Echinacoside bảo vệ chống lại rối loạn chức năng ty thể do 6-Hydroxydopamine gây ra và phản ứng viêm trong tế bào PC12 thông qua việc giảm sản xuất ROS

Liên hệ: Audrey Hu Whatsapp / hp: 0086 13880143964 Email:audrey.hu@wecistanche.com

Yue-Hua Wang, 1,2 Zhao-Hong Xuan, 3 Shuo Tian, 1 và Guan-Hua Du1,2

Bệnh Parkinson (PD) là một rối loạn thoái hóa thần kinh đặc trưng bởi sự mất dần dần các tế bào thần kinh dopaminergic (DA) tại substantia nigra. Rối loạn chức năng ty thể và phản ứng viêm có liên quan đến cơ chế tổn thương tế bào trong PD. 6-Hydroxydopamine (6-OHDA), một chất tương tự dopamine, đặc biệt làm hỏng các tế bào thần kinh dopaminergic.Echinacoside ·(ECH) là một glycoside phenylethanoid được phân lập từ thân câyCistanche · Salsa, cho thấy một loạt các tác dụng bảo vệ thần kinh trong các nghiên cứu trước đây. Nghiên cứu hiện tại là để điều tra tác dụng của nó chống lại độc tính thần kinh do 6-OHDA gây ra và các cơ chế có thể có trong tế bào PC12. Kết quả cho thấy 6-OHDA làm giảm khả năng tồn tại của tế bào, giảm hoạt động oxy hóa-giảm, giảm tiềm năng màng ty thể và gây ra quá trình chết rụng qua trung gian ty thể so với các tế bào PC12 không được điều trị. Tuy nhiênechinacosideđiều trị làm giảm đáng kể những thay đổi này gây ra bởi 6-OHDA. Ngoài raechinacosidecũng có thể làm giảm đáng kể các phản ứng viêm gây ra bởi 6-OHDA. Nghiên cứu sâu hơn cho thấy rằngechinacosidecó thể làm giảm sản xuất ROS do 6 OHDA gây ra trong các tế bào PC12. Những kết quả này cho thấy cơ chế cơ bản củaechinacosidechống lại độc tính thần kinh do 6-OHDA gây ra có thể liên quan đến việc làm giảm rối loạn chức năng ty thể và phản ứng viêm bằng cách giảm sản xuất ROS.

1. Giới thiệu

Bệnh Parkinson (PD)là một rối loạn thoái hóa thần kinh đặc trưng bởi sự thoái hóa tiến triển chậm của các tế bào thần kinh dopamine trong substantia nigra pars compacta [1]. Mặc dù các dấu hiệu bệnh lý thần kinh của PD đã được mô tả rõ ràng, nguyên nhân vẫn chưa được xác định. Đáng chú ý, một số quan sát cho thấy rối loạn chức năng ty thể có liên quan đến cơ chế bệnh sinh của PD và sự thoái hóa của các tế bào thần kinh dopaminergic [2, 3]. Ty thể chứa nhiều enzyme oxi hóa khử và sự kém hiệu quả tự nhiên của quá trình phosphoryl hóa oxy hóa tạo ra các loại oxy phản ứng (ROS) [4]. Gần đây, ngày càng có nhiều bằng chứng từ các nghiên cứu trên người và động vật đã gợi ý rằng viêm thần kinh cũng là một yếu tố quan trọng gây ra sự mất mát nơ-ron thần kinh trong PD [5].

6-Hydroxydopamine (6-OHDA) là đặc hiệu cho các tế bào thần kinh dopaminergic trong các mô hình gặm nhấm intrastriatal và trong một số tế bào [6–11]. Tế bào PC12 đã trở thành một mô hình tế bào phổ biến cho nghiên cứu PD vì dòng tế bào này sở hữu nhiều đặc điểm của tế bào thần kinh DAergic. Nó đã được sử dụng như một mô hình in vitro để nghiên cứu pd và để xác định tác dụng của các tác nhân bảo vệ và điều trị. Echinacoside (Hình 1) là một glycoside phenylethanoid được phân lập và tinh chế từ thân câyCistanche · Salsa[12], một loài thực vật ký sinh có nguồn gốc từ tây bắc Trung Quốc, được sử dụng như một thử các cơ chế cơ bản của echinacoside chống lại 6-OHDA- gây radamageinPC12cells.

