Echinacoside kích thích tăng sinh tế bào và ngăn chặn quá trình chết của tế bào trong tế bào MODE-K biểu mô ruột bằng cách điều chỉnh tăng yếu tố tăng trưởng biến đổi - 1 Biểu hiện
Mar 11, 2022
Liên hệ: Audrey Hu Whatsapp / hp: 0086 13880143964 Email:audrey.hu@wecistanche.com
Yamin Jia, Qiunong Guan, Yuhai Guo và Caigan Du
trừu tượng
Cistanche Desticola MA(C. Desticola) đã được sử dụng rộng rãi như một loại thảo dược nhuận tràng trong y học thảo dược để điều trị hội chứng ruột kích thích hoặc táo bón, vàechinacoside từ cistanche(ECH) là một trong những thành phần hoạt tính sinh học chính trong thảo dược này. Mục đích của chúng tôi là nghiên cứu ảnh hưởng của ECH đối với sự phát triển và chết của tế bào biểu mô ruột. MODE-K, một dòng tế bào biểu mô ruột, được sử dụng làm mô hình in vitro của ruột. Sự tăng sinh tế bào được đo bằng xét nghiệm metyl thiazole tetrazolium (MTT). Quá trình chết rụng tế bào được xác định bằng phương pháp nhuộm Annexin-V. Ở đây, chúng tôi đã chỉ ra rằng trong các tế bào MODE-K được nuôi cấy, ECH đã kích thích đáng kể sự tăng sinh tế bào và tăng cường khả năng sống sót của tế bào bằng cách giảm quá trình chết rụng tế bào khi có mặt H2O2 hoặc hỗn hợp các cytokine tiền viêm, đồng thời chuyển đổi yếu tố tăng trưởng (TGF) - 1 sự biểu hiện được điều chỉnh một cách phụ thuộc vào liều lượng. Knockdown của biểu hiện TGF - 1 làm gián đoạn cả hoạt động tăng sinh và bảo vệ tế bào của ECH, điều này được xác nhận thêm bằng cách trung hòa hoạt động TGF - 1 bằng cách sử dụng kháng thể kháng TGF - 1. Những dữ liệu này cho thấy rằng ECH là một trong những thành phần hoạt tính sinh học trong thảo dược C. sa mạc-nia và những loại khác có thể cải thiện quá trình sửa chữa mô niêm mạc bằng cách kích thích tăng sinh tế bào biểu mô ruột và ngăn chặn tế bào chết thông qua điều hòa TGF-.
Từ khóa: Cistanche Desticola, biểu mô ruột, tăng sinh tế bào, apoptosis tế bào, yếu tố tăng trưởng biến đổi (TGF) -
Giới thiệu
Cistanche Desticola MA(C. Desticola) thường được gọi là Rou Cong Rong trong y học thảo dược Trung Quốc, và nó đã trở thành một loại cây trồng mới ở Trung Quốc do được sử dụng trong y tế (1). Lợi ích lâm sàng của nó đã được báo cáo trong việc điều trị nhiều vấn đề sức khỏe bao gồm táo bón mãn tính (2, 3) và tác dụng có lợi của nó có liên quan đến hoạt động nhuận tràng của nó trong ruột; nó tăng cường làm ẩm phân, thúc đẩy chuyển động ruột ở bệnh nhân (4, 5), cũng như ở các mô hình động vật (6, 7). Nghiên cứu gần đây của chúng tôi chứng minh rằng việc uống chiết xuất từ nước của C. sa mạc phủ làm giảm đáng kể số lượng tăng sản viêm trong ruột của những con chuột dễ bị ung thư đại trực tràng (8).
Echinacoside từ cistanche (ECH) is a major component of phenylethanoid glycosides (PhG) (>50% tổng số PhG) được phân lập từ C. sa mạc (9) và đã được sử dụng như một dấu ấn sinh học để kiểm tra chất lượng của thuốc nhuận tràng chứa C. sa mạc, Ronggui Tongbian Capsule (10) hoặc để kiểm soát chất lượng sản xuất C. sa mạc (11). ECH đã được chứng minh là có khả năng bảo vệ tế bào trên cả mô hình động vật bị bệnh Parkinson (12, 13) và mô hình tổn thương phổi (14) và trong các tế bào pheochromocytoma được nuôi cấy (PC12) (15, 16); và nó đã được chứng minh là có khả năng tăng cường sự phân chia tế bào của các tế bào nguyên bào sợi ở người (MRC -5) (17). Trong nghiên cứu này, ảnh hưởng của ECH với tư cách là một thành phần hoạt tính sinh học chính của C. Desticola đối với sự tăng sinh và tồn tại của tế bào trong các tế bào biểu mô ruột được nuôi cấy đã được kiểm tra để tìm hiểu tác dụng dược lý của thuốc thảo dược chứa C. sa mạcza trong điều trị rối loạn đường ruột. .
Nguyên liệu và phương pháp
Nuôi cấy tế bào
MODE-K là một dòng tế bào biểu mô ruột có nguồn gốc từ chuột C3H / HeJ (18 tuổi) được cung cấp bởi Tiến sĩ Theodore Steiner (Viện nghiên cứu sức khỏe ven biển Vancouver, Vancouver, Canada). Tế bào MODE-K được nuôi cấy trong môi trường Eagle's cải tiến (DMEM) của Dulbecco, được bổ sung 10% huyết thanh bò thai (FBS) ở 37 độ dưới 5% CO2 trong không khí.
echinacoside từ cistanche (ECH) chuẩn bị
ECH (echinacoside từ cistanche) được tinh chế thêm từ chiết xuất C. tubulosa thương mại (chứa Cao hơn hoặc bằng 70% ECH, Tianlife TLCT-E70; Sinphar Tian-Li Pharmaceutical Co., Ltd., Hàng Châu, Trung Quốc) bằng cách chiết xuất etanol lặp đi lặp lại, sau đó là không khí- làm khô trong tủ hút hóa chất. Chất còn lại được tiếp tục làm khô bằng cách đông khô. ECH trong sản phẩm cuối cùng đã được xác nhận bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (Hình 1).
