Tác dụng của chiết xuất Cistanche Tubulosa đối với chức năng sinh sản của nam giới ở chuột mắc bệnh tiểu đường do Streptozotocin–Nicotinamide gây ra-Ⅰ
Sep 04, 2024
1. Giới thiệu
Đái tháo đường (DM) là một tình trạng trong đó có sự gia tăngnồng độ glucosetrong máu do tuyến tụy hoạt động kém hiệu quả trong việc sản xuất đủ insulin hoặc cơ thể không thể sử dụng nó một cách hiệu quả. Theo WHO, số người mắc bệnh tiểu đường đã tăng từ 108 triệu người năm 1980 lên 422 triệu người năm 2014 [1]. Có bốn loại chính: tiền tiểu đường (giai đoạn trước khi mắc bệnh tiểu đường), loại 1 (tuyến tụy không sản xuất insulin), loại 2 (cơ thể không sử dụng insulin) và tiểu đường thai kỳ (xảy ra trong thai kỳ). Căng thẳng oxy hóa xảy ra do sự mất cân bằng giữa việc sản xuất các loại oxy phản ứng (ROS) và chất chống oxy hóa [2] cuối cùng dẫn đến tình trạng bệnh tiểu đường. Các biến chứng của bệnh tiểu đường bao gồm suy thận, tổn thương thần kinh, mù lòa, đột quỵ, đau tim, thai chết và vô sinh. [1]. Các nghiên cứu cho thấy nhân tinh trùng, axit deoxyribonucleic (DNA) và ty thể bị tổn thương đáng kể ở bệnh nhân tiểu đường nam [3]. Căng thẳng oxy hóa trong quá trình vận chuyển tinh trùng sẽ làm thay đổi quá trình của hệ thống sinh sản nam giới [4,5].
CISTANCHE TUBULOSA TỰ NHIÊN ĐỂ CẢI THIỆN CHỨC NĂNG TÌNH DỤC PHGS75% ECH 30% ACT 12%
Quá trình sinh tinh được điều khiển bởi trục vùng dưới đồi-tuyến yên-tuyến sinh dục (HPG). Hormon giải phóng gonadotropin (GnRH) do vùng dưới đồi sản xuất sẽ kích thích sản xuất hormone luteinizing (LH) và hormone kích thích nang trứng (FSH). Tế bào Leydig được tìm thấy gần ống sinh tinh vàsản xuất testosteronedưới sự kiểm soát của LH. FSH kích hoạt sản xuất protein liên kết kháng nguyên (ABP) giúp truyền hormone nam. Vì vậy, vô sinh và các vấn đề khác chủ yếu phát sinh do những rối loạn xảy ra ở trục HPG. Quản lý sự kết hợp của streptozotocin-nicotinamide gây ra bệnh tiểu đường ở chuột thí nghiệm. Streptozotocin là một hợp chất hóa học gây độc cho các tế bào sản xuất insulin trong tuyến tụy và nicotinamide là một loại vitamin tan trong nước giúp bảo vệ tế bào khỏi bị tổn thương hoàn toàn [6].
Cistanche tubulosa là một loài thực vật sa mạc còn được gọi là "Rou Cong-Rong" [7]. Đây là một loại cây ký sinh không diệp lục, mọc chủ yếu trên rễ của cây Calotropis Procera và phân bố rộng rãi ở vùng đất khô cằn Cam Túc, Thanh Hải, Tân Cương, Mông Cổ, Iran và Ấn Độ. Tên thông thường của Cistanche tubulosa là "Lục bình sa mạc". Nó được chấp nhận rộng rãi trong y học cổ truyền Trung Quốc và được mệnh danh là “Nhân sâm của sa mạc”. Nó được sử dụng rộng rãi trong lĩnh vực y học để điều trị bệnh bạch cầu, băng huyết nhiều, bệnh thận mãn tính, táo bón, bất lực và vô sinh. Thành phần hóa học củaCistanche tubulosa bao gồm các glycosid phenylethanoid không bay hơi(PHG), iridoids, lignan, dầu dễ bay hơi, alditol, oligosacarit và polysacarit [8]. Các nghiên cứu cho thấy rằngechinacosidetừ loại thảo dược này bảo vệ nguyên bào sợi bị tổn thương bằng cách điều chỉnh nồng độ ROS [9]. Hợp chất này tạo ra các hoạt động chống oxy hóa, giãn mạch và chống viêm cùng với bảo vệ thần kinh và ngăn ngừa loãng xương [10,11].