2. Vật liệu và phương pháp

2.1. Vật liệu. Echinacoside được lấy từ Viện Kiểm soát Thực phẩm và Dược phẩm Quốc gia (Bắc Kinh, Trung Quốc). RPMI-1640 và huyết thanh bò của thai nhi được lấy từ Gibco

(Grand Island, NY, Hoa Kỳ). 6-OHDA, MTT, 2,7-dichlorodihydrofluorescein diacetate, propidium iodide (PI), và resazurin đã được mua từ Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, Hoa Kỳ). Bộ xét nghiệm phát quang sinh học ATP được lấy từ Promega (Madison, Hoa Kỳ). 5,5,6,6 -Tetrachloro-1,1,3,3 -tet- raethyl benzimidazolyl carbocyanine iodide (JC-1) được lấy từ Viện Công nghệ sinh học Beyotime (Hải Môn, Giang Tô, Trung Quốc). Bộ cytochrome C ELISA và chất nền fluorogenic Ac-DVD-AMC được lấy từ Invitrogen (Carlsbad, CA, Hoa Kỳ). Bộ dụng cụ IL-1 và IL-6 ELISA được lấy từ công ty TNHH Boster Bio-engineer (Vũ Hán, Trung Quốc). Đầu đọc microplate Spectramax M5 được mua từ công ty Thiết bị phân tử (Sunnyvale, CA, Hoa Kỳ).

2.2. Nuôi cấy và điều trị tế bào. Các tế bào PC12 được phát triển trong RPMI-1640 được bổ sung 10% huyết thanh ngựa và 5% huyết thanh bò của thai nhi. Điều kiện được duy trì ở mức 37∘C trong môi trường ẩm ướt chứa 5% CO2 [19]. Các tế bào được mạ thành các tấm 96 giếng với mật độ 2 × 105 tế bào / mL. Sau khi hợp lưu 80%, các tế bào đã được điều trị trước với nồng độ echinacoside khác nhau trong môi trường RPMI-1640 không chứa huyết thanh trong 1 giờ. Sau đó, 6-OHDA được thêm vào các giếng ở nồng độ cuối cùng là 100 M và ủ cho một cái khác Sau khi điều trị, những thay đổi hình thái đã được quan sát thấy dưới kính hiển vi. Khả năng tồn tại của tế bào được đánh giá bằng xét nghiệm MTT [19]. Tóm lại, sau khi điều trị, MTT ở nồng độ cuối cùng là 0,5 mg / mL đã được thêm vào mỗi giếng và ủ trong 4 giờ ở 37∘C.

2.3.Thay đổi hình thái và khả năng tồn tại xét nghiệm tế bào PC12. Sau khi điều trị, những thay đổi hình thái đã được quan sát dưới kính hiển vi. Khả năng tồn tại của tế bào được đánh giá bằng xét nghiệm MTT [19]. Tóm lại, sau khi điều trị, MTT ở nồng độ cuối cùng là 0,5 mg / mL đã được thêm vào mỗi giếng và ủ trong 4 giờ ở 37∘C. Sau đó, chất siêu bền đã được loại bỏ và sản phẩm formazan được hòa tan trong 100 L dimethyl sulfoxide với việc khuấy trong 15 phút trên máy lắc tấm microtiter và độ hấp thụ được đọc ở 570 nm bằng đầu đọc microplate Spectramax M5. Thuốc bổ sung và thay thế dựa trên bằng chứng

2.4. Xét nghiệm mức ATP nội bào. Mức ATP tế bào được đo bằng bộ xét nghiệm phát quang sinh học ATP theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Phát quang được theo dõi trên đầu đọc microplate ở chế độ phát quang sau khi bổ sung 100 L luciferin và luciferase [20].

2.5. Đo lường hoạt động oxy hóa-khử ty thể bằng Resazurin. Sau khi xử lý, resazurin ở mức cuối cùng của concen- tration 5 M đã được thêm vào các giếng và cường độ huỳnh quang được kiểm tra ở mức kích thích 530 nm và phát xạ 590 nm [21].