Knock-down biểu thức yếu tố tăng trưởng chuyển đổi (TGF) - 1
Biểu hiện TGF - 1 trong các tế bào MODE-K đã bị loại bỏ bởi sự biểu hiện ổn định của shRNA đặc biệt chống lại bản sao TGF - 1 (19). Tóm lại, trình tự oligonucleotide để tạo shRNA nhắm mục tiêu TGF - 1 mRNA của chuột (5′-AAC CAA GGA GAC GGA ATA CAG -3 ′) và kiểm soát không đặc hiệu (xáo trộn) (5′-AAT CGC ATA GCG TAT GCC GTT -3 ′) đã được mô tả trước đây (19, 20) và chúng được tổng hợp bởi Integrated DNA Technologies Inc. (Coralville, IA, USA). Mỗi trình tự được liên kết thành một vectơ pHEX-siRNA (21). Các vectơ được truyền vào tế bào MODE-K bằng cách sử dụng Lipofectamine2000 (Invitrogen-Gibco, Carlsbad, CA, USA) theo quy trình của nhà sản xuất. Cả hai tế bào shRNA được chuyển gen kháng TGF - 1 (MODE-Ktgfb) và shRNA được chuyển đổi có xáo trộn (MODE-Kscr) đều được phát triển với sự hiện diện của Zeocin (lên đến 500 ug / mL) (Invitrogen-Gibco) và được chọn lọc bằng cách phân loại tế bào bằng phương pháp đo tế bào dòng chảy cho protein huỳnh quang xanh (GFP). Hơn 95% các tế bào được truyền nhiễm cho thấy huỳnh quang màu xanh lục mạnh trong phép đo dòng chảy hoặc kính hiển vi.
Xét nghiệm methylthiazol tetrazolium (MTT)
Thử nghiệm MTT được sử dụng để đo sự tăng sinh hoặc khả năng sống sót của tế bào trong môi trường nuôi cấy. Các tế bào đã được gieo hạt ở mức 25 0 0 mỗi giếng trong 96- các vi mô tốt và mỗi điều kiện đã được kiểm tra ít nhất trong bốn lần. Tóm lại, 10 μL 0,5 mg / mL 3- (4, 5- dimethylthiazol -2- yl) -2, 5- diphenyltetrazolium bromide (MTT; Sigma- Aldrich Canada, Oakville, ON, Canada) được thêm vào mỗi giếng và ủ ở 37 độ trong 4 giờ. Các tinh thể formazan trong các tế bào sống được sau đó được hòa tan trong 100 μL / giếng của dimethyl sulfoxide (DMSO, Sigma-Aldrich Canada). Độ hấp thụ của màu trong mỗi giếng được định lượng dưới dạng đơn vị độ hấp thụ (AU) ở bước sóng 560 nm bằng đầu đọc siêu vi quang ELx808 (BioTek, Winooski, VT, USA). Phần trăm thay đổi tăng sinh tế bào trong môi trường nuôi cấy được điều trị bằng thuốc so với đối chứng không điều trị bằng thuốc được tính như sau: phần trăm=(được điều trị bằng thuốc - Đối chứng) / Đối chứng × 100 phần trăm. Tốc độ tăng trưởng được tính như sau: Tốc độ tăng trưởng (AU / ngày)=(AUend - AUbegin) / thời gian (ngày), trong đó thời gian thể hiện khoảng thời gian kiểm tra, AUend đại diện cho các đơn vị hấp thụ ở cuối bài kiểm tra , và AU bắt đầu đại diện cho các đơn vị độ hấp thụ khi bắt đầu kiểm tra.
Phân tích phân loại tế bào kích hoạt huỳnh quang (FACS) về quá trình apoptosis
Phân tích FACS với Annexin-V – phycoerythrin (Annexin-V-PE) và nhuộm 7- amino-actinomycin D (7- AAD) được sử dụng để xác định quá trình tự chết của tế bào (Annexin-V dương tính: apoptosis sớm ; 7- AAD: apoptosis / hoại tử muộn) theo quy trình của nhà sản xuất (BD Biosciences, San Jose, CA, Hoa Kỳ). Do đó, trong biểu đồ FACS, các ô tồn tại ở góc phần tư phía dưới bên trái, ô apoptotic muộn ở góc phần tư phía trên bên trái (7- chỉ AAD dương tính), ô apoptotic ở góc phần tư phía trên bên phải (Cả Annexin-V và {{ 10}} AAD dương tính) và các tế bào apoptotic sớm ở góc phần tư phía dưới bên phải (chỉ Annexin-V dương tính). Tóm lại, sau khi xử lý, các tế bào được giải phóng bằng cách ủ ngắn với dung dịch trypsin-EDTA (Sigma Aldrich Canada) và sau đó được ủ với Annexin-V-PE trong đệm liên kết 1 × trong 15 phút. Sau khi chúng được rửa bằng PBS, các tế bào được nhuộm bằng 7- AAD. Cường độ huỳnh quang của tế bào apoptotic được đo bằng phương pháp đo tế bào dòng chảy và phân tích so với đối chứng nền bằng phần mềm CELLQUEST (BD Biosciences) hoặc FlowJo (Tree Star, Inc., Ashland, OR, USA).
Phản ứng chuỗi polymerase phiên mã ngược bán định lượng (RT-PCR)
Mức mRNA của TGF {{0}} được xác định một cách tương đối so với mức của glyceraldehyde -3- phosphate dehydrogenase (GAPDH) như một biện pháp kiểm soát nội bộ bằng cách sử dụng bộ dụng cụ RT-PCR (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA ) như đã mô tả trước đây (19). Cả bản sao TGF - 1 và GAPDH trong cùng một sự chuẩn bị cDNA được khuếch đại bằng PCR với 35 chu kỳ 94 độ trong 1 phút, 57 độ trong 1 phút và 15 giây và 72 độ trong 1 phút 30 giây sau lần ban đầu bước biến tính ở 94 độ trong 1 phút. Một bước kéo dài cuối cùng ở 72 độ trong 10 phút đã được thêm vào. Các cặp mồi cụ thể cho TGF - 1 và GAPDH được lấy từ một báo cáo trước đó (19) (mTGF - 1: sense, 5′-TAC TAT GCT AAA GAG GTC ACC CGC và anti-sense, 5 ′ - CTG TAT TCC GTC TCC TTG GTT CAG; mGAPDH: giác quan, 5′-ATC ACT GCC ACC CAG AAG ACT G, và phản giác, 5′-CCC TGT TGC TGT AGC CGT ATT C). Sản phẩm PCR thu được (25 μL) được điện di trên gel agarose 1% trong đệm Tris-acetate-EDTA (TAE) có chứa 0,5 ug / mL ethidium bromide và được hiển thị dưới ánh sáng UV. Các cấp độ biểu hiện của TGF - 1 là bán định lượng so với các cấp độ của GAPDH.
phong cách phương Tây
Mức TGF trong tế bào - 1 đã được kiểm tra bằng phương pháp thấm phương tây như đã mô tả trước đây (19). Các dải protein TGF - 1 trong vết thấm được xác định bằng kháng TGF đơn dòng - 1 (A 75-3) (BD Biosciences). Vết tương tự được kiểm tra lại bằng cách sử dụng kháng thể IgG kháng -actin (Sigma-Aldrich Canada) để xác nhận lượng protein đã nạp trong mỗi mẫu.
