PHẦN Ⅰ: Tác dụng của chiết xuất Cistanche Tubulosa đối với chức năng sinh sản của nam giới ở chuột mắc bệnh tiểu đường do Streptozotocin-Nicotinamide
Mar 04, 2022
Liên hệ: Audrey Hu Whatsapp / hp: 0086 13880143964 Email:audrey.hu@wecistanche.com
Zwe-Ling Kong ® Athira Johnson® Fan-Chi Ko, Jia-Ling He và Shu-Chun Cheng
Trừu tượng:Bệnh tiểu đường là một chứng rối loạn mãn tính, đặc trưng bởi sự tăng đường huyết do giảm mức độ insulin hoặc sự kém hiệu quả của mô để sử dụng nó một cách hiệu quả. Vô sinh được biết đến như một hậu quả chính của bệnh tiểu đường và ảnh hưởng đến hệ thống sinh sản nam giới bằng cách gây suy giảm chức năng tinh trùng và rối loạn chức năng tuyến sinh dục.Cistanche tubulosalà một loại cây ký sinh có khả năng cải thiện trí nhớ, khả năng miễn dịch và khả năng tình dục, giảm liệt dương, giảm thiểu chứng táo bón. Nghiên cứu này tập trung vào việc điều tra tác dụng chống viêm và bảo vệ của echinacoside (ECH) trongChiết xuất Cistanche tubulosa(CTE) trên hệ thống sinh sản đực của chuột mắc bệnh tiểu đường. Tác dụng chống oxy hóa, chống viêm và bảo vệ của CTE đã được đánh giá bằng cả phương pháp in vitro và in vivo. Kết quả in vitro cho thấy ECH ức chế sản xuất các loài oxy phản ứng (ROS) và cải thiện sự biểu hiện của protein StAR, CYP11A1, CYP17A1 và HSD17p3. Phân tích in vivo được thực hiện với ba liều echinacoside (ECH) (8 0, 160 và 320 mg / kg) trong CTE. Tổng cộng, 0,571 mg / kg rosiglitazone (RSG) được sử dụng như một đối chứng tích cực. Bệnh tiểu đường gây ra bởi streptozotocin (STZ) (65 mg / kg) và nicotinamide (230 mg / kg) kết hợp với chế độ ăn nhiều chất béo (45%). Các nghiên cứu in vivo xác nhận rằng ECH cải thiện lượng đường trong máu, kháng insulin, kháng leptin và peroxy hóa lipid. Nó có thể khôi phục kisspeptin 1 (KiSS1), thụ thể kết hợp với protein G GPR 54, ức chế tín hiệu cytokine 3 (SOCS -3) và sirtuin 1 (SIRT1) biểu hiện axit ribonucleic (mRNA) ở vùng dưới đồi và phục hồi giới tính mức độ hormone. Do đó, nghiên cứu này đã xác nhận tác dụng chống oxy hóa, chống viêm và tạo steroid của CTE.
Từ khóa:Bệnh tiểu đường; khô khan;Chiết xuất Cistanche tubulosa (CTE); echinacoside (ECH); hoạt động chống viêm; hoạt động chống oxy hóa; tác dụng tạo steroid
Điều trị bệnh tiểu đường:Chiết xuất Cistanche tubulosa(CTE)
1. Giới thiệu
Đái tháo đường (DM) là tình trạng tăng nồng độ glucose trong máu do tuyến tụy kém hiệu quả trong việc sản xuất đủ insulin hoặc cơ thể không thể sử dụng nó một cách hiệu quả. Theo WHO, số người mắc bệnh tiểu đường tăng từ 108 triệu người năm 1980 lên 422 triệu người vào năm 2014 [1]. Có 4 loại chính: tiền tiểu đường (giai đoạn trước khi mắc bệnh tiểu đường), loại 1 (khi tuyến tụy không sản xuất được insulin), loại 2 (cơ thể không sử dụng được insulin) và tiểu đường thai kỳ (xảy ra trong thời kỳ mang thai). Căng thẳng oxy hóa xảy ra do sự mất cân bằng giữa việc sản xuất các loại oxy phản ứng (ROS) và chất chống oxy hóa [2] cuối cùng dẫn đến tình trạng bệnh tiểu đường. Các biến chứng của bệnh tiểu đường bao gồm suy thận, tổn thương thần kinh, mù lòa, đột quỵ, đau tim, thai chết lưu và vô sinh. [1]. Các nghiên cứu cho thấy rằng nhân tinh trùng, axit deoxyribonucleic (DNA) và ty thể bị hư hỏng đáng kể ở bệnh nhân nam bị tiểu đường [3]. Stress oxy hóa trong quá trình vận chuyển tinh trùng sẽ làm thay đổi quá trình hoạt động của hệ thống sinh sản nam [4,5].
