hợp (1:5000) (Công nghệ sinh học Santa Cruz, Dallas, TX, Hoa Kỳ).

Khả năng miễn dịch đã được phát hiện bằng cách sử dụng chất nền phát quang hóa học ImmobilenCrescendo Western HRP (Merck, Darmstadt, Đức). Biểu hiện protein TLR4 được phân tích từ các chất đồng nhất mô trộn với dung dịch đệm mẫu 2×Laemmli (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) theo hướng dẫn của nhà sản xuất .

Bốn mươi microgam tổng lượng protein được nạp vào mỗi giếng, chạy trong Gel Protein Midi đúc sẵn 7,5% CriterionTM TGXTM (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) và chuyển vào màng PVDF, sau đó màng này được chặn trong 2 giờ bằng albumin huyết thanh bò 4% (BSA)(Merck, Darmstadt, Đức) trong TBST tại RT. Các màng này được ủ qua đêm ở nhiệt độ 4 ◦C bằng kháng thể kháng TLR4 đa dòng của thỏ (Novus Students, Minneapolis, MN, USA) ở nồng độ 0.5 µg/mL, sau đó được rửa sạch và ủ bằng kháng thể IgG kháng thỏ của dê ( H + L) Kháng thể thứ cấp HRP (ThermoScientificTM, Waltham, MA, USA) lúc 1:20,000 trong 1 giờ tại RT.

Blots đã được hình dung như mô tả ở trên. Tiếp theo, màng được loại bỏ bằng dung dịch đệm RestoreTM Western Blot Stripping (ThermoScientificTM, Waltham,MA, USA) trong 15 phút ở 37 ◦C, rửa sạch và chặn lại.

Sau đó, màng được ủ qua đêm ở nhiệt độ 4 ◦C với kháng thể chính -actin đơn dòng của chuột (Santa CruzBiotechnology, Dallas, TX, USA) với tỷ lệ 1:1000, rửa sạch và ủ với kháng thể thứ cấp m-IgGкBP-HRP chống chuột (Santa Cruz Công nghệ sinh học, Dallas, TX, Hoa Kỳ) trong 1 giờ. Sau khi rửa, các vết đốm xuất hiện như mô tả ở trên.

Đo mật độ được thực hiện bằng phần mềm ImageJ và các giá trị được chuẩn hóa bằng -actin. Các giá trị chuẩn hóa được biểu thị bằng GraphPad Prism 6.0 (SanDiego, CA, USA).

Các phân tích thống kê để so sánh nhóm bị nhiễm và nhóm đối chứng được thực hiện bằng bài kiểm tra t của Học sinh và sự bằng nhau của các phương sai được xác định bởi Levene'stest bằng phần mềm SPSS (SPSS Stats for Windows, Version 17.0, Chicago, IL, USA). Sự khác biệt giữa các nhóm được coi là có ý nghĩa thống kê ở mức *p<0.05.

4.7. Chiết xuất RNA, tổng hợp cDNA và biểu hiện gen

RNA tổng số của cừu được chiết xuất từ ​​90 mg mẫu mô từ vỏ não trước, đồi thị, đồi thị và hành não. Não chuột được phân chia ở đường giữa và tổng số RNA được chiết xuất từ ​​​​<90 mg obtained from the thalamic area. 

Các mô được đồng nhất hóa bằng cách sử dụng chất đồng nhất TeSeEPrecess 48TM (Bio-Rad) với RNeasy LipidTissue Mini Kit (Qiagen, Hilden, Đức) kết hợp với TURBO DNase (Invitrogen TM, Waltham, MA, USA) để loại bỏ khả năng nhiễm DNA bộ gen. Nồng độ RNA được xác định bằng phương pháp đo quang phổ bằng máy quang phổ NanoDrop (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA) và đối với mỗi mẫu, tỷ lệ 260/280 và 260/230 được phân tích để xác minh độ tinh khiết của mẫu.

Một microgam DNA bổ sung (cDNA) đã được tổng hợp bằng cách sử dụng qScriptTM cDNA SuperMix (Quantabio BioscaticsTM, Beverly, MA, USA) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Ngoài ra, hiệu quả của việc xử lý DNase được đánh giá ở các mẫu RT âm tính. Sau khi sao chép ngược, cùng một lô cDNA pha loãng được đưa vào qPCR để khuếch đại TLR.