Xét nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết với enzym (ELISA) Mức TGF được tiết ra - 1 trong dịch nuôi cấy được xác định bằng ELISA. Tế bào MODE-K (1,8 × 1 0 5 tế bào / giếng trong 0,5 mL môi trường DMEM) trong 24- đĩa giếng trong một bộ ba được nuôi cấy qua đêm, sau đó được ủ trong điều kiện không có hoặc có ECH(echinacoside từ cistanche). Các chất nổi nuôi cấy được thu thập sau 24 giờ xử lý và lượng TGF - 1 giải phóng được xác định bằng cách sử dụng Hệ thống xét nghiệm miễn dịch TGF 1 Emax® theo quy trình của nhà sản xuất (Promega, Madison, WI, Hoa Kỳ).
Phân tích thống kê
Phân tích phương sai một chiều hoặc hai chiều (ANOVA) được sử dụng khi thích hợp để so sánh giữa các nhóm. Dữ liệu được thu thập từ 3 đến 4 thí nghiệm riêng lẻ trong mỗi nghiên cứu để phân tích thống kê. Giá trị P nhỏ hơn hoặc bằng 0. 05 được coi là đáng kể.
Kết quả
Kích thích tăng sinh tế bào trong nuôi cấy tế bào MODE-K
Tăng sinh tế bào là điều cần thiết để sửa chữa mô. Tác dụng của ECH(echinacoside từ cistanche)về sự tăng sinh tế bào đã được kiểm tra trong các tế bào MODE-K được nuôi cấy. Như thể hiện trong Hình 2A, việc bổ sung ECH kích thích tăng sinh tế bào, được đo bằng sự gia tăng khả năng sống của tế bào bằng cách sử dụng xét nghiệm MTT, theo cách phụ thuộc vào liều lượng. So với số lượng tế bào trong môi trường nuôi cấy không được xử lý bằng thuốc, số lượng tế bào trong môi trường nuôi cấy được xử lý bằng ECH đã tăng 25,6 phần trăm ± 14,82 phần trăm trong môi trường nuôi cấy với 6,26 ug / mL ECH, 33,6 phần trăm ± 14. 0 phần trăm với 25 ug / mL ECH, 64,4 phần trăm ± 9. 0 phần trăm với 5 0 ug / mL ECH và 99,4 phần trăm ± 11,7 phần trăm với 1 {0 0 ug / mL ECH sau 48- giờ ủ (P <0. 0="" {{5="" 0}}="" 0="" 1).="" để="" xác="" nhận="" thêm="" quan="" sát="" này,="" ảnh="" hưởng="" của="" ech="" đến="" đường="" cong="" tăng="" trưởng="" tế="" bào="" mode-k="" trong="" khoảng="" thời="" gian="" {{3="" 0}}="" ngày="" đã="" được="" kiểm="" tra.="" như="" được="" thể="" hiện="" trong="" hình="" 2b,="" việc="" bổ="" sung="" 1="" 0="" ug="" ml="" ech="" được="" tối="" ưu="" hóa="" đã="" làm="" tăng="" đáng="" kể="" số="" lượng="" tế="" bào="" sống="" sót="" sau="" thời="" gian="" ủ="" bệnh="" so="" với="" trong="" môi="" trường="" nuôi="" cấy="" không="" xử="" lý="" (đối="" chứng="" cơ="" bản),="" được="" chỉ="" ra="" bởi="" sự="" gia="" tăng="" au="" cho="" các="" nền="" văn="" hóa="" có="" ech="" từ="" 0.="" 3="" {{7="" 0}}="" ±="" 0.="" 02="" khi="" bắt="" đầu="" điều="" trị="" ech="" (0-="" thời="" điểm)="" đến="" 1,49="" ±="" 0,08="" sau="" 2="" ngày="" ủ="" và="" 2,20="" ±="" 0,11="" sau="" 4="" ngày="" ủ,="" trong="" khi="" đối="" với="" các="" mẫu="" cấy="" không="" xử="" lý="" (chỉ="" với="" môi="" trường),="" mức="" tăng="" từ="" 0,24="" ±="" 0,01="" lúc="" đầu="" lên="" 1,22="" ±="" 0,12="" sau="" 2="" ngày="" và="" 1,68="" ±="" 0,11="" sau="" 4="" ngày="" (trung="" bình="" so="" với="" ech,="" p=""><0,0001). tốc="" độ="" tăng="" trưởng="" trong="" hai="" mẫu="" cấy="" này,="" được="" tính="" toán="" dựa="" trên="" đường="" cong="" tăng="" trưởng="" (hình="" 2b),="" chỉ="" ra="" rằng="" ech="" đã="" nâng="" cao="" đáng="" kể="" tốc="" độ="" tăng="" trưởng="" ở="" các="" mẫu="" cấy="" ở="" cả="" ngày="" thứ="" 2="" (0,56="" ở="" mẫu="" cấy="" được="" xử="" lý="" ech="" so="" với="" 0,35="" ở="" đối="" chứng="" không="" được="" xử="" lý)="" và="" ngày="" thứ="" 3="" (0,43="" ở="" môi="" trường="" nuôi="" cấy="" có="" xử="" lý="" ech="" so="" với="" 0,22="" ở="" nhóm="" đối="" chứng="" không="" sử="" dụng="" thuốc)="" (hình="" 2c).="" tổng="" hợp="" lại,="" những="" dữ="" liệu="" này="" chỉ="" ra="" rằng="" ech="" kích="" thích="" sự="" tăng="" sinh="" tế="" bào="" trong="" các="" tế="" bào="" biểu="" mô="" ruột="" được="" nuôi="">
Hình 2. Kích thích tăng trưởng tế bào trong tế bào biểu mô ruột được nuôi cấy bằng ECH. Tế bào MODE-K (2,5 0 0 tế bào / giếng) được gieo vào 96- đĩa giếng qua đêm, sau đó được ủ trong điều kiện có hoặc không có ECH. Số lượng tế bào sống sót trong các mẫu cấy được đo bằng xét nghiệm MTT. A) Các mẫu nuôi cấy được xử lý với các nồng độ ECH khác nhau trong 48 giờ. Sự gia tăng (phần trăm) số lượng tế bào trong các mẫu cấy được xử lý ECH được tính toán dựa trên các mẫu cấy không xử lý như một tham chiếu cơ bản. P <0,0001 (một="" chiều="" anova).="" b)="" các="" mẫu="" nuôi="" cấy="" được="" xử="" lý="" với="" 10="" ug="" ml="" ech="" trong="" 4="" ngày.="" đường="" cong="" tăng="" trưởng="" của="" nuôi="" cấy="" được="" xử="" lý="" ech="" so="" với="" nuôi="" cấy="" không="" xử="" lý="" (chỉ="" với="" môi="" trường)="" được="" xác="" định="" bằng="" đơn="" vị="" độ="" hấp="" thụ="" (au)="" ở="" bước="" sóng="" 560="" nm="" trong="" xét="" nghiệm="" mtt.="" p=""><0,0001 (trung="" bình="" so="" với="" ech,="" anova="" hai="" chiều).="" dữ="" liệu="" được="" trình="" bày="" dưới="" dạng="" giá="" trị="" trung="" bình="" ±="" đạo="" hàm="" chuẩn="" (sd)="" của="" các="" thí="" nghiệm="" độc="" lập.="" c)="" tốc="" độ="" tăng="" trưởng="" (thay="" đổi="" au="" ngày)="" được="" tính="" toán="" dựa="" trên="" khối="" lượng="" tăng="">e, số trung bình vào mỗi ngày.
