Echinacoside làm chậm sự phát triển tế bào của tế bào nguyên bào sợi ở người MRC -5
Mar 10, 2022
Liên hệ: Audrey Hu Whatsapp / hp: 0086 13880143964 Email:audrey.hu@wecistanche.com
Các thành phần hoạt chất của Cistanche: Làm thế nào để echinacoside chống lão hóa?
Hong Xie 1, Hui Zhu1,2, Cong Cheng1, Yu Liang1, Zhao Wang1
Trong nghiên cứu này, tác động của echinacoside, một trong những phenylethanoids được phân lập từ thân cây Cistanches salsa, một loại thảo dược cổ truyền của Trung Quốc, trên tế bào MRC -5 nguyên bào sợi ở phổi phôi thai người, đã được nghiên cứu. Hoạt động tăng sinh tế bào được đánh giá bằng Alamar Blue, cho thấy rằng điều trị bằng echinacoside có thể làm chậm quá trình lão hóa. Kết quả đo tế bào dòng chảy cho thấy echinacoside có thể kích hoạt các tế bào ở pha G1 bước vào pha S và pha G2, và có thể cải thiện sự suy thoái ROS. Kết quả từ thử nghiệm sao chổi chỉ ra rằng echinacoside có thể bảo vệ tế bào khỏi bị tổn thương DNA, phần nào làm sáng tỏ cơ chế tác động của nó. Tất cả các kết quả trên cho thấy echinacoside có tiềm năng hoạt động chống lão hóa.
Cistanche Desticola có nhiều tác dụng, click vào đây để biết thêm
1. Giới thiệu
Các tế bào bình thường được nuôi cấy trong ống nghiệm sẽ sinh sôi nảy nở trong một số lần nhân đôi dân số giới hạn ('giới hạn Hayflflick') và bước vào giai đoạn lão hóa sao chép. Tế bào hình lưỡi liềm trải qua quá trình ngừng phát triển tế bào trong pha G1 và thay đổi hình thái và chuyển hóa, bao gồm mở rộng tế bào, tăng sinh lysosome và biểu hiện hoạt động của -galactosidase cao hơn ở pH 6 (-galactosidase liên quan đến lão hóa, SA - - - Gal ) (Hayflflick và Moorhead 1961; Dimri 1995). Sự tích tụ của các tế bào tuổi già tiên lượng sự suy giảm liên quan đến tuổi tác trongkhăn giấy/đàn organchức năng. Để tiếp cận cách trì hoãn hoặc đảo ngược quá trình lão hóa, nỗ lực khám phá các chất chống lão hóa tích cực chưa bao giờ ngừng lại.Echinacosidelà một trong những phenylethanoids được phân lập từ thân củaCistanches salsa, một loại thuốc thảo dược truyền thống của Trung Quốc, có các hoạt tính sinh học tiềm năng, cả như một chất kháng huyết thanh vàchống mệt mỏiđại lý (Deng et al. 2004; Xiong et al. 1996). Nó cũng đã được báo cáo là hoạt động trong ống nghiệm như là mộttự docăn bảnngười nhặt rác(Facino và cộng sự 1995) và các cuộc triển lãmbảo vệ thần kinhcác hoạt độngin vitro và in vivo (Koo et al. 2005; Geng et al. 2007). Echinacoside có thể là một ứng cử viên cho chất chống lão hóa, và hoạt động chống lão hóa có thể là một trong những đặc tính sinh học của nó. Do đó, chúng tôi đã điều trị dòng tế bào nguyên bào sợi phổi của phôi thai người già MRC -5 bằng echinacoside, hy vọng nó có thể làm chậm hoặc đảo ngược quá trình lão hóa.
