Tác dụng của chiết xuất Cistanche Tubulosa đối với chức năng sinh sản của nam giới ở chuột mắc bệnh tiểu đường do Streptozotocin – Nicotinamide

Từ khóa:Bệnh tiểu đường; khô khan;Cistanche tubulosatrích xuất(CTE);echinacoside(ECH);chống viêmhoạt động;chất chống oxy hóahoạt động;sinh steroidcác hiệu ứng

Để biết thêm thông tin về lợi ích của bột chiết xuất cistanche

1. Giới thiệu

Đái tháo đường (DM) là tình trạng tăng lượng đường trong máu dodo tuyến tụy kém hiệu quả trong việc sản xuất đủ insulin, hoặc cơ thể không thể sử dụng nócó hiệu quả. Theo WHO, số người mắc bệnh tiểu đường đã tăng từ 108 triệu người vào năm 1980lên 422 triệu vào năm 2014 [1]. Có bốn loại chính: tiền tiểu đường (giai đoạn trước bệnh tiểu đường), loại 1(nơi tuyến tụy không sản xuất được insulin), loại 2 (cơ thể không sử dụng được insulin) và thai kỳbệnh tiểu đường (xảy ra trong thời kỳ mang thai). Ứng suất oxy hóa xảy ra do sự mất cân bằng giữasản xuất các loại oxy phản ứng (ROS) và chất chống oxy hóa [2] cuối cùng dẫn đến tình trạng bệnh tiểu đường.Các biến chứng của bệnh tiểu đường bao gồm suy thận, tổn thương thần kinh, mù lòa, đột quỵ, timtấn công, chết thai và vô sinh. [1]. Các nghiên cứu cho thấy rằng nhân tinh trùng, axit deoxyribonucleic (DNA),và ty thể bị hư hỏng đáng kể ở bệnh nhân nam bị tiểu đường [3]. Ứng suất oxy hóa trongsự vận chuyển của tinh trùng sẽ làm thay đổi quá trình của hệ thống sinh sản nam [4,5]. 

Quá trình sinh tinh được kiểm soát bởi vùng dưới đồi - tuyến yên - tuyến sinh dục (HPG)trục. Hormone giải phóng gonadotropin (GnRH) được sản xuất bởi vùng dưới đồi kích thíchsản xuất hormone hoàng thể (LH) và hormone kích thích nang trứng (FSH). Tế bào Leydig được tìm thấytiếp giáp với ống bán lá kim và sản xuất testosterone dưới sự kiểm soát của LH. FSH kích hoạtsản xuất protein liên kết kháng nguyên (ABP) giúp vận chuyển nội tiết tố nam. Do đó, vô sinhvà các vấn đề khác chủ yếu phát sinh do sự nhiễu loạn xảy ra trong trục HPG. Quản lý củasự kết hợp của streptozotocin – nicotinamide gây ra bệnh tiểu đường ở chuột thí nghiệm. Streptozotocinlà một hợp chất hóa học độc hại để sản xuất insulin tế bào trong tuyến tụy và nicotinamide là mộtvitamin tan trong nước bảo vệ tế bào khỏi bị hư hại hoàn toàn [6]. Cistanche tubulosalà một loài thực vật sa mạc còn được gọi là "Rou Cong-Rong" [7]. Nó là mộtthực vật ký sinh không diệp lục phát triển chủ yếu trên rễ củaCalotropis proceracây và làphân bố rộng rãi ở vùng đất khô cằn Cam Túc, Thanh Hải, Tân Cương, Mông Cổ, Iran, Ấn Độ. Chungtên củaCistanche tubulosalà "Lục bình sa mạc". Nó được chấp nhận rộng rãi trong y học cổ truyền Trung Quốcvà đã được đặt cho cái tên "Nhân sâm của sa mạc". Nó được sử dụng rộng rãi trong lĩnh vực y tế đểđiều trị bệnh đái tháo đường, đau bụng kinh nhiều, bệnh thận mãn tính, táo bón, liệt dương, vàkhô khan. Các thành phần hóa học củaCistanche tubulosabao gồm các glycoside phenylethanoid không bay hơi(PHG), iridoids, lignans, dầu dễ bay hơi, alditols, oligosaccharid và polysaccharid [8]. Họccho thấy rằng echinacoside từ loại thảo mộc này bảo vệ các nguyên bào sợi bị tổn thương bằng cách điều chỉnh mức ROS [9]. Hợp chất này tạo ra các hoạt động chống oxy hóa, giãn mạch và chống viêm tinh hoàn cùng vớibảo vệ thần kinh và ngăn ngừa loãng xương [10,11]. Nghiên cứu này nhằm mục đích điều tra ảnh hưởng củaCistanche tubulosatrích xuấtchứa ECH trênrối loạn chức năng sinh sản của chuột tiểu đường do streptozotocin – nicotinamide gây ra.