Quá trình sinh tinh được điều khiển bởi trục hạ đồi-tuyến yên-tuyến sinh dục (HPG). Hormone giải phóng gonadotropin (GnRH) được sản xuất bởi vùng dưới đồi kích thích sản xuất hormone hoàng thể (LH) và hormone kích thích nang trứng (FSH). Tế bào Leydig được tìm thấy ở gần ống lượn bán kim và sản xuất testosterone dưới sự kiểm soát của LH. FSH kích hoạt sản xuất protein liên kết kháng nguyên (ABP) giúp truyền nội tiết tố nam. Do đó, vô sinh và các vấn đề khác chủ yếu phát sinh do những xáo trộn xảy ra trong trục HPG. Sử dụng phối hợp streptozotocin-nicotinamide gây ra bệnh tiểu đường ở chuột thí nghiệm. Streptozotocin là một hợp chất hóa học độc đối với tế bào p sản xuất insulin trong tuyến tụy và nicotinamide là một vitamin tan trong nước có tác dụng bảo vệ tế bào p khỏi bị hư hại hoàn toàn [6].
Cistanche tubulosa là một loài thực vật sa mạc còn được gọi là "Rou Cong-Rong" [7]. Nó là một loài thực vật ký sinh không diệp lục, mọc chủ yếu trên rễ của cây Calotropis Procera và phân bố rộng rãi ở vùng đất khô cằn của Cam Túc, Thanh Hải, Tân Cương, Mông Cổ, Iran và Ấn Độ. Tên thường gọi của Cistanche tubulosa là "Lục bình sa mạc". Nó được chấp nhận rộng rãi trong y học cổ truyền Trung Quốc và đã được đặt cho cái tên "Nhân sâm của sa mạc". Nó được sử dụng rộng rãi trong lĩnh vực y học để điều trị bệnh đái tháo đường, đau bụng kinh, bệnh thận mãn tính, táo bón, bất lực và vô sinh. Các thành phần hóa học củaCistanche tubulosabao gồm các glycoside phenylethanoid không bay hơi (PHG), iridoids, lignans, dầu dễ bay hơi, alditols, oligosaccharid và polysaccharid [8]. Các nghiên cứu cho thấy rằng echinacoside từ loại thảo mộc này bảo vệ nguyên bào sợi bị tổn thương bằng cách điều chỉnh mức ROS [9]. Hợp chất này tạo ra các hoạt động chống oxy hóa, giãn mạch và chống viêm cùng với việc bảo vệ thần kinh và ngăn ngừa loãng xương [10,11].
Nghiên cứu này nhằm mục đích điều tratác dụng của chiết xuất Cistanche tubulosacó chứa ECH gây rối loạn chức năng sinh sản của chuột mắc bệnh tiểu đường do streptozotocin-nicotinamide gây ra.