Nghiên cứu này nhằm mục đích tìm hiểu ảnh hưởng củaChiết xuất Cistanche tubulosachứa ECH về rối loạn chức năng sinh sản của chuột mắc bệnh tiểu đường do streptozotocin–nicotinamide gây ra.
2. Vật liệu và phương pháp
2.1. Nguyên vật liệu
ECH và CTE được mua từ Sinphar Pharmaceutical Co., Ltd (Yilan, Đài Loan). Các sản phẩm cuối glycation nâng cao (AGE) đã được mua từ Biovision (San Francisco, CA, USA). Các dòng tế bào LC-540 và TM3 được mua từ Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghiệp Thực phẩm (Hsinchu, Đài Loan). Chuột đực Sprague-Dawley (SD) 5 tuần tuổi được mua từ Trung tâm Động vật Phòng thí nghiệm Quốc gia (Đài Bắc, Đài Loan). Feed Lab Diet® được mua từ PMI Nutrition International, Inc. (Đài Bắc, Đài Loan). 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) được lấy từ Sigma (St. Louis, MO, USA). Metanol và 4-(2-hydroxyethyl)-1-axit piperazineethanesulfonic (HEPES) cũng được mua từ Sigma. Môi trường Eagle/F12 và trypsin-EDTA đã được sửa đổi của Dulbecco được lấy từ GIBCO (New York, NY, USA). 3-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenyltetrazolium bromua (MTT), dichloro-dihydro-fluorescein diacetate (DCFH-DA), dimethyl sulfoxide (DMSO) và nitroblue tetrazolium (NBT) được mua từ Sigma. Bộ dụng cụ enzyme glucose được lấy từ Kyokutoseiyaku, Tokyo, Nhật Bản. Bộ dụng cụ ELISA insulin được mua từ Mercodia AB Inc., Sylveniusgatan 8A (Uppsala, Thụy Điển). Thuốc thử chiết xuất protein mô T-PER được mua lại từ Thermo Scientific (Chicago, IL, Hoa Kỳ). Kháng thể đa dòng kháng nhân/Chuột/Chuột-kappa B NF-κB được mua từ Công nghệ sinh học Santa Cruz, Santa Cruz, CA, Hoa Kỳ. Thụ thể kháng chuột/chuột dành cho các kháng thể đa dòng glycation tiên tiến (RAGE), kháng thể đa dòng kháng người/chuột/chuột StAR và kháng thể đơn dòng A1 kháng người/chuột/chuột Cytochrome P{30}}được mua từ Gene Tex (Irvine, CA, Hoa Kỳ). Kháng thể đa dòng chống người/chuột/chuột CYP11A1 được lấy từ Công nghệ tín hiệu tế bào (Beverly, PA, Hoa Kỳ). Thuốc thử Easy-Blue được mua từ Invitrogen, Thermo Fisher Scientific (Carlsbad, CA, USA). Agarose và DNA marker 100 bp được lấy từ Promega, Corporation (Madison, WI, USA). RNeasy Lipid Tissue Mini Kit được mua từ QIAGEN, Hilden, Đức.
CISTANCHE TUBULOSA TỰ NHIÊN ĐỂ CẢI THIỆN CHỨC NĂNG TÌNH DỤC PHGS75% ECH 30% ACT 12%
2.2. phương pháp
2.2.1. Phân tích trong ống nghiệm
Nuôi cấy tế bào LC{0}} và TM3: Các dòng tế bào LC-540 được nuôi cấy ở 37 ◦C trong môi trường Dung dịch muối cân bằng (EBSS) của Earle được bổ sung natri bicarbonate (1,5 g/L), L-glutamine (2 mM), axit amin không thiết yếu (0.1 mM), natri pyruvate (1.0 mM) và huyết thanh bào thai bò (FBS) (10%) trong một Tủ ấm CO2 5% (Tủ ủ CO2, Napco 5410, Đài Loan). Dòng tế bào TM3 được nuôi cấy trong môi trường Eagle cải tiến (DMEM) của Dulbecco bổ sung glucose (4,5 g/L), natri pyruvate (0,5 mM), L-glutamine (2,5 mM), natri bicarbonate (1,2 g/L), {{ 28}}(2-hydroxyethyl)-1-axit piperazineethanesulfonic (HEPES, 15 mM) và huyết thanh thai nhi (FCS, 10%) hoặc huyết thanh ngựa (5%) ở 37 ◦C trong 5% tủ ấm CO2.