Hai gen giữ nhà (HK) thường được sử dụng đã được chọn để bình thường hóa sự biểu hiện của gen mục tiêu: glyceraldehyd-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) vàactin-beta (ACT ) [91]. Tính ổn định của gen HK này đã được xác minh trong điều kiện thí nghiệm của chúng tôi. Biểu hiện RNA thông tin (mRNA) được xác định bằng qPCR đối với 1 đến 10 gen TLR của trứng, 1 đến 9 gen TLR ở chuột và gen MyD88 cho cả hai loài.

Hai cytokine tiền viêm (TNF- và IL{1}}) và hai cytokine chống viêm (IL-10 và TGF- ) cũng đã được nghiên cứu ở đồi não và đồi thị cừu. Trình tự mồi và hiệu suất đã được công bố trước đây hoặc được thiết kế bằng công cụ Primer3Plus [92](Bảng 2).

Chúng tôi đã xác minh hiệu quả của từng gen tạo ra đường cong chuẩn bằng cách khuếch đại độ pha loãng nối tiếp 1: 2 của cDNA đối chứng và sau đó kiểm tra tính tuyến tính giữa nồng độ mẫu ban đầu và giá trị ngưỡng chu kỳ (Ct). Tất cả các gen đều thể hiện hệ số tương quan giữa 0.9 và 0.99, với giá trị độ dốc của các đường cong tiêu chuẩn trong khoảng −3,2 đến −3,5 và hiệu suất qPCR là 90–110%.

Các phản ứng qPCR được thực hiện bằng Hệ thống PCR thời gian thực của Hệ sinh học ứng dụngTM QuantStudioTM 5, 96-với các điều kiện khuếch đại phổ quát: bước kích hoạt ban đầu và bước biến tính cDNA là 10 phút ở 95 ◦C, sau đó là 40 chu kỳ 3 giây ở 95 ◦C và 30 ngồi 60 ◦C.

Để xác định sự hiện diện của các bộ khuếch đại PCR không đặc hiệu hoặc mức độ mồi dimer cao, chúng tôi đã thực hiện một giao thức đường cong phân ly sau mỗi phản ứng qPCR. Mỗi mẫu được phân tích ba lần với tổng thể tích phản ứng là 10 µL, bao gồm 15 ng cDNA, 5 µL Fast SYBR Green Master Mix (2X) (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA) và lượng tiến và lùi cần thiết mồi (Bảng 2).

Nước không có nucleotit được thêm vào thể tích cuối cùng là 10 µL. Mức độ biểu hiện gen được xác định bằng phương pháp so sánh Ct. Các kết quả được biểu diễn dưới dạng thay đổi lần và sự khác biệt về biểu hiện gen so với mức trung bình của nhóm đối chứng được chia tỷ lệ thành 1.

4.8. Phân tích và thống kê dữ liệu

Tất cả dữ liệu định lượng được thu thập đã được kiểm tra tính quy phạm bằng Shapiro–Wilk Wtest. Sự khác biệt về mô học và hóa mô miễn dịch giữa nhóm bị nhiễm và nhóm đối chứng được đánh giá bằng cách sử dụng xét nghiệm t-test của Học sinh hoặc xét nghiệm Mann–Whitney U tùy thuộc vào phân bố dữ liệu tham số hoặc không tham số.

Sự khác biệt thống kê giữa bốn vùng não khác nhau ở cừu bị nhiễm phế liệu được xác định bằng cách sử dụng phân tích phương sai một chiều (ANOVA), sau đó là bài kiểm tra hậu hoc Bonferroni hoặc bài kiểm tra Kruskal–Wallis, tùy thuộc vào phân bố dữ liệu tham số hoặc không tham số. Các phân tích thống kê dữ liệu qPCR được tiến hành từ giá trị ∆Ct trung bình cho mỗi gen.

Để so sánh thống kê giữa các nhóm bị nhiễm và nhóm đối chứng, xét nghiệm t-test của Học sinh hoặc xét nghiệm Mann–Whitney U được thực hiện tùy thuộc vào sự phân bố bình thường của từng gen và sự bằng nhau của các phương sai được xác định bằng xét nghiệm Levene. Sự khác biệt trong biểu thức được coi là có ý nghĩa ở mức p < 0.05.