2. Vật liệu và phương pháp

2.1. Vật liệu

ECH và CTE được mua từ Sinphar Pharmaceutical Co., Ltd (Yilan, Đài Loan). Nâng caosản phẩm cuối glycation (AGEs) được mua từ Biovision (San Francisco, CA, Hoa Kỳ). LC -540và dòng tế bào TM3 được mua từ Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghiệp Thực phẩm(Hsinchu, Đài Loan). Chuột đực Sprague-Dawley (SD) năm tuần tuổi được mua từTrung tâm Động vật Phòng thí nghiệm Quốc gia (Đài Bắc, Đài Loan). Feed Lab Diet® đã được mua từ PMINutrition International, Inc. (Đài Bắc, Đài Loan). 2, 2- diphenyl -1- picrylhydrazyl (DPPH) đã được thu đượctừ Sigma (St. Louis, MO, Hoa Kỳ). Metanol và 4- (2- hydroxyetyl) -1- piperazineethanesulfonicaxit (HEPES) cũng được mua từ Sigma. Phương tiện Eagle được sửa đổi của Dulbecco / F12 vàtrypsin-EDTA được lấy từ GIBCO (New York, NY, USA). 3- (4, 5- dimethylthiazol -2- yl) -2,5- diphenyltetrazolium bromide (MTT), dichloro-dihydro-flfluorescein diacetate (DCFH-DA), đimetylsulfoxide (DMSO) và nitroblue tetrazolium (NBT) đã được mua từ Sigma. Enzym glucozabộ dụng cụ được lấy từ Kyokutoseiyaku, Tokyo, Nhật Bản. Bộ dụng cụ Insulin ELISA đã được muatừ Mercodia AB Inc., Sylveniusgatan 8A (Uppsala, Thụy Điển). T-PER tách protein môThuốc thử được mua từ Thermo Scientifific (Chicago, IL, Hoa Kỳ). Hạt nhân chống Người / Chuột / Chuộtyếu tố-kappa B NF-κKháng thể đa dòng B được mua từ Santa Cruz Biotechnology, SantaCruz, CA, Hoa Kỳ. Thụ thể chống chuột / chuột cho các sản phẩm cuối glycation tiên tiến (RAGE) đa dòngkháng thể, kháng thể đa dòng chống Người / Chuột / Chuột StAR và chống Người / Chuột / ChuộtKháng thể đơn dòng Cytochrome P 450 17 A1 được mua từ Gene Tex (Irvine, CA, Hoa Kỳ).Kháng thể đa dòng chống Người / Chuột / Chuột CYP11A1 thu được từ Tín hiệu Tế bàoCông nghệ (Beverly, PA, Hoa Kỳ). Thuốc thử easy-Blue được mua từ Invitrogen, Thermo FisherKhoa học (Carlsbad, CA, Hoa Kỳ). Agarose và DNA marker 100 bp thu được từ Promega,Tổng công ty (Madison, WI, Hoa Kỳ). RNeasy Lipid Tissue Mini Kit được mua từ QIAGEN,Hilden, Đức.