Xác định khả năng sống của tế bàoEchinacoside (ECH): Thuốc thử 3-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5- diphenyltetrazolium bromide (MTT) đã được sử dụng để xét nghiệm khả năng sống của tế bào. Nồng độ tế bào được điều chỉnh thành 2 × 105 tế bào / mL trong đĩa giếng 96-. Sau đó, 20 µL ECH (pha loãng trong 2% môi trường) được thêm vào và ủ trong 24 giờ ở 37 ◦C trong tủ ấm 5% CO2. Sau đó, 100 µL thuốc thử MTT được thêm vào và ủ trong 4 giờ ở 37 ◦C trong điều kiện tối. Độ hấp thụ được đo ở bước sóng 570 nm (đầu đọc ELISA, Dynatech MR5000, Kloten, Thụy Sĩ).
Khả năng tồn tại của tế bào tương đối (%)=[(Mẫu ở 570 nm − Ablank ở 570 nm)]/[(A control ở 570 − Ablank ở 570)] × 100.
Xét nghiệm khử Nitroblue Tetrazolium (NBT) và Xét nghiệm 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH): Số lượng tế bào được điều chỉnh thành 1× 1{{10}}6 tế bào/ mL. Sau đó, 50 mg/mL ECH, resveratrol (RES) và các sản phẩm cuối cùng của glycation nâng cao (AGEs) (đối chứng) được thêm vào và đồng nuôi cấy trong 18 giờ ở 37 ◦C. Sau đó, 0,3 mL dung dịch NBT (0,1 mg/mL NBT, 5% FBS và 3% dimethyl sulfoxide (DMSO) hòa tan trong 10 mL DMEM) được thêm vào và ủ ở 37 ◦C trong 5% CO2 trong 1 giờ. Sau khi ly tâm (ở tốc độ 800 × g trong 3 phút), phần nổi phía trên được loại bỏ và 200 µL DMSO được thêm vào và lắc trong 5 phút trong máy tạo dao động siêu âm (Delta Sonic Cleaner D 200, Keelung, Đài Loan). Độ hấp thụ được đo ở bước sóng 630 nm. Đối với xét nghiệm gốc DPPH, Trolox (trong cồn 95%) được lấy làm chất chuẩn. Sau đó, trộn 75 µL dung dịch DPPH 0,5 mM với 25 µL mẫu và để phản ứng ở nhiệt độ phòng trong nơi tối trong 30 phút. Hỗn hợp được lắc và đo độ hấp thụ ở bước sóng 517 nm.
Phân tích hàm lượng các loại oxy phản ứng (ROS): Số lượng tế bào được điều chỉnh thành 2 × 105 tế bào/mL trong một đĩa giếng 12-chứa 2% FBS. Sau đó, 50 µL/mL ECH, RES và AGEs được thêm vào đĩa và ủ ở 37 ◦C trong 24 giờ. Sau 24 giờ, 20,70 -dichlorofluorescein-diacetate (DCFH-DA) được thêm vào và ủ ở 37 ◦C trong 30 phút. Sau khi ly tâm (400 × g, 5 phút), phần nổi phía trên được loại bỏ và các tế bào được rửa hai lần bằng dung dịch muối đệm phốt phát (PBS). Sau đó, các tế bào được treo lơ lửng trong 1 mL PBS và nồng độ ROS được xác định bằng cách sử dụng máy đo tế bào dòng chảy (Flow Cytometer, Becton Dickinson, CA, USA).