2.6. Đo tiềm năng màng ty thể bằng JC-1. Tiềm năng màng ty thể được đo bằng bộ xét nghiệm JC-1 theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Sau khi xử lý, môi trường nuôi cấy đã được loại bỏ và nạp dung dịch JC-1 trong 15 phút ở 37∘C trong bóng tối. Cường độ huỳnh quang của tỷ lệ đỏ / xanh lá cây được xác định ở mức kích thích 490 nm và phát xạ lần lượt là 530 nm (monome huỳnh quang màu xanh lá cây) và 590 nm (tập hợp huỳnh quang đỏ), [22].

2.7. Định lượng giải phóng Cytochrome C. Nồng độ cytochrome C cytosolic được đo bằng bộ ELISA theo hướng dẫn của nhà sản xuất [23]. Tóm lại, sau khi điều trị, các tế bào được ly giải và ly tâm ở mức 1000 g trong 15 phút, và sau đó chất siêu âm được thu thập dưới dạng một phần tế bào chất và được sử dụng cho các phép đo giải phóng cytochrome C.

2.8. Xác định Hoạt động caspase-3. Hoạt động Caspase-3 được thực hiện theo các tài liệu tham khảo với sửa đổi [24]. Tóm lại, sau khi điều trị, bộ đệm ly giải wasaddedtoeach tốt và sau đó là ly tâm ở 12 000 g trong 10 phút. Hoạt tính caspase-3 đã được thử nghiệm trong các chất siêu âm kết quả bằng cách đo sự phân tách phân giải protein của chất nền fluorogenic Ac-DVD-AMC với bước sóng kích thích là 380 nm và bước sóng phát xạ là 460 nm.

2.9. Xét nghiệm tế bào học dòng chảy trong tế bào PC12. Sau khi điều trị, các tế bào được thử nghiệm, rửa hai lần bằng PBS, ly tâm ở tốc độ 1000 r / phút trong 5 phút, và sau đó cố định bằng ethanol 70% qua đêm ở 4∘C. Các tế bào được ly tâm và rửa hai lần bằng PBS, được tái sử dụng trong PBS (chứa 50 g / mL RNaseA), nhuộm màu PI ở nồng độ cuối cùng là 10 M trong 30 phút ở nhiệt độ phòng trong bóng tối và đọc trong máy đo lưu lượng dòng chảy ở kích thích 488 nm [10].

2.10. Đo mức IL-1 và IL-6 bằng xét nghiệm ELISA. Môi trường tế bào PC12 được nuôi cấy được thu thập sau khi điều trị, và nồng độ IL-1 và IL-6 được đo bằng bộ dụng cụ ELISA có sẵn trên thị trường theo giao thức của nhà sản xuất.

2.11. Xác định mức độ loài oxy phản ứng nội bào. Sau khi ủ với 6-OHDA, các tế bào được nạp 10M H2DCFH-DA trong 30 phút ở 37∘C trong bóng tối. Cường độ huỳnh quang của DCF được đo tại một kích thích

Bước sóng Y học bổ sung và thay thế dựa trên bằng chứng là 495 nm và bước sóng phát xạ 530 nm trên đầu đọc microplate [25].

2.12. Phân tích thống kê. Tất cả dữ liệu được thể hiện dưới dạng trung bình ± SD. Phân tích thống kê kết quả được thực hiện bằng phân tích phương sai một chiều (ANOVA), tiếp theo là -test. Ý nghĩa thống kê đã được chấp nhận tại<>

3. Kết quả

3.1. EffectofEchinacosideonMorphologyand Cell Viabilityin PC12 Tế bào bị hư hại bởi 6-OHDA. Như thể hiện trong Hình 2 (A), khả năng tồn tại của các tế bào PC12 không có sự khác biệt đáng kể ở nồng độ 0,1∼10 M điều trị echinacoside cho

24 giờ. Như thể hiện trong Hình 2 (B), trong vòng 24 giờ sau khi điều trị chỉ bằng 6-OHDA, phần lớn các tế bào PC12 đã trải qua những thay đổi hình thái như chảy máu màng và co rút tế bào. Cotreatment với echinacoside bảo vệ các tế bào khỏi thiệt hại 6-OHDA. Xét nghiệm MTT cho thấy rằng việc điều trị các tế bào PC12 chỉ bằng 6-OHDA đã giúp giảm khoảng 25% tỷ lệ sống sót của tế bào trong vòng 24 giờ, trong khi đồng xử lý với 0,1 M, 1 M và 10 M echinacoside cho thấy giảm độc tính tế bào qua trung gian 6 OHDA (tất cả< 0.01,="" figure="">