2. Điều tra và kết quả
Đầu tiên, chúng tôi thêm echinacoside vào môi trường nuôi cấy để kiểm tra ảnh hưởng của nó đối với sự phát triển của tế bào và chu kỳ tế bào. Quan sát thấy rằng khả năng sống sót của các tế bào trong 48 giờ tiếp xúc với echinacoside tăng lên rõ ràng so với đối chứng, khi nồng độ tăng lên (Hình 1A), cho thấy rằng echinacoside đã giúp các tế bào già tăng sinh. Kết quả nhuộm SA- Gal cho thấy mức SA- -Gal giảm rõ ràng sau khi điều trị echinacoside (dữ liệu không được hiển thị), cho thấy rằng một phần của tế bào già đã đảo ngược từ quá trình lão hóa. Để xác nhận xem liệu các tế bào già có thực sự được thúc đẩy tăng sinh bởi echinacoside hay không, phương pháp đo tế bào đồng nghiệp đã được giới thiệu để kiểm tra sự thay đổi giai đoạn chu kỳ tế bào của các tế bào MRC -5 già sau khi điều trị bằng echinacoside. Trong nghiên cứu của chúng tôi, chúng tôi quan sát thấy rằng với nồng độ Echinacoside tăng lên, tỷ lệ tế bào ở thời kỳ G1 bị giảm dần. Ngược lại, nhiều tế bào được thúc đẩy để đi vào pha S và pha G2 (Hình 1B). Sự tích tụ các ổ dị nhiễm sắc liên quan đến lão hóa (SAHF) là một dấu ấn sinh học cụ thể khác của các tế bào lão hóa (Shay và Wright 2001). Các tế bào hình lưỡi liềm hiển thị các ổ DNA bị đánh thủng được hình dung bằng phương pháp nhuộm Hoechst (Hình 1C). Ngược lại, các tế bào MRC -5 được điều trị bằng echinacoside dường như có ít SAHF hơn.
Mức độ của các loại oxy phản ứng (ROS) tăng lên khi các tế bào tiến gần đến giới hạn Hayflflick (Hutter et al. 2002). Việc điều trị liên tục các tế bào có mức ROS dưới mức gây chết không chỉ làm tăng mức độ của các sản phẩm gây hại do oxy hóa như lipofuscin (Sitte et al. 2001) mà còn gây ra sự ngừng phát triển vĩnh viễn kèm theo sự kích hoạt của chất ức chế tăng trưởng p 53- con đường (Toussaint và cộng sự 2000). Do đó, ở cấp độ tế bào, ROS đóng một vai trò quan trọng trong việc tạo ra sự lão hóa. Thuốc nhuộm huỳnh quang FL DCFH-DA được sử dụng để đo hàm lượng ROS bằng phương pháp đo tế bào. Nó được chỉ ra rằng so với đối chứng, hàm lượng ROS đã giảm rõ ràng trong các tế bào được ủ với echinacoside (Hình 2A). Những kết quả này chỉ ra rằngechinacosidecó thể hoạt động như một chất chống oxy hóa, giảm sản xuất ROS hoặc tăng tốc loại bỏ ROS.
Các loại oxy phản ứng tích lũy (ROS) gây ra sự suy giảm đáng kể của các đại phân tử trong tế bào, bao gồm protein, DNA và telomere (Kovtun et al. 2007). Các tổn thương DNA bị oxy hóa kích hoạt p 53- bắt giữ sự phát triển G1 phụ thuộc, sau sự biểu hiện của p21Waf -1 / SDI -1 / Cip1 (Chen và cộng sự 1998) và sự già đi của tế bào ở nguyên bào sợi ở người bình thường. Chúng tôi đã sử dụng một xét nghiệm sao chổi để đo mức độ hư hỏng của DNA và việc sửa chữa nó. Kích thước của các đoạn DNA và số lần đứt gãy xác định sự di cư và hình thái của sao chổi được nhìn thấy. Hàm lượng DNA đuôi (sản phẩm của chiều dài đuôi và hàm lượng DNA ở đuôi) tăng lên khi bị hư hại. Kết quả của chúng tôi cho thấy tiền xử lý bằng echinacoside có thể thúc đẩy một phần việc sửa chữa các tổn thương DNA, ít nhất là bảo vệ các tế bào khỏi các tổn thương DNA do H2O2 gây ra (Hình 2B). Dựa trên những dữ kiện này, chúng tôi kết luận rằng echinacoside có hoạt tính chống lão hóa ít nhất trong tế bào MRC -5. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cho thấy echinacoside có thể làm giảm sự tích tụ ROS, bảo vệ tế bào khỏi bị tổn thương DNA, thúc đẩy tế bào MRC -5 từ pha G1 sang pha S và G2, và do đó cải thiện sự tăng sinh của tế bào. Nói chung, tác động của echinacoside lên tế bào MRC -5 có thể được chia thành hai khía cạnh: thúc đẩy tăng sinh tế bào và giảm tích tụ ROS. Mặc dù cơ chế chính xác của sự lão hóa tế bào vẫn chưa được biết và mạng lưới điều hòa chu kỳ tế bào vẫn còn gây tranh cãi, chúng tôi đã chứng minh rằng echinacoside có thể bảo vệ tế bào khỏi bị tổn thương do oxy hóa. Do đó, chúng tôi suy đoán rằngechinacosidecó thể là một ứng cử viên tốt để điều chỉnh sự lão hóa, mặc dù cơ chế cơ bản chính xác vẫn là một câu hỏi mở và các nghiên cứu sâu hơn đang được tiến hành.