5% CO2 tủ ấm (CO2 tủ ấm, Napco 5410, Đài Loan). Dòng tế bào TM3 được nuôi cấy ở Dulbecco'smôi trường Eagle cải tiến (DMEM) bổ sung glucose (4,5 g / L), natri pyruvate (0. 5 mM),L-glutamine (2,5 mM), natri bicacbonat (1,2 g / L), 4- (2- hydroxyethyl) -1- piperazineethanesulfonicaxit (HEPES, 15 mM), và huyết thanh bê thai (FCS, 10 phần trăm) hoặc huyết thanh ngựa (5 phần trăm) ở 37◦C trong 5 phần trămCO2 máy ấp trứng.

Xác định khả năng tồn tại trong tế bào của Echinacoside (ECH): 3- (4, 5- dimethylthiazol -2- yl) -2, 5-Thuốc thử diphenyltetrazolium bromide (MTT) được sử dụng để kiểm tra khả năng sống của tế bào. Nồng độ tế bàođã được điều chỉnh thành 2× 105tế bào / mL trong 96- đĩa giếng. Sau đó, 20µL của ECH (pha loãng trong 2 phần trăm môi trường)được thêm vào và ủ trong 24 giờ ở 37◦C trong 5% CO2 máy ấp trứng. Sau đó, 100µL thuốc thử MTT làđược thêm vào và ủ trong 4 giờ ở 37◦C trong điều kiện tối. Độ hấp thụ được đo ở bước sóng 570 nm(Máy đọc ELISA, Dynatech MR5000, Kloten, Thụy Sĩ).Khả năng sống sót của tế bào tương đối (phần trăm)=[(Amẫu ở bước sóng 570 nm− Atrống ở bước sóng 570 nm)]/[(Akiểm soát ở 570− Atrống ở mức 570)] × 100.

Phân tích nội dung các loài oxy phản ứng (ROS):

Số ô đã được điều chỉnh thành2 × 105tế bào / mLtrong một đĩa giếng 12- có chứa 2 phần trăm FBS. Sau đó, 50µL / mL ECH, RES, và AGEsđược thêm vào đĩa và ủ ở 37◦C trong 24 giờ. Sau 24 giờ, 20 ,70 -dichlorofluorescein-diacetate(DCFH-DA) được thêm vào và ủ ở 37◦C trong 30 phút. Sau khi ly tâm (400× g, 5 phút),

và AGEs đã được thêm vào và ủ ở 37◦C trong 5% CO2 tủ ấm trong 24 h. Sau đó, 400µL trên T-PERđã được thêm vào, loại bỏ các tế bào và ly tâm ở 125, 000× g trong 20 phút (4◦C). Phần nổi trên mặtđược thu thập và lưu trữ tại−80 ◦C (−80 ◦C tủ đông, Nuaire, Plymouth, MN, Hoa Kỳ) để phân tích thêm.

Bộ dụng cụ axit bicinchoninic (BCA) được sử dụng để định lượng protein. Sau đó, 10µL của dung dịch tế bào tiêu chuẩnvà 200µL của thuốc thử BCA được thêm vào 8- đĩa giếng và ủ ở 37◦C trong 5% CO2 lồng ấptrong 30 phút. Độ hấp thụ được đo ở bước sóng 562 nm. Phân tích nhận dạng protein đã được thực hiệnbằng điện di natri dodecyl sulfat (SDS) -polyacrylamide gel (SDS-PAGE). Các mẫu đãđược chuẩn bị bằng cách thêm protein lysate vào đệm tải protein và phân tích Western blot được thực hiệnđể phát hiện các protein cụ thể.