Xác định và phân tích định lượng protein: Protein được chiết xuất bằng cách sử dụng thuốc thử chiết protein (T-PER). Mật độ tế bào được điều chỉnh thành 2 × 105 tế bào/mL trong đĩa 12-giếng và 50 µL/mL ECH, RES và một thụ thể cho chất đối kháng sản phẩm cuối glycation tiên tiến (RAGE), đồng thời AGE được thêm vào và ủ ở 37 ◦C trong tủ ấm 5% CO2 trong 24 giờ. Sau đó, 400 µL T-PER được thêm vào, loại bỏ tế bào và ly tâm ở tốc độ 125,000× g trong 20 phút (4 ◦C). Chất nổi phía trên được thu thập và bảo quản ở −80 ◦C (tủ đông −80 ◦C, Nuaire, Plymouth, MN, USA) để phân tích thêm. Một bộ axit bicinchoninic (BCA) đã được sử dụng để định lượng protein. Sau đó, 10 µL dung dịch tế bào tiêu chuẩn và 200 µL thuốc thử BCA được thêm vào các đĩa giếng 8-và ủ ở 37 ◦C trong tủ ấm 5% CO2 trong 30 phút. Độ hấp thụ được đo ở bước sóng 562 nm. Phân tích nhận dạng protein được thực hiện bằng phương pháp điện di gel natri dodecyl sulfate (SDS) -polyacrylamide (SDS-PAGE). Các mẫu được chuẩn bị bằng cách thêm protein ly giải vào dung dịch đệm nạp protein và phân tích Western blot được thực hiện để phát hiện các protein cụ thể.
2.2.2. Phân tích trong Vivo
Thiết kế mô hình động vật: Những con chuột đực Sprague–Dawley (SD) sáu mươi tuần tuổi {{0}} được mua từ Trung tâm Động vật Phòng thí nghiệm Quốc gia (Đài Bắc, Đài Loan). Mỗi con chuột được nhốt riêng trong các lồng thép không gỉ khử trùng ở nhiệt độ được kiểm soát (23 ± 1 ◦C) và độ ẩm (40–60%) với chu kỳ 12 giờ sáng/12 giờ tối. Thức ăn và nước uống được cung cấp tự do. Mỗi con chuột được thuần hóa trong tuần đầu tiên và cho ăn chế độ ăn gặm nhấm trong phòng thí nghiệm 5001 làm chế độ ăn chính. Tất cả các quy trình đều tuân theo tiêu chuẩn của Ủy ban Chăm sóc và Sử dụng Động vật Thể chế (IACUC Phê duyệt số 101026) của Đại học Quốc gia Đại Dương Đài Loan, Đài Loan. Sau khi thuần hóa, chuột được chia thành hai nhóm: nhóm đối chứng (Con) được cho ăn chế độ ăn trong phòng thí nghiệm 5001 và nhóm mắc bệnh tiểu đường được cho ăn chế độ ăn nhiều chất béo (HFD, 40%) trong toàn bộ thí nghiệm. Sau khi được cho ăn HFD trong 4 tuần, chuột thuộc nhóm mắc bệnh tiểu đường được tiêm streptozotocin (65 mg/kg) (STZ) để gây ra bệnh đái tháo đường (DM). Trong vòng 15 phút sau khi tiêm STZ, nicotinamide (230 mg/Kg Trọng lượng cơ thể) đã được tiêm. Một tuần sau khi tiêm, xét nghiệm dung nạp glucose đường uống (OGTT) đã được tiến hành để xác định khả năng khởi phát thành công bệnh đái tháo đường (DM). Sau đó, các con vật được chia thành sáu nhóm: nhóm đối chứng (được cho ăn theo chế độ ăn trong phòng thí nghiệm 5001); Nhóm DM (DM + 45% HFD); Nhóm DMR (DM + rosiglitazone: 0,571 mg/kg thể trọng) + 45% HFD; Nhóm DME1 (DM + CTE: 80 mg/kg BW) + 45% HFD; Nhóm DME2 (DM + CTE: 160 mg/kg BW) + 45% HFD; và nhóm DME4 (DM + CTE: 320 mg/kg BW) + 45% HFD. Rosiglitazone (RSG) được lấy làm đối chứng dương. Ba liều CTE (80, 160 và 320 mg/kg) đã được sử dụng theo khuyến nghị của hướng dẫn đánh giá chức năng thực phẩm sức khỏe của Cục Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Đài Loan (TFDA). Phương pháp điều trị đã được thực hiện cho đến khi kết thúc thí nghiệm. Tất cả chuột thí nghiệm đã bị hy sinh sau 6 tuần. Máu thu được từ chuột được ly tâm ở tốc độ 3000 vòng/phút trong 15 phút ở 4 ◦C. Chất nổi phía trên được kiểm tra để phân tích như sau:
Xác định Glucose tổng số, Triglyceride và Cholesterol: Việc xác định glucose được thực hiện bằng bộ dụng cụ enzyme glucose. Sau đó, 20 µL mẫu huyết tương được thêm vào thuốc thử và giữ ở 37 ◦C trong 5 phút. Tổng lượng chất béo trung tính và nồng độ cholesterol tổng được xác định bằng cách sử dụng bộ dụng cụ enzyme chất béo trung tính và cholesterol. Sau đó, 10 µL huyết tương được thêm vào thuốc thử và thí nghiệm được tiến hành theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Độ hấp thụ được đo ở bước sóng 510 nm.