Bảo vệ các tế bào MODE-K khỏi quá trình apoptosis
Bảo vệ tế bào khỏi quá trình apoptosis là một cơ chế ngăn ngừa tổn thương mô tiếp tục. Hoạt động bảo vệ tế bào của ECH(echinacoside từ cistanche)được kiểm tra trong các tế bào MODE-K được nuôi cấy được kích thích bằng hydrogen peroxide (H2O2) hoặc hỗn hợp cytokine tiền viêm (TNF- và IFN-). H2O2 là một dạng oxy phản ứng được tạo ra bởi quá trình chuyển hóa oxy hóa và đại diện cho một kịch bản của stress oxy hóa, trong khi TNF- và IFN- là các cytokine nổi bật được sản xuất bởi các tế bào miễn dịch được kích hoạt phản ánh tình hình dưới quá trình viêm qua trung gian miễn dịch. Như được thể hiện trong Hình 3, việc bổ sung ECH (5 0 ug / mL) làm giảm đáng kể quá trình chết rụng bao gồm cả mức cơ bản của nó trong các mẫu cấy được xử lý bằng H2O2, bằng chứng là giảm quá trình chết rụng từ mức cơ bản là 5,3 {{47 }} phần trăm ± 1,24 phần trăm trong môi trường nuôi cấy không xử lý đến 3,76 phần trăm ± 1. 0 1 phần trăm trong môi trường nuôi cấy được xử lý bằng ECH, từ 26,93 phần trăm ± 1. 86 phần trăm trong môi trường nuôi cấy không xử lý đến 14,08 phần trăm ± 1,30 phần trăm trong môi trường nuôi cấy được xử lý ECH với sự hiện diện của 0,3 μM H2O2, và từ 38,90 phần trăm ± 1,76 phần trăm trong môi trường nuôi cấy không xử lý đến 19,88 phần trăm ± 1,02 phần trăm trong môi trường nuôi cấy được xử lý ECH với sự hiện diện của 0,6 μM H2O2 (P <0,0001 ,="" trung="" bình="" không="" xử="" lý="" so="" với="" xử="" lý="" ech).="" một="" tác="" dụng="" bảo="" vệ="" tế="" bào="" tương="" tự="" của="" ech="" đã="" được="" thấy="" trong="" các="" mẫu="" cấy="" được="" kích="" thích="" bằng="" hỗn="" hợp="" cytokine="" (hình="" 4);="" apoptosis="" (51,5="" phần="" trăm="" ±="" 6,30="" phần="" trăm)="" ở="" các="" nền="" văn="" hóa="" không="" bổ="" sung="" ech="" (nhóm="" chứng="" được="" xử="" lý="" trung="" bình="" không="" có="" thuốc)="" cao="" hơn="" đáng="" kể="" so="" với="" (38,50="" phần="" trăm="" ±="" 5,60="" phần="" trăm)="" ở="" các="" nền="" văn="" hóa="" được="" điều="" trị="" bằng="" ech="" (p="0." 0204,="" vừa="" không="" điều="" trị="" so="" với="" điều="" trị="" bằng="" ech),="" cho="" thấy="" rằng="" ech="" đã="" bảo="" vệ="" các="" tế="" bào="" mode-k="" khỏi="" quá="" trình="" chết="" rụng="" do="" cytokine="" gây="" ra="" tiền="" viêm.="" kết="" hợp="" với="" nhau,="" ech="" có="" hoạt="" động="" bảo="" vệ="" tế="" bào="" chống="" lại="" quá="" trình="" chết="" rụng="" tế="" bào="" do="" quá="" trình="" oxy="" hóa="" h2o2="" gây="" ra="" cũng="" như="" độc="" tính="" tế="" bào="" của="" các="" tế="" bào="" tiền="">
Tăng điều hòa biểu hiện TGF trong tế bào MODE-K được nuôi cấy
Bằng chứng trong tài liệu cho thấy TGF - 1 đóng một vai trò quan trọng trong việc sửa chữa và chấn thương mô (22, 23) và trong việc phục hồi đường tiêu hóa do viêm đại tràng hoặc bệnh viêm ruột (24). Để kiểm tra xem TGF - 1 có đóng vai trò trong việc tăng sinh tế bào do ECH và bảo vệ tế bào trong các tế bào biểu mô ruột được nuôi cấy như đã trình bày ở trên hay không, tác động của ECH(echinacoside từ cistanche)trên TGF {{0}} biểu hiện trong các tế bào MODE-K được nuôi cấy đã được kiểm tra. Mức sao chép của TGF - 1 được kiểm tra bằng RT-PCR bán định lượng, trong khi mức protein của nó được xác định bằng phương pháp thấm phương tây (tổng mức tế bào) hoặc bằng ELISA (mức protein tiết ra). Như được thể hiện trong Hình 5A, sự điều hòa tăng lên phụ thuộc vào liều lượng của TGF - 1 mRNA được thấy trong các mẫu cấy được điều trị bằng ECH ở cả 24 và 48 giờ sau khi bổ sung ECH. Một xu hướng tương tự về sự gia tăng nồng độ protein TGF {{1 0}} bên trong các tế bào đã được chứng minh bằng phân tích thấm phương tây (Hình 5B). Sau 24- giờ ủ trong 0,5 mL môi trường nuôi cấy có chứa các nồng độ ECH khác nhau, mức TGF được tiết ra - 1 cũng được tăng lên một cách không phụ thuộc vào liều lượng; từ 186,4 ± 18,39 pg / mL ở môi trường nuôi cấy không xử lý (mức cơ bản) đến 186,4 ± 18,39 pg / mL trong môi trường nuôi cấy với 25 ug / mL ECH, 263,4 ± 14,14 pg / mL với 50 ug / mL ECH và 266,4 ± 15,56 pg / mL với 100 ug / mL ECH (P <0,0001). tất="" cả="" những="" dữ="" liệu="" này="" chỉ="" ra="" rõ="" ràng="" rằng="" ech="" làm="" tăng="" sản="" xuất="" tgf="" -="" 1="" trong="" tế="" bào="" biểu="" mô="" ruột="" trong="" môi="" trường="" nuôi="">