2.2.2. Phân tích In Vivo

Thiết kế Mô hình Động vật: Chuột Sprague – Dawley (SD) sáu mươi 4- tuần tuổi được mua từTrung tâm Động vật Phòng thí nghiệm Quốc gia (Đài Bắc, Đài Loan). Mỗi con chuột được nuôi riêng trong chất khử trùnglồng thép không gỉ dưới nhiệt độ được kiểm soát (23± 1 ◦C) và độ ẩm (40–60 phần trăm) trong 12 giờchu kỳ sáng / 12 giờ tối. Thức ăn và nước được cung cấp tự do. Mỗi con chuột được thuần hóa trong lần đầu tiêntuần và đưa ra chế độ ăn uống cho loài gặm nhấm trong phòng thí nghiệm 5001 làm chế độ ăn chính. Tất cả các quy trình đều tuân theo tiêu chuẩncủa Ủy ban chăm sóc và sử dụng động vật có tổ chức (IACUC Phê duyệt số 101026) của Quốc giaĐại học Hải dương Đài Loan, Đài Loan. Sau khi thuần hóa, chuột được chia thành hai nhóm: đối chứngnhóm (Con) được cho ăn bằng chế độ ăn trong phòng thí nghiệm 5001 và nhóm bị tiểu đường được cho ăn bằng chế độ ăn nhiều chất béo(HFD, 40 phần trăm) cho toàn bộ thử nghiệm. Sau khi được nuôi dưỡng bằng HFD trong 4 tuần, nhóm bệnh nhân tiểu đườngchuột được tiêm streptozotocin (65 mg / kg) (STZ) để gây bệnh đái tháo đường (DM). Ở trong15 phút tiêm STZ, nicotinamide (230 mg / Kg Trọng lượng cơ thể) được tiêm. Một tuần sau khi tiêm,một thử nghiệm dung nạp glucose đường uống (OGTT) đã được thực hiện để xác định sự khởi phát thành công của bệnh tiểu đườngMellitus (DM). Sau đó, những con vật được chia thành sáu nhóm: đối chứng (được nuôi bằng chế độ ăn uống trong phòng thí nghiệm5 0 01); Nhóm DM (DM cộng với 45 phần trăm HFD); Nhóm DMR (DM cộng với rosiglitazone: 0,571 mg / kg BW) cộng với 45 phần trăm HFD;Nhóm DME1 (DM cộng với CTE: 80 mg / kg BW) cộng với 45 phần trăm HFD; Nhóm DME2 (DM cộng với CTE: 160 mg / kg BW)cộng với 45 phần trăm HFD; và nhóm DME4 (DM cộng với CTE: 320 mg / kg BW) cộng với 45 phần trăm HFD. Rosiglitazone (RSG) làđược coi là đối chứng tích cực. Ba liều CTE (80, 160 và 320 mg / kg) được sử dụng theokhuyến nghị của Cục Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Đài Loan (TFDA) về thực phẩm chức nănghướng dẫn đánh giá. Các phương pháp điều trị đã được đưa ra cho đến khi kết thúc thử nghiệm. Tất cả chuột thí nghiệmđã hy sinh sau 6 tuần. Máu được thu thập từ những con chuột được ly tâm ở 3000 vòng / phút cho15 phút lúc 4◦C. Phần nổi phía trên được kiểm tra để phân tích sau:Tổng Glucose, Triglyceride và Cholesterol

Sự quyết tâm:

Việc xác định glucose làđược thực hiện bằng bộ dụng cụ enzym glucoza. Sau đó, 20µL mẫu huyết tương đã được thêm vàothuốc thử và giữ ở 37◦C trong 5 phút. Tổng chất béo trung tính và tổng nồng độ cholesterol làxác định bằng cách sử dụng bộ dụng cụ enzym triglycerid và cholesterol. Sau đó, 10µL huyết tương làthêm vào thuốc thử và thí nghiệm được tiến hành theo hướng dẫn của nhà sản xuất.Độ hấp thụ được đo ở bước sóng 510 nm.Tổng glucose / triglycerid / cholesterol trong huyết tương (mg / dL)=(Avật mẫu− ATrống)/(ATiêu chuẩn− ATrống) × 200. Một mẫu: Độ hấp thụ của mẫu máu, ATrống: Giá trị độ hấp thụ của bộ dụng cụ không có mẫu, Tiêu chuẩn: Giá trị độ hấp thụ của thuốc thử tiêu chuẩn, 200: thuốc thử tiêu chuẩn ở nồng độ200 mg / dL.Đánh giá Insulin, Leptin và Mô hình Nội môi – Xác định Đề kháng Insulin (HOMA-IR):Mức insulin được xác định bằng bộ dụng cụ ELISA insulin. Đây, 25µL huyết tương đã được thêm vàothuốc thử và độ hấp thụ được đo ở bước sóng 450 nm. Tổng hàm lượng leptin được xác định bằng cách sử dụngbộ xét nghiệm miễn dịch men leptin. Sau đó, 100µL của huyết tương được phân tích và độ hấp thụđược đo ở bước sóng 450 nm bằng đầu đọc ELISA. Toàn bộ thí nghiệm được tiến hành theohướng dẫn của nhà sản xuất. Giá trị HOMA-IR được xác định từ mô hình cân bằng nội môiphương trình đánh giá=Nồng độ insulin huyết tương lúc đói (mU / mL)× đường huyết lúc đóinồng độ (mmol / L) / 22,5.Peroxy hóa lipid huyết tương: Tại đây, 0. 5 mL huyết tương được trộn với 1 mL thuốc thử (15%,w / v axit trichloroacetic trong {{0}}. Axit clohydric 25 N (HCl) và 0,375 phần trăm,w/v axit thiobarbituric trong0. 25 N HCl) và được đặt trong một nồi cách thủy (Water Bath, BUCHI 461, Zürich, Thụy Sĩ) ở 100◦C cho15 phút. Sau khi làm nguội, 1 mL n-butanol được thêm vào, lắc mạnh và ly tâm ở 1500× g trong 10 phút. Phần nổi phía trên được thu thập và đo độ hấp thụ ở bước sóng 532 [12]. Nồng độ malondialdehyde (MDA) (nM / mL)=[(Một mẫuở bước sóng 532 nm− Atrống ở bước sóng 532 nm)/ (Tiêu chuẩnở bước sóng 532 nm− Atrống ở bước sóng 532 nm)] × 5. Xác định mức độ Testosterone và Luteinizing Hormone (LH) trong huyết tương: TestosteroneBộ ELISA được sử dụng để đo nồng độ testosterone trong huyết tương. Bộ RIA đã được sử dụng đểxác định nồng độ LH. Sau đó, 50µL plasma đã được thêm vào và các tính toán dựa trênvề nồng độ của hormone LH-RP -3 (tiêu chuẩn). Các bước tiếp theo được tiến hành theotheo hướng dẫn của nhà sản xuất.Xác định Yếu tố Hoại tử Khối u (TNF) - và Interleukin -6 (IL -6) Nồng độ:Kháng thể bắt được pha loãng 250 lần trong dung dịch đệm phủ, được thêm vào đĩa giếng 96- (100µL / tốt),và giữ ở mức 4◦C để qua đêm. Phần nổi phía trên được hút và rửa mười lăm lần bằng rửađệm (1 lần PBS, 0. 05 phần trăm Tween 20). Sau khi ủ (1 giờ) với 200µg của chất pha loãng xét nghiệm, các tế bào đãgiặt 5 lần với đệm giặt và 100µL của TNF- dung dịch tiêu chuẩn hoặc các mẫu thử nghiệm đãthêm vào mỗi giếng và ủ trong 2 giờ. Sau khi rửa, 100µL trong số IL -6 kháng thể được phát hiện đã được thêm vàovà ủ trong 1 h ở nhiệt độ phòng. Phần nổi phía trên được hút và rửa 5 lần. Sau đó,480 µL enzyme avidin-peroxidase cải ngựa (HRP) được thêm vào và ủ trong 30 phút trong phòngnhiệt độ. Phần nổi phía trên được hút và rửa năm mươi lần bằng đệm rửa. Sau đó, 100µL dung dịch cơ chất được thêm vào và ủ trong 15 phút ở nhiệt độ phòng. Sau đó, 50µL dừng lạithêm vào mỗi giếng dung dịch (axit photphoric 1M) và đo độ hấp thụ ở bước sóng 450 nm.Phân tích các thông số về tinh trùng và tinh hoànLấy mẫu tinh trùng: Việc lấy mẫu tinh trùng được thực hiện theophương pháp được báo cáo trước đây trong [13]. Tinh trùng được thu thập từ phần nổi phía trên và được sử dụng đểphân tích sâu hơn.Số lượng tinh trùng, số lượng tinh trùng và tinh trùng bất thường: Số lượng tinh trùng làđược tính bằng máy đo huyết cầu và dung dịch xanh trypan. Sau đó, 100µL chất lỏng tinh trùng làtrộn với dung dịch xanh trypan và số lượng tinh trùng, khả năng di chuyển và tinh trùng bất thường làđược tính bằng máy đo huyết cầu và kính hiển vi [14]. Nitro blue Tetrazolium NBT Giảm và Peroxy hóa Lipid của Tinh trùng và Tinh hoàn: Lipidquá trình peroxy hóa và khử NBT được phân tích theo cùng một quy trình phân tích huyết tương.