Cistanche tubulosa
2. Vật liệu và phương pháp
2.1 Vật liệu
ECH và CTE được mua từ Công ty TNHH Dược phẩm Sinopharm (Yilan, Đài Loan). Sản phẩm cuối glycation tiên tiến (AGEs) được mua từ Biovision (San Francisco, CA, Hoa Kỳ). Dòng tế bào LC -540 và TM3 đã được mua từ Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghiệp Thực phẩm (Tân Trúc, Đài Loan). Chuột đực Sprague-Dawley (SD) 5 tuần tuổi được mua từ Trung tâm Động vật Phòng thí nghiệm Quốc gia (Đài Bắc, Đài Loan). Feed Lab Diet® được mua từ PMI Nutrition International, Inc. (Đài Bắc, Đài Loan). 2, 2- diphenyl -1- picrylhydrazyl (DPPH) được lấy từ Sigma (St. Louis, MO, Hoa Kỳ). Metanol và axit 4- (2- hydroxyetyl) -1- piperazineethanesulfonic (HEPES) cũng được mua từ Sigma. Môi trường Eagle / F12 và trypsin-EDTA sửa đổi của Dulbecco được lấy từ GIBCO (New York, NY, USA). 3- (4, 5- dimethylthiazol -2- yl) -2, 5- diphenyltetrazolium bromide (MTT), dichloro-dihydro-fluorescein diacetate (DCFH-DA), dimethyl sulfoxide (DMSO) và nitroblue tetrazolium (NBT) đã được mua từ Sigma. Bộ dụng cụ enzym glucoza được lấy từ Kyokutoseiyaku, Tokyo, Nhật Bản. Bộ dụng cụ Insulin ELISA được mua từ Mercodia AB Inc., Sylveniusgatan 8A (Uppsala, Thụy Điển). Thuốc thử chiết xuất protein mô T-PER được mua lại từ Thermo Scientific (Chicago, IL, Hoa Kỳ). Yếu tố hạt nhân chống Người / Chuột / Chuột-kappa B Các kháng thể đa dòng NF-kB được mua từ Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA. Thụ thể chống chuột / chuột cho các kháng thể đa dòng nâng cao glycation (RAGE), kháng thể đa dòng chống Người / Chuột / Chuột StAR và kháng thể đơn dòng chống Người / Chuột / Chuột Cytochrome P 450 17 A1 được mua từ Gene Tex (Irvine, CA, Hoa Kỳ). Kháng thể đa dòng CYP11A1 chống Người / Chuột / Chuột được lấy từ Công nghệ Tín hiệu Tế bào (Beverly, PA, Hoa Kỳ). Thuốc thử easy-Blue được mua từ Invitrogen, Thermo Fisher Scientific (Carlsbad, CA, USA). Agarose và DNA marker 100 bp được lấy từ Promega, Corporation (Madison, WI, USA). RNeasy Lipid Tissue Mini Kit được mua từ QIAGEN, Hilden, Đức.
2.2.Methods
2.2.1. Phân tích trong ống nghiệm
Nuôi cấy tế bào LC {{0}} và TM3: Các dòng tế bào LC -540 được nuôi cấy ở 37 OC trong môi trường Earle's Balanced Salt Solution (EBSS) bổ sung natri bicarbonate (1,5 g / L), L -glutamine (2 mM), axit amin không thiết yếu (0. 1 mM), natri pyruvate (1. 0 mM) và huyết thanh bò thai (FBS) (10 phần trăm) trong 5 tủ ấm phần trăm CO2 (tủ ấm CO2, Napco 5410, Đài Loan). Dòng tế bào TM3 được nuôi cấy trong môi trường Eagle cải tiến Dulbecco / s (DMEM) bổ sung glucose (4,5 g / L), natri pyruvate (0,5 mM), L-glutamine (2,5 mM), natri bicarbonat (1,2 g / L), 4- (2- hydroxyethyl) -1- axit piperazineethanesulfonic (HEPES, 15 mM) và huyết thanh bê thai (FCS, 10 phần trăm) hoặc huyết thanh ngựa (5 phần trăm) ở 37 OC trong 5 tủ ấm phần trăm CO2.