3.2. Ảnh hưởng của Echinacoside đối với rối loạn chức năng ty thể gây ra bởi 6-OHDA trong tế bào PC12. Nồng độ ATP của tế bào đã giảm đáng kể sau khi ủ 24 giờ với 100M 6-OHDA, trong khi việc phối hợp với 1 Mand 10 M echinacoside làm giảm ATP qua trung gian 6-OHDA làm giảm những thay đổi đồng hóa trong tế bào PC12. Kết quả cho thấy rằng cotreatment với 1 Mand 10 M của echinacoside có thể làm giảm đáng kể suy giảm hoạt động oxy hóa ty thể gây ra bởi 6-OHDA (cả hai< 0.05="" and="" figure="">

Như thể hiện trong Hình 3 (c), điều trị với 100 M 6- OHDA trong 24 giờ dẫn đến giảm đáng kể tiềm năng màng ty thể so với nhóm không được điều trị (< 0.01).="" however,="" the="" decrease="" of="" mitochondrial="" membrane="" potential="" induced="" by="" 6-ohda="" was="" significantly="" attenuated="" by="" cotreatment="" with="" 0.1="" m,="" 1="" m,="" and="" 10="" m="" of="" echinacoside="" (all=""><>

3.3. Apoptosis qua trung gian chống ty thể của Echinacoside trong tế bào PC12 chống lại độc tính thần kinh 6-OHDA. Kết quả cho thấy phơi nhiễm 6-OHDA dẫn đến sự gia tăng cytoa cytochrome C tế bào học lên 167% so với nhóm không được điều trị (< 0.01).="" echinacoside="" at="" the="" dose="" of="" 0.1="" m,="" 1="" m,="" and="" 10m="" could="" significantly="" reduce="" the="" cytochrome="" c="" release="" into="" cytosol="" induced="" by="" 6-ohda="" (="">< 0.05,="">< 0.01,="" and="">< 0.01,resp.;="" figure="">

Hoạt tính của Caspase-3 đã tăng khoảng 3,3 lần so với nhóm không được điều trị sau khi tiếp xúc với 6-OHDA (< 0.01).="" in="" contrast,="" cotreatment="" with="" 1="" m="" and="" 10="" m="" of="" echinacoside="" showed="" a="" significant="" decrease="" in="" caspase-3="" activity="" compared="" with="" 6-ohda-treated="" cells,="" respectively="" (both="">< 0.05="" and="" figure="" 4(b)).pi="" is="" membrane="" permeability="" and="" is="" generally="" excluded="" from="" viable="" cells.="" so="" it="" is="" commonly="" used="" for="" identifying="" dead="" cells="" in="" a="" population.="" the="" results="" showed="" that="" the="" apoptosis="" rate="" was="" significantly="" increased="" following="" 24="" h="" incubations="" with="" 100="" m="" 6-ohda,="" whereas="" cotreatment="" with="" 1="" and="" 10="" m="" echinacoside="" significantly="" reduced="" 6-ohda-induced="" apoptosis="" (="">< 0.05,="">< 0.01,resp.,="" figure="">

3.4. Tác dụng chống viêm của Echinacoside trong tế bào PC12 gây ra bởi 6-OHDA. Kết quả cho thấy phơi nhiễm 6-OHDAresultedinanincreaseinIL-1 mức so với nhóm không được điều trị (< 0.05;="" figure="" 4(a)).="" however,="" 10="" m="" of="" echinacoside="" could="" significantly="" reduce="" il-1="" release="" induced="" by="" 6-ohda="" (="">< 0.05;="" figure="">

Mức IL-6 cũng tăng đáng kể so với nhóm không được điều trị (< 0.01).="" however,="" cotreatment="" with="" 0.1,="" 1,="" and="" 10="" m="" of="" echinacoside="" all="" significantly="" decreased="" il-6="" release="" compared="" with="" 6-ohda-treated="" cells="" (both="">< 0.05="" and="" figure="">