Xác định hoạt động của Superoxide Dismutase (SOD) và Catalase: Superoxide dismutaseHoạt động (SOD) được phân tích bằng cách sử dụng bộ RANSEL. Đây, 0. 05 mL tinh hoàn đồng nhấtđã được thêm vào 1,7 mL dung dịch phản ứng (0. 0 5 mM xanthine, 0,025 mM 2- (4- iodophenyl) -{{0}} (4- nitrophenol) -5- phenyltetrazolium clorua (INT)). Sau khi trộn, 0,25 mL xanthine oxidase (80 U / L)đã được thêm vào và phản ứng ở nhiệt độ phòng trong 30 s ở nhiệt độ phòng. Độ hấp thụ làđo ở bước sóng 505 nm. Nồng độ protein của tinh hoàn đồng nhất được xác định bởiBộ xét nghiệm protein Bio-Rad DC và hoạt tính cụ thể của nó (U / mg protein) đã được tính toán. Các catalaseHoạt động (CAT) được xác định theo một phương pháp đã báo cáo trước đây [15]. Nhuộm H&E (Hematoxylin và Eosin)Tinh hoàn được ngâm trong 10% formalin trong 24 giờ và được bảo quản ở 4◦C. Cắt các mô thànhkích thước siêu nhỏ và được gắn vào slide. Sau khi cố định (95 phần trăm metanol cộng với 5 phần trăm axit axetic), các slide đãngâm trong hematoxylin trong 3 phút, rửa bằng nước chảy trong 5 phút, và sau đó ngâm chúng với50%, 70% và 90% cồn trong một phút. Sau đó, các phiến kính được nhuộm bằng eosin trong 10 s vàngâm trong rượu 100 phần trăm trong một phút cho đến khi nó mờ đi. Cuối cùng, slide được ngâm trong xylen để làmphút. Sau đó, phiến kính được làm khô bằng không khí và niêm phong. Ống nhuộm màu được đặt trong một sự tương phản pha đảo ngượckính hiển vi (Kính hiển vi chênh lệch pha đảo ngược, Olympus CK -2, Tokyo, Nhật Bản) để quan sáthình thái học.Phân tích vùng HypothalamusChuột KISS1, thụ thể kết hợp với protein G (GPR) 54, bộ triệt tiêu tín hiệu cytokine 3 (SOCS -3)và sirtuin 1 (SIRT1)trình tự gen được xác định từ NCBI (Trung tâm Công nghệ Sinh học Quốc giaThông tin) cơ sở dữ liệu gen và một đoạn mồi cụ thể được thiết kế bằng Primer 5. 0 PREMIER Biosoft,Palo Alto, CA, Hoa Kỳ.). Các loại mồi được sử dụng trong thí nghiệm được liệt kê trong Bảng1.