Mất khả năng kích thích tăng trưởng và bảo vệ tế bào của Echinacoside bằng cách loại bỏ biểu hiện TGF - 1 di truyền
Để làm rõ liệu TGF - 1 có góp phần kích thích tăng trưởng và giảm quá trình chết rụng ở ECH hay không(echinacoside từ cistanche)-các tế bào được xử lý, biểu hiện TGF - 1 trong các ô MODE-K bị loại bỏ bằng cách thể hiện ổn định shRNA kháng TGF - 1, nhờ đó một dòng tế bào mới MODE-Ktgfb được tạo ra. Sự biểu hiện của protein TGF - 1 đã giảm phần lớn trong các tế bào MODE-Ktgfb so với trong các tế bào MODE-Kscr đang biểu hiện ổn định shRNA bị xáo trộn (Hình 6A). Như thể hiện trong Hình 6B, sự kích thích tăng sinh của ECH đã bị suy giảm đáng kể trong các tế bào MODE-Ktgfb; tương tự như phản ứng tăng sinh đối với ECH trong các tế bào MODE-K của cha mẹ (Hình 2), số lượng tế bào sống được tăng lên trong các tế bào MODE-Kscr sau khi kích thích ECH, tăng 28,3% ± 12,4% trong các mẫu cấy với 25 ug / mL ECH, Tăng 54,2 phần trăm ± 6,8 phần trăm với 5 {{3 0}} ug / mL ECH và 122,7 phần trăm ± 2 0. Tăng 8 phần trăm ở các mẫu cấy với 100 ug / mL ECH. Ngược lại, số lượng tế bào giảm khi có ECH trong nuôi cấy tế bào MODE Ktgfb, giảm 12,0 phần trăm ± 5,0 phần trăm trong môi trường nuôi cấy với 25 ug / mL ECH, 18,3 phần trăm ± 4,1 phần trăm giảm với 50 ug / mL ECH, và 30,4 phần trăm ± 3,3 phần trăm giảm với 100 ug / mL ECH. Phân tích thống kê với ANOVA hai chiều chỉ ra sự khác biệt đáng kể về đáp ứng tăng sinh với ECH giữa hai nhóm này (P <0,0001). những="" dữ="" liệu="" này="" cho="" thấy="" rằng="" việc="" mất="" biểu="" hiện="" tgf="" -="" 1="" trong="" các="" tế="" bào="" biểu="" mô="" ruột="" làm="" giảm="" sự="" kích="" thích="" tăng="" trưởng="" của="">
Để kiểm tra thêm xem biểu thức TGF - 1 được điều chỉnh cao trong ECH hay không(echinacoside từ cistanche)-các tế bào được xử lý dẫn đến giảm quá trình apoptosis, hoạt động chống apoptotic của ECH được kiểm tra trong tế bào MODE-Ktgfb so với tế bào MODE-Kscr. Như thể hiện trong Hình 6C, so với nuôi cấy tế bào MODE-Kscr, mức độ chết rụng cao hơn trong nuôi cấy tế bào MODE-Ktgfb khi không có cytokine (11,2 phần trăm ± 0. 42 phần trăm trong MODE-Ktgfb so với . 9,6 phần trăm ± 0. 99 phần trăm trong MODE-Kscr) và khi có cytokine (2 0. 95 phần trăm ± 0. 0 7 phần trăm trong MODE- Ktgfb so với 15,4 phần trăm ± 1,56 phần trăm trong MODE-Kscr) (P=0. 0 {{6 0}} 13), cho thấy rằng TGF - 1 là một phản - yếu tố quang phổ trong tế bào MODE K. Việc bổ sung ECH (5 0 ug / mL) vào nuôi cấy tế bào MODE-Kscr làm giảm đáng kể mức cơ bản của quá trình apoptosis (9,6 phần trăm ± 0. 99 phần trăm ở điều trị nondrug so với 8,3 phần trăm ± 0,43 phần trăm trong điều trị ECH) và 30,2% giảm apoptosis được tìm thấy trong các mẫu cấy được kích thích bởi cytokine (15,4% ± 1,56% trong điều trị nondrug so với 10,75% ± 1,05% trong điều trị ECH). Tuy nhiên, trong nuôi cấy tế bào MODE-Ktgfb, ECH không làm giảm mức cơ bản của quá trình tự chết (11,2 phần trăm ± 0,42 phần trăm ở điều trị nondrug so với 12,0 phần trăm ± 0,43 phần trăm trong điều trị bằng ECH), và chỉ giảm 16,71 phần trăm quá trình chết rụng, so với 30,2 phần trăm trong nuôi cấy tế bào MODE-Kscr, được thấy trong nuôi cấy kích thích cytokine (20,95 phần trăm ± 0,07 phần trăm trong điều trị nondrug so với 17,45 phần trăm ± 0,35 phần trăm trong điều trị ECH). Những dữ liệu này chỉ ra rằng việc loại bỏ biểu hiện TGF - 1 trong tế bào biểu mô ruột làm trầm trọng thêm quá trình apoptosis và làm giảm hoạt động bảo vệ tế bào của ECH.