Tổng lượng glucose/triglyceride/cholesterol trong huyết tương (mg/dL)=(Asample − ABlank)/(Astandard − ABlank) × 200.
Asample: Độ hấp thụ của mẫu máu, ABlank: Giá trị độ hấp thụ của bộ dụng cụ không có mẫu, Astandard: Giá trị độ hấp thụ của thuốc thử chuẩn, 200: thuốc thử chuẩn ở nồng độ 200 mg/dL.
Đánh giá mô hình insulin, Leptin và cân bằng nội môi – Xác định tình trạng kháng insulin (HOMA-IR):Mức insulin được xác định bằng bộ dụng cụ ELISA insulin. Ở đây, 25µL huyết tương đã được thêm vàothuốc thử và đo độ hấp thụ ở bước sóng 450 nm. Tổng hàm lượng leptin được xác định bằng cách sử dụngBộ xét nghiệm miễn dịch enzym leptin.Sau đó, 100µL huyết tương được phân tích và độ hấp thụđược đo ở bước sóng 450 nm bằng đầu đọc ELISA. Toàn bộ thí nghiệm được tiến hành theohướng dẫn của nhà sản xuất. Giá trị HOMA-IR được xác định từ mô hình cân bằng nội môiphương trình đánh giá=Nồng độ insulin trong huyết tương lúc đói (mg/mL)× glucose huyết tương lúc đóinồng độ (mmol/L)/22,5.
Peroxid hóa lipid huyết tương: Ở đây, {{0}},5 mL huyết tương được trộn với 1 mL thuốc thử (15%, w/v axit trichloroacetic trong 0.25 N axit clohydric (HCl ) và 0.375%, w/v axit thiobarbituric trong HCl 0,25 N) và đặt vào nồi cách thủy (Bể nước, BUCHI 461, Zürich, Thụy Sĩ) ở 100 ◦C trong 15 phút. Sau khi làm mát, thêm 1 mL n-butanol, lắc mạnh và ly tâm ở tốc độ 1500 × g trong 10 phút. Chất nổi phía trên được thu thập và độ hấp thụ được đo ở bước sóng 532 nm [12].
Nồng độ Malondialdehyde (MDA) (nM/mL)=[(Một mẫu ở 532 nm − Ablank ở 532 nm)/ (Một mẫu chuẩn ở 532 nm − Ablank ở 532 nm)] × 5.
chuẩn ở bước sóng 532 nm − Ablank ở bước sóng 532 nm)] × 5. Xác định nồng độ Testosterone trong huyết tương và Hormon tạo hoàng thể (LH): Bộ ELISA testosterone được sử dụng để đo mức testosterone trong huyết tương. Bộ RIA được sử dụng để xác định nồng độ LH. Sau đó, 50 µL huyết tương được thêm vào và các phép tính được dựa trên nồng độ của hormone LH-RP-3 (tiêu chuẩn). Các bước tiếp theo được thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
Xác định nồng độ yếu tố hoại tử khối u (TNF)- và Interleukin-6 (IL-6): Kháng thể thu được được pha loãng 250 lần trong dung dịch đệm phủ, được thêm vào 96- đĩa giếng (100 µL/giếng) và giữ ở 4 ◦C qua đêm. Chất nổi phía trên được hút và rửa năm lần bằng dung dịch đệm rửa (1 lần PBS, 0,05% Tween 20). Sau khi ủ (1 giờ) với 200 µg chất pha loãng xét nghiệm, các tế bào được rửa 5 lần bằng dung dịch đệm rửa và 100 µL dung dịch chuẩn TNF hoặc mẫu thử được thêm vào từng giếng và ủ trong 2 giờ. Sau khi rửa, 100 µL kháng thể được phát hiện IL{18}}được thêm vào và ủ trong 1 giờ ở nhiệt độ phòng. Phần nổi phía trên được hút và rửa 5 lần. Sau đó, 480 µL enzyme avidin-horseradish peroxidase (HRP) được thêm vào và ủ trong 30 phút ở nhiệt độ phòng. Chất nổi phía trên được hút và rửa năm lần bằng dung dịch đệm rửa. Sau đó, 100 µL dung dịch cơ chất được thêm vào và ủ trong 15 phút ở nhiệt độ phòng. Sau đó, 50 µL dung dịch dừng (axit photphoric 1M) được thêm vào từng giếng và đo độ hấp thụ ở bước sóng 450 nm.