Chiết xuất axit Ribonucleic (RNA) từ Hypothalamus. Việc chiết xuất RNA từvùng dưới đồi của não được thực hiện bằng cách sử dụng Bộ dụng cụ nhỏ mô mỡ RNeasy. Thu đượcmRNA được đo định lượng bằng phản ứng phiên mã ngược (RT) và chuỗi polymerase(PCR). DNA khen ngợi thu được từ phân tích RT được lưu trữ tại−20 ◦C để sử dụng sau này.DNA chiết xuất được trải qua quá trình phân tích phản ứng chuỗi polymerase (PCR) bằng cách sử dụng Taq polymerase.Sau đó, 5 ~ 10µL của sản phẩm PCR được lấy và phân tích bằng điện di trên thạch 1,5%Keo. Hình ảnh được chụp trong hệ thống chụp ảnh UVP BioDoc-It. Phần bổ sung được phiên mã ngượcaxit deoxyribonucleic (cDNA) đã được thực hiện và PCR được thực hiện bằng IQ SYBR Green SupermixBộ dụng cụ. Sau đó, nó được phân tích bằng Phần mềm Hệ thống Quang học iQTM 5. Protein được chiết xuất bằng cách sử dụngthuốc thử chiết tách protein (T-PER). Sau đó, 20 mg tinh hoàn đồng nhất được thêm vào 400µL của T-PER và ly tâm (Máy ly tâm tốc độ cao, Hettich CR -12, Tuttlingen, Đức) ở 4◦C (125,000× g) trong 20 phút. Phương pháp sau đây tương tự như "xác định và định lượngphân tích protein ”trong phân tích in vitro.2.3. Phân tích thống kêKết quả thử nghiệm được biểu thị dưới dạng giá trị trung bình± độ lệch chuẩn (Trung bình± SD) vàdữ liệu được phân tích bằng phần mềm Giải pháp Sản phẩm & Dịch vụ Thống kê (SPSS) 11. 0, IBM, Armonk,New York, NY, Hoa Kỳ. Sự khác biệt giữa các nhóm được phân tích bằng cách phân tích một chiều vềphương sai (ANOVA). Nhiều so sánh của các nhóm khác nhau đã được phân tích bằng thử nghiệm của Duncan tạigiá trị củap < 0.05="" as="" the="" signifificant="">

3. Kết quả

3.1. Phân tích trong ống nghiệm

3.1.1. So sánh các hoạt động chống oxy hóa của ECH, CTE và RES

Căng thẳng oxy hóa cao trong thời gian dài và chứng viêm nhiễm mãn tính là những nguyên nhân chính gây ra bệnh tiểu đườngbiến chứng [16]. CTE chứa nhiều glycoside phenylethanoid khác nhau như echinacoside(ECH) và acteoside, với tiềm năng hoạt động chống oxy hóa [17]. DPPH nhặt rác triệt đểthử nghiệm được thực hiện để đánh giá hoạt tính chống oxy hóa của ECH. Trolox và resveratrol(3,5,4'-trihydroxystilbene, RES) lần lượt được lấy làm tiêu chuẩn và đối chứng dương tính. Như hìnhbằng số1, ECH cho thấy hoạt động nhặt rác triệt để tốt hơn và hoạt động cao hơn đáng kểso với kiểm soát tích cực (RES).

3.1.2. Khả năng tồn tại của tế bào ECH trên tế bào Leydig LC -540 và TM3Xét nghiệm MTT được thực hiện để đánh giá khả năng sống sót của tế bào đối với các nồng độ ECH khác nhau.Tế bào LC -540 Leydig và tế bào Leydig TM3 cho thấy hơn 80 phần trăm khả năng sống sót sau khi được điều trị bằngECH (Hình2). So với các nồng độ khác, 100-µNồng độ M (độ pha loãng 100µM trong 2 phần trăm FBS) của ECH cho thấy khả năng tồn tại của tế bào tốt hơn trong tế bào Leydig TM3. Kết quả chỉ ra rằngtăng nồng độ ECH không đóng góp bất kỳ độc tính đáng kể nào đối với tế bào.

3.1.3. Ảnh hưởng của ECH đến sản xuất Superoxide do AGE gây ra bằng thử nghiệm NBT trong LC -540 và TM3Tế bào Leydig