Mất khả năng kích thích tăng trưởng và bảo vệ tế bào của ECH(echinacoside từ cistanche)bằng cách trung hòa hoạt tính TGF - 1 bằng cách sử dụng kháng thể
Để xác nhận thêm rằng TGF - 1 có thể được yêu cầu để kích thích tăng trưởng và bảo vệ tế bào của ECH(echinacoside từ cistanche)trong các tế bào biểu mô ruột như được mô tả ở trên (Hình 6), tác động của việc vô hiệu hóa kháng thể kháng TGF - 1 (Clone 9 0 16; R&D Systems Inc. Minneapolis, MN, USA) trên ECH qua trung gian sự tăng sinh và tồn tại của tế bào đã được kiểm tra trong nuôi cấy tế bào MODE-K. Như được thể hiện trong Hình 7A, việc bổ sung ECH (25 ug / mL) đã kích thích sự gia tăng 44,3 phần trăm ± 8,2 phần trăm số lượng tế bào ở các đối chứng không được điều trị bằng kháng thể, nhưng với sự hiện diện của kháng thể kháng TGF - 1 , 11,3 phần trăm ± 9,1 0 phần trăm giảm số lượng tế bào được thấy trong cùng các mẫu cấy được xử lý ECH, cho thấy rằng hoạt động trung hòa TGF - 1 làm giảm kích thích tăng trưởng của ECH trong tế bào biểu mô ruột. Các thí nghiệm tiếp theo chứng minh rằng kháng thể kháng TGF - 1 cũng vô hiệu hóa hoạt động bảo vệ tế bào của ECH trong nuôi cấy tế bào MODE-K; việc bổ sung ECH làm giảm quá trình chết rụng từ 4,37 phần trăm ± 1,19 phần trăm ở các mẫu cấy không xử lý xuống 1,72 phần trăm ± {{5 0}}. 01 phần trăm ở các mẫu được xử lý bằng ECH sau 24 giờ ủ và từ 11,13 phần trăm ± 1,12 phần trăm trong môi trường nuôi cấy không xử lý đến 9,13 phần trăm ± 0,02 phần trăm trong môi trường nuôi cấy được xử lý ECH sau 48 giờ ủ (nondrug / môi trường so với ECH, ANOVA hai chiều, P=0. 0001). Tuy nhiên, với sự hiện diện của kháng thể kháng TGF - 1, quá trình tự chết trong các mẫu cấy được xử lý bằng ECH (2,88 phần trăm ± 0,01 phần trăm sau 24- giờ ủ; 12,58 phần trăm ± 0,02 phần trăm sau 48- giờ ủ ) không khác biệt đáng kể so với các kháng thể trong môi trường nuôi cấy đối chứng (không xử lý bằng thuốc) (ANOVA hai chiều, P=0. 9427), ngụ ý rằng kháng thể kháng TGF - 1 cản trở sự sống sót qua trung gian ECH trong ruột các tế bào biểu mô.
Thảo luận
ECH(echinacoside từ cistanche)không chỉ là một PhG chính trong chiết xuất của thảo dược Cistanche spp. mà còn được tìm thấy trong nhiều cây thuốc khác như Echinacea spp. (25, 26). Hợp chất tự nhiên này đã được báo cáo là có hoạt tính chống oxy hóa trong ống nghiệm và in vivo (13, 27, 28). Tuy nhiên, (các) cơ chế hoạt động của nó vẫn chưa rõ. Kết quả của chúng tôi từ nghiên cứu này lần đầu tiên chứng minh trong mô hình in vitro rằng ECH kích thích sự tăng sinh và tồn tại của tế bào biểu mô ruột, phụ thuộc vào TGF - 1.
Việc bổ sung ECH(echinacoside từ cistanche)làm giảm quá trình chết rụng tế bào trong H2O 2- hoặc hỗn hợp cytokine tiền viêm (TNF- và IFN-) - tế bào MODE-K được xử lý (Hình 3 và 4) và cả trong các loại tế bào khác (16, 29), và loại bỏ biểu hiện TGF - 1 hoặc ngăn chặn hoạt động của nó dẫn đến việc loại bỏ hoạt động chống apoptotic của nó (Hình 6 và 7), cho thấy rằng sự bảo vệ tế bào của ECH phụ thuộc vào sản xuất TGF - 1 (Hình 5). Nghiên cứu trước đây của chúng tôi đã chỉ ra rằng TGF - 1 gây ra biểu hiện Bcl -2 chống apoptotic và ngăn chặn quá trình apoptosis qua trung gian TNF trong tế bào biểu mô ống thận (19). Các phát hiện tương tự đã được báo cáo ở các loại tế bào khác; bổ sung TGF - 1 trong các tế bào nội mô động mạch phổi được nuôi cấy nhằm điều chỉnh mức cơ bản của Bcl -2 và ngăn chặn quá trình chết rụng gây ra bởi sự thiếu hụt huyết thanh và yếu tố tăng trưởng nội mô mạch máu (VEGF)-phong tỏa thụ thể (30); và trong các tế bào tiền thân thần kinh được nuôi cấy (NPC), nó tăng cường (khoảng 76 phần trăm) khả năng sống sót của tế bào chống lại việc xử lý H2O2, điều này tương quan với việc điều chỉnh tăng biểu hiện Bcl -2 (31). Mặc dù ảnh hưởng của ECH đối với sự biểu hiện Bcl -2 trong tế bào MODE-K không được kiểm tra trong nghiên cứu này, nhưng mối tương quan của quy định tăng Bcl -2 với hoạt động chống apoptotic của ECH đã được báo cáo trong TNF - –tế bào thần kinh SHSY5Y được xử lý (29) hoặc tế bào PC12 được xử lý bằng H2O 2- (15). Tổng hợp lại, những dữ liệu này cho thấy rằng hoạt động chống apoptotic của ECH có thể được TGF - 1 làm trung gian thông qua con đường Bcl -2.