CISTANCHE TUBULOSA TỰ NHIÊN ĐỂ SỬA CHỮA CHỨC NĂNG TÌNH DỤC PHGS75% ECH 30% ACT 12%
Phân tích các thông số tinh trùng và tinh hoàn
Lấy mẫu tinh trùng: Việc lấy mẫu tinh trùng được thực hiện theo phương pháp được báo cáo trước đó trong [13]. Tinh trùng được thu thập từ phần nổi phía trên và được sử dụng để phân tích thêm.
Số lượng tinh trùng, khả năng di chuyển của tinh trùng và tinh trùng bất thường: Số lượng tinh trùng được tính toán bằng máy đo huyết cầu và dung dịch xanh trypan. Sau đó, 100 µL chất lỏng tinh trùng được trộn với dung dịch xanh trypan và số lượng tinh trùng, khả năng vận động và tinh trùng bất thường được tính toán bằng máy đo huyết sắc tố và kính hiển vi [14].
Nitro blue Tetrazolium Giảm NBT và Peroxid hóa lipid của tinh trùng và tinh hoàn: Quá trình peroxid hóa lipid và giảm NBT được phân tích theo cùng một quy trình phân tích huyết tương.
Xác định hoạt tính Superoxide Dismutase (SOD) và Catalase: Hoạt tính Superoxide dismutase (SOD) được phân tích bằng cách sử dụng bộ RANSEL. Ở đây, {{0}}.05 mL chất đồng nhất tinh hoàn đã được thêm vào 1,7 mL dung dịch phản ứng (0,05 mM xanthine, 0,025 mM 2-({ {9}}iodophenyl)- 3-(4-nitrophenol)-5-phenyltetrazolium clorua (INT)). Sau khi trộn, 0,25 mL xanthine oxidase (80 U/L) được thêm vào và phản ứng ở nhiệt độ phòng trong 30 giây. Độ hấp thụ được đo ở bước sóng 505 nm. Nồng độ protein của chất đồng nhất trong tinh hoàn được xác định bằng bộ xét nghiệm protein Bio-Rad DC và hoạt tính cụ thể của nó (U/mg protein) đã được tính toán. Hoạt tính catalase (CAT) được xác định theo phương pháp đã được báo cáo trước đó [15].
Nhuộm H&E (Hematoxylin và Eosin)
Tinh hoàn được ngâm trong 10% formalin trong 24 giờ và bảo quản ở 4 ◦C. Các mô có kích thước siêu nhỏ và được gắn vào slide. Sau khi cố định (95% metanol + 5% axit axetic), các phiến kính được ngâm trong hematoxylin trong 3 phút, rửa bằng nước chảy trong 5 phút, sau đó ngâm chúng với cồn 50%, 70% và 90% trong một phút. Sau đó, các phiến kính được nhuộm bằng eosin trong 10 giây và ngâm trong cồn 100% trong một phút cho đến khi phai màu. Cuối cùng, phiến kính được ngâm trong xylen trong một phút. Sau đó, slide được làm khô trong không khí và bịt kín. Ống nhuộm màu được đặt trong kính hiển vi tương phản pha ngược (Kính hiển vi lệch pha ngược, Olympus CK-2, Tokyo, Nhật Bản) để quan sát hình thái.
Phân tích vùng dưới đồi
Trình tự gen KISS1, thụ thể kết hợp G-protein (GPR) 54 của chuột, chất ức chế tín hiệu cytokine 3 (SOCS-3) và trình tự gen sirtuin 1 (SIRT1) đã được xác định từ cơ sở dữ liệu gen NCBI (Trung tâm Thông tin Công nghệ sinh học Quốc gia) và một lớp sơn lót cụ thể được thiết kế bằng Primer 5.0 PREMIER Biosoft, Palo Alto, CA, USA.). Các mồi được sử dụng trong thí nghiệm được liệt kê trong Bảng 1.