Xác định khả năng tồn tại trong tế bào của Echinacoside (ECH): Thuốc thử 3- (4, 5- dimethylthiazol -2- yl) -2, 5- diphenyltetrazolium bromide (MTT) là được sử dụng để kiểm tra khả năng sống của tế bào. Nồng độ tế bào được điều chỉnh thành 2 x 105 tế bào / mL trong một đĩa 96- giếng. Sau đó, 20 卩 L ECH (pha loãng trong 2% môi trường) được thêm vào và ủ trong 24 giờ ở 37 oC trong tủ ấm 5% CO2. Sau đó, 100 卩 L thuốc thử MTT được thêm vào và ủ trong 4hat37 OC trong điều kiện tối. Độ hấp thụ được đo ở bước sóng 570 nm (máy đọc ELISA, Dynatech MR5000, Kloten, Thụy Sĩ).
Điện trở CeH viabiHiy (phần trăm)=[(Ví dụ ở 570 nm - Ablank ở 570 nm)] / [(Acontrol ở 570 - Ablank ở 570)] x 100.
Thử nghiệm khử nitroblue Tetrazolium (NBT) và thử nghiệm 2, 2- diphenyl -1- picrylhydrazyl (DPPH): Số lượng tế bào được điều chỉnh thành 1x 1 {{1 0}} 6 tế bào / mL . Sau đó, 5 0 mg / mL ECH, resveratrol (RES) và các sản phẩm cuối glycation nâng cao (AGEs) (đối chứng) được thêm vào và đồng nuôi cấy trong 18 giờ ở 37OC. Sau đó, 0,3 mL dung dịch NBT (0,1 mg / mL NBT, 5% FBS, và 3% dimethyl sulfoxit (DMSO) hòa tan trong 10 mL DMEM) được thêm vào và ủ ở 37 C trong 5% CO2 trong 1 giờ. Sau khi ly tâm (ở 800 xg trong 3 phút), phần nổi phía trên được loại bỏ và 200 卩 L DMSO được thêm vào và lắc trong 5 phút trong máy tạo dao động siêu âm (Delta Ultrasonic Cleaner D 200, Keelung, Đài Loan). Độ hấp thụ được đo ở bước sóng 630 nm. Đối với xét nghiệm gốc DPPH, Trolox (trong 95% cồn) được lấy làm tiêu chuẩn. Sau đó, 75 卩 L dung dịch DPPH 0,5 mM được trộn với 25 卩 L mẫu và để phản ứng ở nhiệt độ phòng trong một nơi tối trong 30 phút. Hỗn hợp được lắc và đo độ hấp thụ ở bước sóng 517.
Phân tích nội dung các loài oxy phản ứng (ROS): Số lượng tế bào đã được điều chỉnh thành 2 x 105 tế bào / mL trong một 12- đĩa giếng có chứa 2 phần trăm FBS. Sau đó, 50 卩 L / mL ECH, RES, và AGE được thêm vào đĩa và ủ ở 37 oC trong 24 giờ. Sau 24 giờ, 2Z, 7Z-dichlorofluorescein-diacetate (DCFH-DA) được thêm vào và ủ ở 37 OC trong 30 phút. Sau khi ly tâm (400x g, 5 phút), phần nổi phía trên được loại bỏ và các tế bào được rửa hai lần bằng nước muối đệm phosphat (PBS). Sau khi tế bào được lơ lửng trong 1 mL PBS và mức ROS được xác định bằng cách sử dụng máy đo lưu lượng tế bào (Flow Cytometer, Becton Dickinson, CA, USA).