3.5. Ảnh hưởng của ECH đối với sản xuất ROS gây ra bởi 6-OHDA trong tế bào PC12. Các tế bào được điều trị bằng 6-OHDA cho thấy sự gia tăng đáng kể (khoảng 1,4 lần) ROS nội bào so với các tế bào không được điều trị (< 0.01).="" this="" increase="" was="" significantly="" attenuated="" by="" coincubation="" with="" 0.1,="" 1,="" and="" 10="" m="" echinacoside="" (="">< 0.05,="">< 0.01,and="">< 0.01,resp.;="" figure="">

4. Thảo luận

Echinacoside là một trong những thành phần chính của glycoside phenylethanoid được chiết xuất từ một loại echinacoside truyền thống nổi tiếng được báo cáo có đặc tính chống apoptotic và neuroprotective trong bệnh thoái hóa thần kinh [18]. Nghiên cứu in vivo báo cáo rằng echinacoside có tác dụng bảo vệ thần kinh và cải thiện hành vi trong mô hình chuột của tổn thương thần kinh dopaminergic do MPTP gây ra, trong khi điều tra sâu hơn cho thấy rằng echinacoside gây ra sự điều hòa giảm kích hoạt caspase-3 và caspase-8 trong quá trình apoptosis do MPP + gây ra của các tế bào thần kinh hạt tiểu não [16]. Một nghiên cứu in vivo khác đã báo cáo tác dụng bảo vệ thần kinh của echinacoside đối với các tế bào thần kinh dopaminergic vân bị tổn thương bởi 6-OHDA [17]. Tuy nhiên, các cơ chế tế bào và phân tử làm nền tảng cho những hành động này không được hiểu đầy đủ, đặc biệt là ảnh hưởng của chúng đối với chức năng ty thể và phản ứng viêm. Vì vậy, nghiên cứu hiện tại của chúng tôi đã điều tra tác dụng của echinacoside đối với chức năng ty thể và phản ứng viêm để làm sáng tỏ cơ chế của nó chống lại PD. Kết quả lần đầu tiên cho thấy echinacoside đã làm giảm đáng kể độc tính thần kinh do 6-OHDA gây ra trong các tế bào PC12 thông qua việc bảo vệ chức năng ty thể và chống viêm.

Rối loạn chức năng ty thể từ lâu đã liên quan đến cái chết của các tế bào thần kinh dopaminergic nigrostrital trong bệnh Parkin- son và các mô hình thử nghiệm của nó [26]. Ty thể tham gia sâu vào việc sản xuất các loài oxy phản ứng (ROS) thông qua các chất mang electron của chuỗi hô hấp trong các bệnh thoái hóa thần kinh [27]. Một loạt các ROS được sản xuất trong quá trình trao đổi chất bình thường trong các hệ thống sinh học, nhưng sự tích lũy của chúng vượt ra ngoài

lượng cần thiết có thể có khả năng làm hỏng lipid, protein và axit nucleic.

6-OHDA, một chất tương tự catecholamine, gây ra sự thoái hóa cụ thể của các tế bào thần kinh nigra substantia. Độc tính thần kinh gây ra bởi 6-OHDA, một phần, là do việc sản xuất ROS [28–32].

OHDA dẫn đến tử vong tế bào thần kinh bằng cách ảnh hưởng đến chức năng ty thể, bao gồm giảm sản xuất ATP, rối loạn chuyển hóa ROS và gây ra quá trình apoptosis [10, 33, 34]. Trong nghiên cứu hiện tại, kết quả của chúng tôi cũng chứng minh rằng 6-OHDA đã làm hỏng chức năng oxy hóa-khử ty thể, giảm tiềm năng màng ty thể, gây ra quá trình chết rụng qua trung gian ty thể và tăng sản xuất ROS trong tế bào PC12.