Chiết xuất axit Ribonucleic (RNA) từ vùng dưới đồi. Việc trích xuất RNA từ vùng dưới đồi của não được thực hiện bằng cách sử dụng Bộ công cụ mô nhỏ mô lipid RNeasy. Các mRNA thu được được đo định lượng bằng phương pháp sao chép ngược (RT) và phản ứng chuỗi polymerase (PCR). DNA bổ sung thu được từ phân tích RT được lưu trữ ở −20 ◦C để sử dụng sau. DNA chiết xuất được phân tích bằng phản ứng chuỗi polymerase (PCR) bằng Taq polymerase. Sau đó, 5~10 µL sản phẩm PCR được lấy và phân tích bằng điện di trên chất keo thạch 1,5%. Hình ảnh được chụp trong hệ thống hình ảnh UVP BioDoc-It. Axit deoxyribonucleic bổ sung được phiên mã ngược (cDNA) đã được lấy và PCR được thực hiện bằng cách sử dụng Bộ Supermix xanh IQ SYBR. Sau đó, nó được phân tích bằng Phần mềm hệ thống quang học iQTM 5. Protein được chiết xuất bằng cách sử dụng thuốc thử chiết protein (T-PER). Sau đó, 20 mg chất đồng nhất tinh hoàn được thêm vào 400 µL T-PER và ly tâm (Máy ly tâm tốc độ cao, Hettich CR-12, Tuttlingen, Đức) ở 4 ◦C (125,000× g ) trong 20 phút. Phương pháp sau đây tương tự như "phân tích xác định và định lượng protein" trong phân tích in vitro.
2.3. Phân tích thống kê
Các kết quả thử nghiệm được biểu thị dưới dạng trung bình ± độ lệch chuẩn (Trung bình ± SD) và dữ liệu được phân tích bằng phần mềm Giải pháp Sản phẩm & Dịch vụ Thống kê (SPSS) 11.{1}}, IBM, Armonk, New York, NY, USA. Sự khác biệt giữa các nhóm được phân tích bằng phân tích phương sai một chiều (ANOVA). Nhiều so sánh của các nhóm khác nhau được phân tích bằng thử nghiệm của Duncan với giá trị p < 0.05 là mức ý nghĩa.
3. Kết quả
3.1. Phân tích trong ống nghiệm
3.1.1. So sánh hoạt động chống oxy hóa của ECH, CTE và RES
dài hạnCăng thẳng oxy hóa cao và viêm mãn tính là nguyên nhân chính gây ra bệnh tiểu đườngbiến chứng [16]. CTE chứa nhiều loạiglycoside phenylethanoid như echinacoside(ECH) và Acteoside, với tiềm năng hoạt động chống oxy hóa [17]. Quét gốc tự do DPPHxét nghiệm được tiến hành để đánh giá hoạt tính chống oxy hóa của ECH. Trolox và resveratrol(3,5,4'-trihydroxystilbene, RES) lần lượt được lấy làm chất chuẩn và chất đối chứng dương. Như được hiển thịtrong hình1, ECH thể hiện hoạt tính quét gốc tự do tốt hơn và hoạt tính này cao hơn đáng kểhơn so với đối chứng dương (RES).
3.1.2. Khả năng tồn tại của tế bào ECH trên tế bào LC-540 và TM3 Leydig
Xét nghiệm MTT được thực hiện để đánh giá khả năng tồn tại của tế bào ở các nồng độ ECH khác nhau. Tế bào LC-540 Leydig và tế bào TM3 Leydig cho thấy khả năng sống sót hơn 80% sau khi được xử lý bằng ECH (Hình 2). So với các nồng độ khác, nồng độ 100-µM (pha loãng 100 µM trong 2% FBS) của ECH cho thấy khả năng tồn tại của tế bào tốt hơn trong các tế bào TM3 Leydig. Kết quả chỉ ra rằng nồng độ ECH tăng lên không gây ra bất kỳ độc tính đáng kể nào cho tế bào.