Các ký hiệu sau đây được sử dụng để biểu thị giá trị p trong các hình: * p < 0.05; ** p Nhỏ hơn hoặc bằng 0.01; # p < 0.1. Phần mềm SPSS (SPSS Stats for Windows, Version 17.0, Chicago, IL, USA) đã được sử dụng để phân tích thống kê. Đồ thị được tạo bằng GraphPad Prism 6.0 (San Diego, CA, USA) và dữ liệu hiển thị trong các hình biểu thị giá trị trung bình và sai số chuẩn của giá trị trung bình (trung bình ± SEM).

5. Kết luận

Theo hiểu biết của chúng tôi, nghiên cứu hiện tại là nghiên cứu đầu tiên mô tả mức độ biểu hiện của gen TLR ở các vùng não khác nhau của cừu bị nhiễm phế liệu tự nhiên và chuột tg338 quá khổ bị nhiễm phế liệu thực nghiệm.

Nghiên cứu của chúng tôi cho thấy rõ ràng rằng TLR, và đặc biệt là TLR4 ở cừu và TLR1 và TLR2 ở chuột, có liên quan đến sinh bệnh học của phế liệu. Ngoài ra, trái ngược với tất cả các khu vực khác được nghiên cứu, cấu hình đặc biệt của biểu hiện gen TLR, cùng với hình thái vi mô độc đáo và bệnh lý thần kinh nhẹ được quan sát thấy ở vùng hải mã, cho thấy phản ứng miễn dịch đặc hiệu ở vùng não trong nhiễm trùng vết xước tự nhiên.

Tuy nhiên, sẽ cần có những nghiên cứu sâu hơn để mô tả đặc điểm biểu hiện TLR ở microglia, astroglia và tế bào thần kinh trong nhiễm trùng phế liệu để hiểu được vai trò chính xác của từng loại tế bào đối với tình trạng viêm thần kinh. Hơn nữa, vẫn chưa xác định được liệu kích hoạt TLR là phản ứng trực tiếp với độc tính của prion hay xảy ra thứ phát sau các cơ chế gây viêm khác.

TLR tạo thành mục tiêu đầy hứa hẹn cho các phương pháp điều trị bệnh toprion, và do đó cần hiểu rõ hơn về các phản ứng viêm thần kinh do TLR điều chỉnh để đảm bảo những tiến bộ hơn nữa trong lĩnh vực này.

Tài liệu bổ sung: Các tài liệu sau đây có sẵn trực tuyến tạihttps://www.mdpi.com/article/10.3390/ijms23073579/s1.

Đóng góp của tác giả: Khái niệm hóa, nghiên cứu và quản lý dữ liệu, MCG và LMC; viết-bản thảo chuẩn bị, MG-M., MCG, và LMC; phương pháp thử nghiệm, MG-M.;viết-đánh giá và chỉnh sửa, MG-M., MCG, LMC và AO; phương pháp in vivo, MB; mua lại tài trợ, RB và JJB; phương pháp phân tử, BS-P.; giám sát, MCG và JJB Tất cả các tác giả đã đọc và đồng ý với phiên bản đã xuất bản của bản thảo.

Kinh phí: Nghiên cứu này được tài trợ bởi "Departamento de Ciencia, Universidad y Sociedad delConocimiento" (Chính phủ Aragon) thông qua dự án "A05_20R: Enfermedades Priónicas, Vectoriales y Zoonosis Emergentes".

Tuyên bố của Ủy ban Đánh giá Thể chế: Tất cả các thủ tục liên quan đến động vật đều tuân thủ các hướng dẫn trong Luật Bảo vệ Động vật RD53/2013 của Tây Ban Nha và Chỉ thị của Liên minh Châu Âu 2010/63 về bảo vệ động vật được sử dụng cho mục đích thí nghiệm. Quy trình đã được phê duyệt bởi Ủy ban về đạo đức thí nghiệm động vật của Đại học Zaragoza (Số giấy phép: PI38/159 tháng 10 năm 2015 và PI19/14 11 tháng 4 năm 2014).

Tuyên bố đồng ý sau khi được thông báo: Không áp dụng.

Tuyên bố về tính sẵn có của dữ liệu: Dữ liệu được trình bày trong nghiên cứu này có sẵn trong văn bản bài viết, số liệu và tài liệu bổ sung.

Lời cảm ơn: Chúng tôi cảm ơn Olivier Andreoletti (UMR INRAEENVT 1225-IHAP) và VincentBeringue (UMR VirologieImmunologieMoleculaires (VIM-UR892), INRAE, Universite Paris-Saclay) vì đã vui lòng cung cấp chuột tg338 được sử dụng cho các thí nghiệm này.