Phân tích Định lượng và Định lượng Protein: Protein được chiết xuất bằng cách sử dụng thuốc thử chiết xuất protein (T-PER). Mật độ tế bào được điều chỉnh thành 2 x 105 tế bào / ml trong một 12- đĩa giếng và 50 卩 L / mL ECH, RES, và một thụ thể cho chất đối kháng sản phẩm cuối glycation nâng cao (RAGE), và AGEs được thêm vào và được ủ ở 37 oC trong tủ ấm 5% CO2 trong 24 giờ. Sau đó, 400 卩 L T-PER được thêm vào, loại bỏ các tế bào và ly tâm ở 125, 000 xg trong 20 phút (4 OC). Phần nổi phía trên được thu thập và lưu trữ tại -80 OC (-80 OC tủ đông, Nuaire, Plymouth, MN, Hoa Kỳ) để phân tích thêm. Bộ dụng cụ axit bicinchoninic (BCA) được sử dụng để định lượng protein. Sau đó, 10 卩 L dung dịch tế bào tiêu chuẩn và 200 RL thuốc thử BCA được thêm vào 8- đĩa giếng và ủ ở 37 O Cin trong tủ ấm 5% CO2 trong 30 phút. Độ hấp thụ được đo ở bước sóng 562 nm. Phân tích nhận dạng protein được thực hiện bằng điện di natri dodecyl sulfat (SDS) -polyacrylamide gel (SDS-PAGE). Các mẫu được chuẩn bị bằng cách thêm protein lysate vào đệm tải protein và phân tích Western blot được thực hiện để phát hiện các protein cụ thể.
2.2.2 Phân tích trong Vivo
Thiết kế mô hình động vật: Chuột Sprague-Dawley (SD) sáu mươi {{0} tuần tuổi được mua từ Trung tâm Động vật Phòng thí nghiệm Quốc gia (Đài Bắc, Đài Loan). Mỗi con chuột được nhốt riêng lẻ trong lồng thép không gỉ khử trùng trong điều kiện nhiệt độ được kiểm soát (23 土 1 độ) và độ ẩm (40-60 phần trăm) với chu kỳ 12 giờ sáng / 12 giờ tối. Thức ăn và nước được cung cấp tự do. Mỗi con chuột được thuần hóa trong tuần đầu tiên và cho động vật gặm nhấm trong phòng thí nghiệm là chế độ ăn chính 5001. Tất cả các quy trình đều tuân theo tiêu chuẩn của Ủy ban chăm sóc và sử dụng động vật có tổ chức (IACUC Phê duyệt số 101026) của Đại học Hải dương Quốc gia Đài Loan, Đài Loan. Sau khi thuần hóa, chuột được chia thành hai nhóm: nhóm đối chứng (Con) được cho ăn chế độ ăn trong phòng thí nghiệm 5001 và nhóm bệnh tiểu đường được cho ăn với chế độ ăn nhiều chất béo (HFD, 40%) trong toàn bộ thí nghiệm. Sau khi được cho ăn HFD trong 4 tuần, những con chuột thuộc nhóm tiểu đường được tiêm streptozotocin (65 mg / kg) (STZ) để gây ra bệnh đái tháo đường (DM). Trong vòng 15 phút sau khi tiêm STZ, nicotinamide (230 mg / Kg Trọng lượng cơ thể) đã được tiêm. Một tuần sau khi tiêm, một bài kiểm tra dung nạp glucose qua đường uống (OGTT) được tiến hành để xác định sự khởi phát thành công của bệnh đái tháo đường (DM). Sau đó, những con vật này được chia thành sáu nhóm: đối chứng (được nuôi bằng chế độ ăn trong phòng thí nghiệm 5001); Nhóm DM (DM cộng với 45 phần trăm HFD); Nhóm DMR (DM cộng với rosiglitazone: 0,571 mg / kg BW) cộng với 45 phần trăm HFD; Nhóm DME1 (DM cộng với CTE: 80 mg / kg BW) cộng với 45 phần trăm HFD; Nhóm DME2 (DM cộng với CTE: 160 mg / kg BW) cộng với 45 phần trăm HFD; và nhóm DME4 (DM cộng với CTE: 320 mg / kg BW) cộng với 45 phần trăm HFD. Rosiglitazone (RSG) được lấy làm đối chứng tích cực. Ba liều CTE (80, 160, và 320 mg / kg) đã được sử dụng theo khuyến nghị của Cơ quan Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Đài Loan (TFDA) hướng dẫn đánh giá thực phẩm chức năng. Các phương pháp điều trị đã được đưa ra cho đến khi kết thúc thử nghiệm. Tất cả những con chuột thí nghiệm đều bị hy sinh sau 6 tuần. Máu thu được từ chuột được ly tâm ở tốc độ 3000 vòng / phút trong 15 phút ở 4 độ.