3.1.3. Ảnh hưởng của ECH đến việc sản xuất Superoxide do AGE gây ra bằng xét nghiệm NBT trong tế bào LC-540 và TM3 Leydig
AGEs gây ra tổn thương oxy hóa trong cơ thể do quá trình oxy hóa glucose và hình thành các gốc tự do như O2-, gốc hydroxyl và nhóm carbonyl [18]. Sau khi được kích thích bằng 50 ug/mL AGEs, các tế bào LC-540 (Hình 3a) và TM3 (Hình 3b) được xử lý bằng ECH và RES (mỗi tế bào 5 μM và 10 μM). Kết quả cho thấy việc sản xuất anion superoxide tăng lên ở nhóm đối chứng (AGEs được kích thích), nhưng việc sản xuất anion superoxide giảm sau nhóm đối chứng (AGEs được kích thích), nhưng việc sản xuất anion superoxide lại giảm sau khi sản xuất superoxide và được bảo vệ. các tế bào khỏi bị hư hại do oxy hóa. Trong trường hợp tế bào LC-540, 10 µM ECH cho thấy hoạt động gần như tương tự với nhóm bình thường. Việc sản xuất superoxide ở cả hai tế bào đều giảm khi nồng độ của cả ECH và RES tăng lên.
CISTANCHE TUBULOSA TỰ NHIÊN ĐỂ CẢI THIỆN CHỨC NĂNG TÌNH DỤC PHGS75% ECH 30% ACT 12%
3.1.4. Ảnh hưởng của ECH đến việc sản xuất H2O2 trong các tế bào Leydig LC{6}} được kích thích bởi AGE
Xét nghiệm DCFH-DA được thực hiện để phát hiện sự hiện diện của các loài oxy hóa. Sau khi đi vào tế bào, thuốc nhuộm huỳnh quang DCFH-DA bị oxy hóa bởi H2O2 nội bào và tạo thành dichlorofluorescein (DCF). Như được hiển thị trong Hình 4, có sự gia tăng đáng kể về sản xuất H2O2 nội bào trong nhóm được kích thích bằng AGE (đối chứng) trong khi việc bổ sung 10 µM ECH và RES làm giảm đáng kể việc sản xuất H2O2 trong tế bào. Sử dụng 10 µM ECH chỉ tạo ra khoảng 47,1% lượng H2O2, thấp hơn đáng kể so với nhóm đối chứng.
3.1.5. Ảnh hưởng của ECH đến mức độ biểu hiện protein RAGE và NF-κB trong tế bào Leydig LC-540 được kích thích bởi AGE
Phân tích Western blot đã được thực hiện để xác nhận sự hiện diện của RAGE trong các tế bào LC{0}} Leydig. Ảnh hưởng của ECH đến mức độ biểu hiện protein RAGE (Hình 5a) và NF-κB (Hình 5b) trong các tế bào Leydig được kích thích bằng AGEs được thể hiện trong Hình 5. Kết quả cho thấy nồng độ AGEs 50 µg/mL gây ra RAGE và NF- cao hơn Biểu hiện κB trong tế bào Leydig LC-540 và nồng độ 10 µM của ECH và RES làm giảm đáng kể sự biểu hiện của RAGE và NF-κB. Sự biểu hiện của NF-κB ở RES và ECH thấp hơn đáng kể so với chất đối kháng RAGE. Vì vậy, kết quả đã xác nhận rằng ECH làm giảm mức độ viêm bằng cách giảm mức độ RAGE và NF-κB.
3.1.6. Ảnh hưởng của ECH đến con đường tổng hợp Testosterone trong các tế bào Leydig LC{4}} được kích thích bởi AGE.
Quá trình sinh tinh và vô sinh nam phụ thuộc vào sự hiện diện của testosterone. Như được hiển thị trong Hình 6, các biểu hiện của protein StAR (Hình 6a), CYP11A1 (Hình 6b), CYP17A1 (Hình 6c) và HSD17 3 (Hình 6d) đã giảm đáng kể trong LC{{11 được kích thích bởi AGE }} Tế bào Leydig (nhóm đối chứng). Sự biểu hiện của protein StAR, CYP11A1, CYP17A1 và HSD{16}} đã tăng lên đáng kể khi chất đối kháng RAGE, RES và ECH được thêm vào. Sự biểu hiện gia tăng của protein StAR và CYP11A1 đã được thấy ở cả nhóm được điều trị bằng ECH và RES. Mức độ biểu hiện của CYP17A1 gần như tương tự ở nhóm RES và ECH. Sự biểu hiện của protein HSD17 3 trong các tế bào Leydig được xử lý bằng ECH cao hơn nhiều so với các tế bào được xử lý bằng chất đối kháng RES và RAGE. Sự biểu hiện gia tăng của các protein StAR, CYP11A1, CYP17A1 và HSD{30}} cho thấy quá trình sản xuất testosterone bình thường.