Xung đột lợi ích: Các tác giả tuyên bố không có xung đột lợi ích. Các nhà tài trợ không có vai trò gì trong việc thiết kế nghiên cứu; trong việc thu thập, phân tích hoặc giải thích dữ liệu; trong việc viết bản thảo hoặc trong quyết định công bố kết quả. Các hình ảnh và số liệu trong bản thảo này là dữ liệu gốc.

Tài liệu tham khảo

1. Andreoletti, O.; Berthon, P.; Marc, D.; Sarradin, P.; Grosclaude, J.; van Keulen, L.; Schecher, F.; Elsen, JM; Lantier, F. Tích lũy sớm PrP(Sc) trong các mô thần kinh và bạch huyết liên quan đến ruột của những con cừu nhạy cảm từ đàn Romanov mắc bệnh tự nhiên. J. Tướng Virol. 2000, 81 Điểm 12, 3115–3126. [CrossRef] [PubMed]

2. Prusiner, bệnh SB Prion và cuộc khủng hoảng BSE. Khoa học 1997, 278, 245–251. [CrossRef] [PubMed]

3. McBride, PA; Schulz-Schaeffer, WJ; Donaldson, M.; Bruce, M.; Diringer, H.; Kretzschmar, HA; Beekes, M. Sự lây lan sớm của phế liệu từ đường tiêu hóa đến hệ thần kinh trung ương liên quan đến các sợi tự trị của dây thần kinh nội tạng và phế vị.J. Virus. 2001, 75, 9320–9327. [Tham khảo chéo]

4. Mabbott, NA; MacPherson, GG Prions và hành trình gây chết người của họ tới bộ não. Nat. Mục sư Vi sinh. 2006, 4, 201–211. [Tham khảo chéo]

5. Wemheuer, WM; Benestad, SL; Wrede, A.; Wemheuer, CHÚNG TÔI; Brenig, B.; Bratberg, B.; Schulz-Schaeffer, WJ PrPSc mô hình lan truyền trong não cừu liên kết với các loại prion khác nhau. Bác sĩ thú y. Res. 2011, 42, 32. [Tham khảo chéo]

6. Betmouni, S.; Perry, VH; Gordon, JL Bằng chứng về phản ứng viêm sớm trong hệ thần kinh trung ương của chuột bị mất mảnh phế liệu. Khoa học thần kinh 1996, 74, 1–5. [Tham khảo chéo]

7. Sandberg, MK; Al-Doujaily, H.; Sắc nhọn, B.; De Oliveira, MW; Schmidt, C.; Richard-Londt, A.; Lyall, S.; Linehan, JM; Thương hiệu, S.; Wadsworth, JD; và cộng sự. Bệnh lý thần kinh Prion diễn ra sau sự tích tụ của các dạng đồng phân protein prion thay thế sau khi hiệu giá nhiễm trùng đã đạt đến đỉnh điểm. Nat. Cộng đồng. 2014, 5, 4347. [Tham khảo chéo]

8. Vincenti, JE; Murphy, L.; Graber, K.; McColl, BW; Cancellotti, E.; Freeman, TC; Manson, JC Xác định phản ứng của microglia trong quá trình thoái hóa thần kinh mãn tính theo thời gian. J. Virus. 2015, 90, 3003–3017. [Tham khảo chéo]

9. Aguzzi, A.; Zhu, C. Microglia trong bệnh prion. J. Lâm sàng. Điều tra. 2017, 127, 3230–3239. [Tham khảo chéo]

10. Chướng ngại vật, J.; Simon, E.; Mancuso, R.; Gomez-Nicola, D. Vai trò của Microglia trong bệnh Prion: Một mô hình về sự đa dạng chức năng.Front. Khoa học thần kinh lão hóa. 2017, 9, 207. [Tham khảo chéo]

11. Lawson, LJ; Perry, VH; Dri, P.; Gordon, S. Sự không đồng nhất trong sự phân bố và hình thái của microglia trong não chuột trưởng thành bình thường. Khoa học thần kinh 1990, 39, 151–170. [Tham khảo chéo]

12. Matyash, V.; Kettenmann, H. Tính không đồng nhất trong hình thái và sinh lý tế bào hình sao. Độ phân giải não. Rev. 2010, 63, 2–10. [CrossRef][PubMed]

For more information:1950477648nn@gmail.com