Mian thành phần hiệu quả của cistanche tubulosa
Phần nổi phía trên được kiểm tra để phân tích sau
Xác định tổng Glucose, Triglycerid và Cholesterol: Việc xác định glucose được thực hiện bằng bộ dụng cụ enzym glucose. Sau đó, 20 mẫu huyết tương được thêm vào thuốc thử và giữ ở 37 độ trong 5 phút. Tổng chất béo trung tính và nồng độ cholesterol toàn phần được xác định bằng cách sử dụng bộ dụng cụ enzym triglycerid và cholesterol. Sau đó, 10 ^ L huyết tương được thêm vào thuốc thử và thí nghiệm được tiến hành theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Độ hấp thụ được đo ở bước sóng 510 nm.
Tổng glucose / triglycerid / cholesterol trong huyết tương (mg / dL)=(- ABlank) / (Chuẩn - ABlank) x 200.
A sample: Độ hấp thụ của mẫu máu, ABlank: Giá trị độ hấp thụ của bộ dụng cụ không có mẫu, A standard: Giá trị độ hấp thụ của thuốc thử chuẩn, 200: thuốc thử chuẩn ở nồng độ 200 mg / dL.
Đánh giá Insulin, Leptin và Mô hình Nội môi-Xác định Đề kháng Insulin (HOMA-IR): Mức insulin được xác định bằng bộ dụng cụ ELISA insulin. Tại đây, 25 huyết tương được thêm vào thuốc thử và độ hấp thụ được đo ở bước sóng 450 nm. Tổng hàm lượng leptin được xác định bằng cách sử dụng bộ xét nghiệm miễn dịch enzym leptin. Sau đó, 100 huyết tương được phân tích và đo độ hấp thụ ở bước sóng 450 nm bằng đầu đọc ELISA. Toàn bộ thí nghiệm được tiến hành theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Giá trị HOMA-IR được xác định từ phương trình đánh giá mô hình cân bằng nội môi=Nồng độ insulin huyết tương lúc đói (mU / mL) x nồng độ glucose huyết tương lúc đói (mmol / L) / 22,5.
Peroxy hóa lipid huyết tương: Tại đây, {{0}}. 5 mL huyết tương được trộn với 1 mL thuốc thử (15%, w / v axit trichloroacetic trong 0. 25 N axit hydrochloric (HCl ) và 0. 375 phần trăm, w / v axit thiobarbituric trong 0,25 N HCl) và được đặt trong nồi cách thủy (Water Bath, BUCHI461, Zurich, Thụy Sĩ) ở 100 độ C trong 15 phút. Sau khi làm nguội, 1 mL n-butanol được thêm vào, lắc mạnh và ly tâm ở 1500 xg trong 10 phút. Phần nổi phía trên được thu thập và đo độ hấp thụ ở bước sóng 532 nm [12].
Nồng độ malondialdehyde (MDA) (nM / mL)=[(Ví dụ: 532 nm - Ablank ở 532 nm) / (Chuẩn ở 532 nm - Ablank ở 532 nm)] x 5.