AGEs gây ra tổn thương oxy hóa trong cơ thể do quá trình oxy hóa glucose và hình thànhcác gốc tự do như O2-, gốc hydroxyl, và nhóm cacbonyl [18]. Sau khi được kích thích với50 µg / mL AGEs, LC -540 (Hình3a) và TM3 (Hình3b) các tế bào được xử lý bằng ECH và RES(5 µM và 10µM mỗi). Kết quả cho thấy rằng việc sản xuất anion superoxide đã được tăng lêntrong nhóm đối chứng (AGEs được kích thích), nhưng việc sản xuất anion superoxide đã giảm sau khiđiều trị bằng ECH và RES. Từ hình3, người ta hiểu rằng ECH và RES làm giảm mức độsản xuất superoxide và bảo vệ tế bào khỏi bị oxy hóa. Trong trường hợp ô LC -540,10 µM ECH cho thấy hoạt động gần như tương tự với nhóm bình thường. Sản xuất superoxide trong cả haitế bào bị giảm khi tăng nồng độ của cả ECH và RES.3.1.4. Ảnh hưởng của ECH đến H2O2 Sản xuất trong Tế bào Leydig LC -540 được kích thích bởi AGEThử nghiệm DCFH-DA được thực hiện để phát hiện sự hiện diện của các loài oxy hóa. Sau khi vàotế bào, thuốc nhuộm huỳnh quang FL DCFH-DA bị oxy hóa bởi H nội bào2O2 và tạo thành dichlorofluorescein(DCF). Như thể hiện trong hình4, có sự gia tăng đáng kể H nội bào2O2 sản xuất trongNhóm được kích thích AGE (đối chứng) trong khi bổ sung 10µM ECH và RES giảm đáng kểchữ H2O2 sản xuất trong tế bào. Quản trị 10µM ECH chỉ dẫn đến khoảng 47,1% H2O2 sản lượng, thấp hơn đáng kể so với nhóm chứng.

3.1.5. Ảnh hưởng của ECH đến RAGE và NF-κMức độ biểu hiện của protein B trong LC được kích thích bởi TUỔI -540Tế bào Leydig

Phân tích Western blot đã được thực hiện để xác nhận sự hiện diện của RAGE trong LC -540 Leydigtế bào. Ảnh hưởng của ECH đến RAGE (Hình5a) và NF-κB (Hình5b) mức độ biểu hiện của proteintrong các tế bào Leydig được kích thích AGEs được thể hiện trong Hình5. Kết quả cho thấy, 50µg / mLnồng độ AGEs gây ra RAGE và NF- cao hơnκBiểu thức B trong LC -540 tế bào Leydig và10 µNồng độ M của ECH và RES đã làm giảm đáng kể sự biểu hiện của RAGE và NF-κB. Biểu thức của NF-κB có RES và ECH thấp hơn đáng kể so với thuốc đối kháng RAGE. Vì vậy, kết quảxác nhận rằng ECH làm giảm mức độ lây lan bằng cách giảm mức độ RAGE và NF-κB.

.1.6. Ảnh hưởng của ECH trên con đường Tổng hợp Testosterone trong các tế bào Leydig LC -540 được AGE kích thích.

Quá trình sinh tinh và vô sinh nam phụ thuộc vào sự hiện diện của testosterone.Như thể hiện trong hình6, các biểu thức của StAR (Hình6a), CYP11A1 (Hình6b), CYP17A1 (Hình6c), và HSD17 3 (Hình6d) protein đã giảm đáng kể trong LC được kích thích bởi AGE -540 Leydigô (nhóm điều khiển). Các biểu thức của StAR, CYP11A1, CYP17A1 và HSD17 3 protein làtăng đáng kể khi chất đối kháng RAGE, RES và ECH được thêm vào. Sự gia tăngsự biểu hiện của protein StAR và CYP11A1 được thấy ở cả nhóm điều trị bằng ECH và RES.Mức độ biểu hiện của CYP17A1 gần như tương tự ở các nhóm RES và ECH. Các biểu thức củaHSD17 Protein 3 trong tế bào Leydig được xử lý bằng ECH cao hơn nhiều so với protein của RES và RAGEtế bào điều trị đối kháng. Tăng biểu hiện của StAR, CYP11A1, CYP17A1 và HSD17 3 proteinchỉ ra sự sản xuất bình thường của testosterone.

5tế bào / mL và điều trị bằng RES và ECH(10µM) được quản lý trong 24 giờ. -actin được lấy làm kiểm soát nội bộ. Nhóm bình thường (Cũng không)được xử lý bằng môi trường và nhóm đối chứng (Con) được xử lý bằng AGEs (50µg / mL).

Kết quảđã được thể hiện là có ý nghĩa±SD (n = 3). Sự khác biệt đáng kể (p < 0.05)="" were="" represented="" by="" letters="">được phân tích bằng bài kiểm tra nhiều dải của Duncan.