Có thể là sự bảo vệ tế bào của ECH(echinacoside từ cistanche)có thể góp phần làm tăng nhẹ số lượng tế bào sống sót bằng cách giảm tế bào chết tự phát vào cuối quá trình ủ bệnh, nhưng việc bổ sung ECH (100 ug / mL) gần như tăng gấp đôi số lượng tế bào sống sót sau 48- giờ điều trị (Hình 2A) , cho thấy rằng ECH thực sự kích thích sự tăng sinh tế bào, điều này đã được khẳng định thêm bởi dữ liệu trong Hình 2, B và C. Một tác dụng tương tự của ECH đã được báo cáo trong các tế bào nguyên bào sợi của người, MRC -5 (17): in MRC { {6}} nuôi cấy tế bào, ECH có thể làm chậm quá trình lão hóa tế bào bằng cách gây ra chu kỳ tế bào từ pha G1 sang pha S và pha G2. Giống như hoạt động chống apoptotic của ECH, hoạt động tăng sinh của ECH phụ thuộc vào TGF - 1 (Hình 6 và 7) đã được ghi nhận là một cytokine đa chức năng (32, 33). TGF- có thể kích thích tăng sinh tế bào hoặc gây ngừng tăng trưởng tùy thuộc vào loại tế bào hoặc vi môi trường ngoại bào; nó kích hoạt nhiều con đường tín hiệu bao gồm Smads và không Smads (ví dụ: kinase protein hoạt hóa mitogen) (34, 35), nhưng con đường nào làm trung gian cho sự tăng sinh tế bào được kích thích bởi ECH / TGF-trong các tế bào MODE-K cần được nghiên cứu thêm.
Cho đến nay, người ta biết rất ít về (các) protein đích của ECH(echinacoside từ cistanche)hoặc (các) đường dẫn tín hiệu mà nó điều chỉnh. Một nghiên cứu cho thấy rằng điều trị bằng ECH làm tăng mức độ tế bào của guanosine monophosphate chu kỳ (cGMP) trong tế bào nội mô (36) và việc bổ sung 8- Bromo-cGMP làm tăng biểu hiện TGF - 1 trong nguyên bào sợi tim (37 ). Tuy nhiên, liệu điều trị bằng ECH có làm tăng cGMP hay không và bằng cách nào ECH kích thích biểu hiện TGF - 1 trong các tế bào biểu mô ruột được nuôi cấy thì cần được nghiên cứu thêm.
Kết luận, nghiên cứu của chúng tôi chứng minh rằng ECH(echinacoside từ cistanche)gây ra sự sản xuất TGF - 1 làm trung gian cho sự tăng sinh tế bào và sự tồn tại của tế bào trong các tế bào biểu mô ruột được nuôi cấy. TGF- tín hiệu trong biểu mô ruột là cần thiết để sửa chữa hoặc chữa lành tổn thương niêm mạc ở chuột bị viêm đại tràng do dextran sulfat natri gây ra (38), cho thấy rằng ECH, có lẽ là thảo dược có chứa ECH C. Desticola hoặc những loại khác, có thể có tiềm năng điều trị để thúc đẩy tổn thương niêm mạc sửa chữa ở bệnh nhân.
Nhìn nhận
YJ được hỗ trợ bởi học bổng nghiên cứu sinh từ Hội đồng Học bổng Trung Quốc, Trung Quốc.
Người giới thiệu
1 Xu R, Chen J, Chen SL, Liu TN, Zhu WC, Xu J. Cistanche desticola Ma được trồng như một loại cây trồng mới ở Trung Quốc. Genet Resour Crop Evol. 2009; 56: 137–142.
2 Jiang Y, Tu PF. Phân tích các thành phần hóa học trong các loài Cistanche. J Chromatogr A. 2009; 1216: 1970–1979.
3 Tu PF, Wang B, Deyama T, Zhang ZG, Lou ZC. [Phân tích glycoside phenylethanoid của Herba Cistanchis bằng RP-HPLC]. Yao Xue Xue Bao (Acta Pharm Sin). 1997; 32: 294–300. (văn bản bằng tiếng Trung với phần tóm tắt tiếng Anh)
4 Huang X, Li Z. [Hiệu quả lâm sàng của dung dịch chứa Cistanche trong điều trị táo bón sau đột quỵ]. Zhongguo Zhang Xi Yi Jie He Za Zhi (Chin J Truyền thống Tích hợp West Med). Năm 2002; 22: 622–623. (ở Trung Quốc)
5 Zhang B, Lu X, Zhang R, Li L, Li C. [Nghiên cứu về tác dụng nhuận tràng của Cistanche Desticola]. Zhong Yao Cai (J Chin Med Mater). Năm 1992; 15: 33–35. (ở Trung Quốc)
6 Tu P, Li S, Li Z, Wang C, Lou Z. [So sánh khả năng làm ẩm ruột và nhuận tràng của herba Cistanches]. Nat Prod Res Dev. Năm 1997; 11: 48–51. (văn bản bằng tiếng Trung với phần tóm tắt tiếng Anh)
7 Zhang B, Zhao X, Chen S, Liu L, Cheng H. [Hành động nhuận tràng của các bộ phận tách rời khỏi herba Cistanche]. Zhongguo Zhongyiyao Xinxi Zazhi (Chin J Inform Trad Chin Med). 2003; 10: 31–32. (văn bản bằng tiếng Trung với phần tóm tắt tiếng Anh)
8 Jia Y, Guan Q, Guo Y, Du C. Giảm tăng sản viêm trong ruột ở chuột dễ bị ung thư ruột kết bằng chiết xuất từ nước của Cistanche Desticola. Phytother Res. Trong báo chí.
9 Cai RL, Yang MH, Shi Y, Chen J, Li YC, Qi Y. Hoạt động chống mệt mỏi của chiết xuất giàu phenylethanoid từ Cistanche Desticola. Phytother Res. 2010; 24: 313–315.
10 Jing M, Song S, Li J. [Nghiên cứu quá trình chiết xuất và tinh chế viên nang Ronggui Tongbian]. Chin Med hiện đại. 2009; 11: 18–20. (văn bản bằng tiếng Trung với phần tóm tắt tiếng Anh)
11 Wu Y, Shi HM, Bao Z, Wang MY, Tu PF, Li XB. Ứng dụng chỉ thị phân tử trong dự đoán chất lượng sản xuất của Cistanche Desticola được nuôi trồng. Biol Pharm Bull. 2010; 33: 334–339.
12 Geng X, Tian X, Tu P, Pu X. Tác dụng bảo vệ thần kinh của echinacoside trong mô hình MPTP của chuột bị bệnh Parkinson. Eur J Pharmacol. 2007; 564: 66–74.
13 Zhao Q, Gao J, Li W, Cai D. Tác dụng gây tê liệt thần kinh của Echinacoside trên mô hình chuột MPTP bán cấp của bệnh Parkinson. Brain Res. 2010; 1346: 224–236.