Xác định nồng độ Testosterone và Luteinizing Hormone (LH) trong huyết tương: Bộ testosterone ELISA được sử dụng để đo mức testosterone trong huyết tương. Bộ RIA được sử dụng để xác định nồng độ LH. Sau đó, 50 卩 L huyết tương được thêm vào và các tính toán dựa trên nồng độ của hormone LH-RP -3 (tiêu chuẩn). Các bước tiếp theo được tiến hành theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
Xác định Yếu tố Hoại tử Khối u (TNF) -a và Interleukin -6 (IL -6) Nồng độ: Kháng thể bắt được đã được pha loãng 25 0 lần trong đệm phủ, được thêm vào {{4} } tấm giếng (100 卩 L / giếng), và giữ ở 4 độ C qua đêm. Phần nổi phía trên được hút và rửa 5 lần bằng đệm rửa (1 lần PBS, 0,05% Tween 20). Sau khi ủ (1 giờ) với 200 ^ g chất pha loãng xét nghiệm, các tế bào được rửa 5 lần bằng đệm rửa và 100 ^ L dung dịch chuẩn TNF-a hoặc các mẫu thử nghiệm được thêm vào mỗi giếng và ủ trong 2 giờ. Sau khi rửa, 100 RL IL -6 kháng thể được phát hiện được thêm vào và ủ ở nhiệt độ phòng 1hat. Phần nổi phía trên được hút và rửa 5 lần. Sau đó, 480 RL enzyme avidin-peroxidase cải ngựa (HRP) được thêm vào và ủ trong 30 phút ở nhiệt độ phòng. Phần nổi phía trên được hút và rửa năm lần bằng đệm rửa. Sau đó, 100 RL dung dịch cơ chất được thêm vào và ủ trong 15 phút ở nhiệt độ phòng. Sau đó, 50 RL dung dịch dừng (axit photphoric 1M) được thêm vào mỗi giếng và đo độ hấp thụ ở bước sóng 450 nm.
Lợi ích của Cistanche Echinacoside: Chống oxy hóa
Phân tích các thông số về tinh trùng và tinh hoàn
Lấy mẫu tinh trùng: Việc lấy mẫu tinh trùng được thực hiện theo phương pháp đã được báo cáo trước đây trong [13]. Tinh trùng được thu thập từ phần nổi trên mặt và được sử dụng để phân tích thêm.
Số lượng tinh trùng, số lượng tinh trùng và tinh trùng bất thường: Số lượng tinh trùng được tính bằng cách sử dụng máy đo huyết cầu và dung dịch màu xanh trypan. Sau đó, 100 RL chất lỏng của tinh trùng được trộn với dung dịch xanh trypan, và số lượng tinh trùng, khả năng di chuyển và tinh trùng bất thường được tính bằng máy đo huyết cầu và kính hiển vi [14].
Nitro blue Tetrazolium NBT Giảm và Peroxy hóa Lipid của tinh trùng và Tinh hoàn: Quá trình peroxy hóa lipid và giảm NBT được phân tích theo cùng một quy trình phân tích huyết tương.
Xác định hoạt động của Superoxide Dismutase (SOD) và Catalase: Hoạt động của Superoxide dismutase (SOD) được phân tích bằng cách sử dụng bộ RANSEL. Tại đây, {{0}}. 0 5 mL chất đồng nhất tinh hoàn được thêm vào 1,7 mL dung dịch phản ứng (0. 05 mM xanthine, 0,025 mM 2- ({ {9}} iodophenyl) - 3- (4- nitrophenol) -5- phenyltetrazolium clorua (INT)). Sau khi trộn, 0,25 ml xanthine oxidase (80 U / L) được thêm vào và phản ứng ở nhiệt độ phòng trong 30 s ở nhiệt độ phòng. Độ hấp thụ được đo ở bước sóng 505 nm. Nồng độ protein của tinh hoàn đồng nhất được xác định bằng bộ xét nghiệm protein Bio-Rad DC và hoạt tính cụ thể của nó (U / mg protein) được tính toán. Hoạt tính catalase (CAT) được xác định theo một phương pháp đã được báo cáo trước đây [15].