3. Thực nghiệm
3.1. Nuôi cấy và xử lý tế bào
Dòng tế bào nguyên bào sợi phổi phôi người MRC {{0}} (Viện Hóa sinh và Sinh học Tế bào, SIBS, CAS) được duy trì trong môi trường thiết yếu tối thiểu đã được sửa đổi (Gibco / BRL) và được bổ sung 10% huyết thanh bò thai. Tế bào MRC -5 trải qua quá trình già đi tái tạo sau nhiều lần phân bào, được đánh giá bằng sự chậm lại của quá trình trao đổi chất và ngừng phân chia trong vòng 7 ngày. Tất cả các mẫu cấy được gieo ở mật độ tế bào 104 / cm2 trừ khi có ghi chú khác và được phép sinh sôi nảy nở, không bị xáo trộn, trong 7 ngày. Các nồng độ khác nhau của echinacoside đã được thêm vào 48 giờ trước khi kiểm tra với dung môi làm đối chứng trừ khi có quy định khác. Nồng độ DMSO trong các mẫu cấy nhỏ hơn 0,3% (v / v). Đối với xử lý H2O2, các tế bào được cảm ứng với 250 M H2O2 trong 12 giờ.
3.2. Thử nghiệm tỷ lệ sống sót
Tế bào được nuôi cấy và xử lý bằng echinacoside trên 96 đĩa giếng. Trước khi phát hiện, 10% Alamar BlueTM đã được thêm vào môi trường và ủ trong 4 giờ. Độ hấp thụ được đo bằng máy quang phổ.
3.3. Phân tích lưu lượng tế bào
Phương pháp đo tế bào dòng chảy được giới thiệu để đo hàm lượng DNA và mức ROS nội bào bằng cách sử dụng propidium iodide và DCFH-DA tương ứng. Tế bào được mạ ở mật độ 1 0 5cells / 10 ml dung dịch tế bào trong đĩa đường kính 100 mm và được bổ sung echinacoside trong 48 giờ sau khi cấy tế bào. Sau 48 giờ xử lý, tế bào được thu hoạch và rửa sạch trong PBS sau khi ly tâm, sau đó được ngâm lại trong dung dịch PBS với 0,1% RNase và 50 g / ml propidium iodide hoặc môi trường nuôi cấy chứa 10 M DCFH-DA trong 30 phút. Hàm lượng DNA hoặc ROS sau đó được xác định bằng cách phân loại tế bào kích hoạt huỳnh quang FL trên Hệ thống đo tế bào dòng Beckman Coulter. Dữ liệu được phân tích bằng phần mềm MultiCycle.
3.4. Hoechst nhuộm
Tế bào được nuôi cấy và xử lý bằng echinacoside trong 48 giờ trên đĩa 96 giếng. Môi trường được loại bỏ, tế bào được rửa bằng PBS, sau đó được cố định bằng 4% formaldehyde trong PBS trong 20 phút, tiếp theo rửa bằng PBS một lần, và nhuộm bằng thuốc nhuộm Hoechst trong 10 phút. Hình ảnh đã được chụp.
3.5. Điện di gel đơn bào (xét nghiệm sao chổi)
Thử nghiệm sao chổi đã được thực hiện theo báo cáo (Olive và Banath 2006). Hình ảnh sao chổi riêng lẻ được phân tích bằng phần mềm CometScore. Lời cảm ơn: Công trình này được hỗ trợ tài chính bởi Chương trình Nghiên cứu Cơ bản Quốc gia (Dự án 973) của Trung Quốc (Số 2007CB507406), Quỹ Khoa học Tự nhiên Quốc gia Trung Quốc (Số 30572341), và Quỹ Khoa học Y tế Tsinghua-Yue-Yuen (THYY20070008 ).