14 Zhang Y, Xing J, Ai T, Wen T, Guan L, Zhao J. Bảo vệ echinacoside chống lại tổn thương phổi cấp tính do axit oleic gây ra ở chuột. Radic Res miễn phí. 2007; 41: 798–805.
15 Kuang R, Sun Y, Yuan W, Lei L, Zheng X. Tác dụng bảo vệ của echinacoside, một trong những glycoside phenylethanoid, trên H2O 2- gây ra độc tế bào trong tế bào PC12. Planta Med. 2009; 75: 1499–1504.
16 Kuang R, Sun Y, Zheng X. Ức chế oxit nitric liên quan đến tác dụng bảo vệ của echinacoside đối với H2O 2- gây ra tổn thương tế bào PC12. Nat Prod Commun. 2010; 5: 571–574.
17 Xie H, Zhu H, Cheng C, Liang Y, Wang Z. Echinacoside làm chậm quá trình lão hóa tế bào của tế bào nguyên bào sợi ở người MRC -5. Pharmazie. 2009; 64: 752–754.
18 Vidal K, Grosjean I, Evillard JP, Gespach C, Kaiserlian D. Bất tử hóa tế bào biểu mô ruột chuột nhờ gen T lớn SV 40-. Đặc điểm kiểu hình và miễn dịch của dòng tế bào MODE-K. J Phương pháp Immunol. Năm 1993; 166: 63–73.
19 Guan Q, Nguan CY, Du C. Sự biểu hiện của yếu tố tăng trưởng chuyển hóa-beta1 hạn chế tổn thương do thiếu máu cục bộ ở thận-tái tưới máu. Cấy ghép. 2010; 89: 1320–1327.
20 Hwang M, Kim HJ, Noh HJ, Chang YC, Chae YM, Kim KH, et al. TGF-beta1 siRNA ngăn chặn sự xơ hóa mô kẽ ống dẫn trứng ở thận do tắc nghẽn niệu quản. Exp Mol Pathol. 2006; 81: 48–54.
21 Du C, Wang S, Diao H, Guan Q, Zhong R, Jevnikar AM. Tăng sức đề kháng của tế bào biểu mô ống đối với quá trình apoptosis bằng liệu pháp shRNA cải thiện tổn thương do thiếu máu cục bộ ở thận do tái tưới máu. Am J Cấy ghép. 2006; 6: 2256–2267.
22 Douglas HE. TGF-ss trong việc chữa lành vết thương: một đánh giá. J Chăm sóc vết thương. 2010; 19: 403–406.
23 Grande JP. Vai trò chuyển đổi yếu tố tăng trưởng-beta trong tổn thương và sửa chữa mô. Proc Soc Exp Biol Med. Năm 1997; 214: 27–40.
24 Monteleone G, Boirivant M, Pallone F, MacDonald TT. TGF beta1 và Smad7 trong quy định của IBD. Immunol niêm mạc. 2008; 1 Bổ sung 1: S50 – S53.
25 Bauer R, Foster S. Phân tích các alkamit và các dẫn xuất axit caffeic từ mô phỏng Echinacea và rễ E. nghịch lý. Planta Med. Năm 1991; 57: 447–449.
26 Perry NB, Burgess EJ, Glennie VL. Tiêu chuẩn hóa Echinacea: phương pháp phân tích các hợp chất phenolic và mức độ điển hình trong các loài dược liệu. J Thực phẩm Nông nghiệp Chem. 2001; 53: 849–857.
27 Pellati F, Benvenuti S, Magro L, Melegari M, Soragni F. Phân tích các hợp chất phenolic và hoạt động loại bỏ gốc rễ của Echinacea spp. J Pharm Biomed Hậu môn. 2004; 35: 289–301.
28 Wu Y, Li L, Wen T, Li YQ. Tác dụng bảo vệ của echinacoside đối với độc tính trên gan do carbon tetrachloride gây ra ở chuột. Độc chất học. 2007; 232: 50–56.
29 Deng M, Zhao JY, Tu PF, Jiang Y, Li ZB, Wang YH. Echinacoside giải cứu các tế bào thần kinh SHSY5Y khỏi quá trình chết rụng do TNFalpha gây ra. Eur J Pharmacol. 2004; 505: 11–18.
30 Lu Q. Yếu tố tăng trưởng biến đổi-beta1 bảo vệ chống lại quá trình apoptosis của tế bào nội mô động mạch phổi thông qua ALK5. Am J Physiol Tế bào phổi Mol Physiol. 2008; 295: L123 – L133.
31 Park SM, Jung JS, Jang MS, Kang KS, Kang SK. Yếu tố tăng trưởng biến đổi-beta1 quy định số phận của các tế bào tiền thân thần kinh có nguồn gốc từ tủy sống được nuôi cấy. Tế bào Prolif. 2008; 41: 248–264.
32 Massague J. Cách tế bào đọc tín hiệu TGF-beta. Nat Rev Mol Cell Biol. 2000; 1: 169–178.
33 Rahimi RA, Leof EB. Tín hiệu TGF-beta: một câu chuyện về hai phản hồi. J Hóa sinh tế bào. 2007; 102: 593–608.
34 Moustakas A, Heldin CH. Tín hiệu TGF-beta không Smad. J Cell Sci. 2005; 118: 3573–3584.
35 Schmierer B, Hill CS. Truyền tín hiệu TGF beta-SMAD: tính đặc hiệu của phân tử và tính linh hoạt của chức năng. Nat Rev Mol Cell Biol. 2007; 8: 970–982.
36 He WJ, Fang TH, Ma X, Zhang K, Ma ZZ, Tu PF. Echinacoside gây ra sự thư giãn phụ thuộc vào nội mạc trong các vòng động mạch chủ chuột qua con đường NO-cGMP. Planta Med. 2009; 75: 1400–1404.
37 Abdelaziz N, Colombo F, Mercier I, Calderone A. Nitric oxide làm giảm sự biểu hiện của chuyển đổi mRNA yếu tố tăng trưởng-beta3 trong nguyên bào sợi tim chuột thông qua sự mất ổn định. Tăng huyết áp. 2001; 38: 261–266.
38 Beck PL, Rosenberg IM, Xavier RJ, Koh T, Wong JF, Podolsky DK. Chuyển đổi yếu tố tăng trưởng-beta làm trung gian chữa lành đường ruột và tính nhạy cảm với tổn thương in vitro và in vivo thông qua các tế bào biểu mô. Là J Pathol. 2003; 162: 597–608.