Nhuộm H&E (Hematoxylin và Eosin)
Tinh hoàn được ngâm trong 10% formalin trong 24 giờ và bảo quản ở 4 độ C. Cắt các mô thành kích thước siêu nhỏ và gắn vào phiến kính. Sau khi cố định (95% metanol và 5% axit axetic), các phiến kính được ngâm trong hematoxylin trong 3 phút, rửa bằng nước chảy trong 5 phút, và sau đó ngâm chúng với cồn 50%, 70% và 90% trong một phút. Sau đó, các phiến kính được nhuộm bằng eosin trong 10 s và ngâm trong cồn 100% trong một phút cho đến khi mờ đi. Cuối cùng, phiến kính được ngâm trong xylen trong một phút. Sau đó, phiến kính được làm khô bằng không khí và niêm phong. Ống nhuộm màu được đặt trong kính hiển vi tương phản pha ngược (Kính hiển vi sai pha ngược, Olympus CK -2, Tokyo, Nhật Bản) để quan sát hình thái.
Phân tích vùng Hypothalamus
Chuột KISS1, thụ thể kết hợp với protein G (GPR) 54, cơ chế ức chế tín hiệu cytokine 3 (SOCS -3) và trình tự gen sirtuin 1 (SIRT1) được xác định từ cơ sở dữ liệu gen NCBI (Trung tâm Thông tin Công nghệ Sinh học Quốc gia) và một lớp sơn lót cụ thể được thiết kế bằng Primer 5. 0 PREMIER Biosoft, Palo Alto, CA, USA.). Các loại mồi được sử dụng trong thí nghiệm được liệt kê trong Bảng 1.
Chiết xuất axit Ribonucleic (RNA) từ Hypothalamus. Việc chiết xuất RNA từ vùng dưới đồi của não được thực hiện bằng cách sử dụng Bộ kit nhỏ mô mỡ RNeasy. Các mRNA thu được được đo định lượng bằng phiên mã ngược (RT) và phản ứng chuỗi polymerase (PCR). DNA khen ngợi thu được từ phân tích RT được lưu trữ ở độ -20 để sử dụng sau này. DNA chiết xuất được trải qua quá trình phân tích phản ứng chuỗi polymerase (PCR) bằng cách sử dụng Taq polymerase. Sau đó, 5 ~ 10 ^ L sản phẩm PCR được lấy và phân tích bằng điện di trên dung dịch keo thạch 1,5%. Hình ảnh được chụp trong hệ thống hình ảnh UVP BioDoc-It. Axit deoxyribonucleic bổ sung được phiên mã ngược (cDNA) được thực hiện và PCR được thực hiện bằng cách sử dụng IQ SYBR Green Supermix Kit. Sau đó, nó được phân tích bằng Phần mềm Hệ thống Quang học iQTM 5. Protein được chiết xuất bằng cách sử dụng thuốc thử chiết xuất protein (T-PER). Sau đó, 20 mg tinh hoàn đồng nhất được thêm vào 400 ^ L T-PER và được ly tâm (Máy ly tâm tốc độ cao, Hettich CR -12, Tuttlingen, Đức) ở 4 độ (125, 000 xg) cho 20 phút Phương pháp sau đây tương tự như "phân tích định lượng và xác định protein" trong phân tích in vitro.
2.3. Phân tích thống kê
Kết quả thử nghiệm được biểu thị dưới dạng độ lệch chuẩn trung bình (Mean 土 SD) và dữ liệu được phân tích bằng phần mềm Giải pháp Sản phẩm & Dịch vụ Thống kê (SPSS) 11. 0, IBM, Armonk, New York, NY, Hoa Kỳ. Sự khác biệt giữa các nhóm được phân tích bằng phân tích phương sai một chiều (ANOVA). Nhiều phép so sánh của các nhóm khác nhau đã được phân tích bằng phép thử của Duncan ở giá trị p <0. 05="" là="" mức="" có="" ý="">