Resazurin là một chỉ số huỳnh quang chỉ trung gian giữa quá trình giảm oxy phân tử cuối cùng và cytochrome oxidase. Do đó, tiềm năng oxy hóa-giảm của resazurin cho phép chuỗi hô hấp hoạt động gần như hoàn thành, điều này sẽ cung cấp một dấu hiệu chính xác và nhạy cảm hơn về chức năng ty thể. JC-1 là một đầu dò nhạy cảm với tiềm năng của màng tế bào khu trú đến màng ty thể bên trong, nơi nó tạo thành các monome (màu xanh lá cây) hoặc tập hợp (màu đỏ) dựa trên tiềm năng của màng ty thể. Do đó, resazurin và JC-1 là những công cụ phân tích có giá trị để kiểm tra chức năng ty thể [35]. Nghiên cứu hiện tại chỉ ra rằng việc giảm hoạt động oxy hóa-giảm ty thể và tiềm năng màng ty thể có thể đóng vai trò quan trọng trong độc tính thần kinh dopaminergic do 6-OHDA gây ra. Kết quả của chúng tôi cũng cho thấy hoạt động oxy hóa-khử ty thể và tiềm năng màng ty thể. Những kết quả này cung cấp rằng cải thiện rối loạn chức năng ty thể có thể là một cách tốt hơn để làm chậm thoái hóa thần kinh dopaminergic tiến triển thường liên quan đến PD.

Người ta thường chấp nhận rằng quá trình chết rụng tế bào gây ra bởi 6- OHDA được trung gian bởi rối loạn chức năng ty thể, đặc trưng bởi giải phóng cytochrome C và kích hoạt caspase-3 [36]. Một kích thích apoptotic kích hoạt sự giải phóng cytochrome C từ ty thể vào cytosol, nơi nó sau đó kích hoạt caspase-3 và các caspases hạ lưu khác. Trong nghiên cứu hiện tại, kết quả cho thấy các tế bào PC12 tiếp xúc với 100 M giải phóng cytochrome C tăng cường 6-OHDA và caspase phụ thuộc vào sự giải phóng cytochrome C và hoạt hóa caspase- 3. Những kết quả này cho thấy echinacoside có thể ức chế quá trình chết rụng qua trung gian ty thể bằng cách giảm giải phóng cytochrome C từ ty thể sang hoạt hóa cytosol và caspase-3.

Viêm là một đặc điểm bệnh lý thần kinh của não Parkinson và cũng trong các mô hình thử nghiệm của bệnh. Các chiến lược điều trị hướng tới việc giảm viêm và ức chế sản xuất các yếu tố viêm này có thể là một chiến lược bảo vệ thần kinh đầy hứa hẹn để điều trị bệnh Parkinson và các tình trạng liên quan [37]. Một số nghiên cứu cũng được thực hiện trong dịch não tủy và trong quá trình phân tích sau khi chết ở bệnh nhân Parkinson cho thấy nồng độ cytokine tăng lên, chẳng hạn như interleukin-1 (IL-1) và interleukin-6 (IL-6), cho thấy sự kích hoạt của aproinflammatoryresponse [38, 39]. Trong nghiên cứu hiện tại, kết quảshowedthatexposureto100 Mof6-OHDAinduced IL-1 và IL-6 phát hành trong các tế bào PC12. Tuy nhiên, điều trị bằng echinacoside có thể ức chế phụ thuộc vào liều lượng IL-1 và IL-6 giải phóng do 6-OHDA gây ra. Kết quả cho thấy rằng việc giảm phản ứng viêm cũng liên quan đến các cơ chế của echinacoside chống lại độc tính thần kinh do 6-OHDA gây ra.

Tóm lại, kết quả của nghiên cứu này cho thấy echinacoside có thể ngăn chặn độc tính thần kinh do 6-OHDA gây ra trong các tế bào PC12, và các cơ chế có thể liên quan đến bảo vệ ty thể và chống viêm thông qua việc giảm sản xuất ROS. Thông tin được cung cấp bởi công việc này sẽ hữu ích để làm sáng tỏ cơ chế của echinacoside để chống PD. Người ta kết luận rằng echinacoside có thể là một lựa chọn điều trị đầy hứa hẹn để phòng ngừa và điều trị PD.

Xung đột lợi ích

Các tác giả đã tuyên bố không có xung đột lợi ích

Lời cảm ơn

Công việc này được hỗ trợ bởi các khoản tài trợ từ Quỹ Khoa học Tự nhiên Quốc gia Trung Quốc (81473383) và Dự án Lớn Khoa học và Công nghệ Quốc gia (2012ZX09103101-078; 2013ZX09103-001-008; và 2013ZX09102106).