Ảnh hưởng của thời gian cắt thận đối diện và tình trạng thiếu máu cục bộ lên xơ thận sau chấn thương tái tưới máu thiếu máu cục bộ một bên thận
Oct 27, 2023
Giới thiệu
Tỷ lệ mắc bệnhchấn thương thận cấp tính(AKI) đã tăng lên đáng kể trên toàn thế giới trong những năm gần đây [1]. AKI có thể do ghép tạng, sau phẫu thuật dưới tưới máu, chảy máu, mất nước, sốc và nhiễm trùng huyết trong thực hành lâm sàng [2]. Các nghiên cứu dịch tễ học và thực nghiệm gần đây đã chỉ ra rằng mức độ nghiêm trọng, tần suất và thời gian xảy ra AKI có liên quan chặt chẽ với tỷ lệ mắc bệnh sau đó.bệnh thận mãn tính(CKD). Xơ hóa thận sau AKI có thể dẫn đến bệnh thận mạn hoặc thậm chíbệnh thận giai đoạn cuối(ESKD) [3–5], ngụ ý rằng AKI và CKD là các hội chứng liên kết [6]. Tuy nhiên, các cơ chế chuyển đổi từ AKI sang CKD vẫn chưa được biết rõ mặc dù đã có nhiều nghiên cứu thực nghiệm và lâm sàng. Mô hình động vật là công cụ quan trọng để nghiên cứu cơ chế AKI dẫn đến CKD. Chấn thương tái tưới máu do thiếu máu cục bộ ở thận (IRI) là một trong những nguyên nhân chính gây ra AKI và một số mô hình động vật về AKI do IRI gây ra đã được phát triển [7], bao gồm mô hình IRI hai bên (bIRI), mô hình IRI đơn phương với thận đối bên còn nguyên vẹn. , mô hình uIRI với phẫu thuật cắt thận đối bên đồng thời và mô hình uIRI với phẫu thuật cắt thận đối bên muộn.
Mô hình bIRI kém nhất quán hơn vì khi tổn thương do thiếu máu cục bộ ở cả hai quả thận quá nhẹ thì không có sự thay đổi đáng kể về xơ hóa trong thời gian dài. Khi AKI quá nặng chuột có thể chết ở giai đoạn tổn thương cấp tính. Hơn nữa, những khác biệt nhỏ về tổn thương của hai quả thận có thể dẫn đến những khác biệt đáng kể về bệnh lý thận mãn tính sau một vài tuần [8,9]. Mô hình uIRI với phẫu thuật cắt thận đối diện đồng thời tương tự như mô hình bIRI vì chỉ còn lại quả thận bị tổn thương do cắt thận bên kia [10]. Trong mô hình IRI với thận đối diện còn nguyên vẹn, tình trạng xơ hóa ở thận thiếu máu cục bộ là nghiêm trọng [11,12]. Mô hình này rất nhất quán và đáng tin cậy để các nhà nghiên cứu quan sát lâu dài. Tuy nhiên, do có một quả thận bên đối diện không bị tổn thương nên nó không thể được sử dụng để đánh giá mức lọc cầu thận ước tính (eGFR), creatinine huyết thanh (SCr) và nitơ urê máu (BUN) [11–14]. So với hai mô hình uIRI đã đề cập ở trên, mô hình uIRI với việc trì hoãn cắt thận đối diện sẽ khắc phục được những vấn đề này và có thể được sử dụng cho cả việc theo dõi lâu dài sau AKI và theo dõi chức năng thận. Vì vậy, mô hình này phù hợp để nghiên cứu quá trình chuyển đổi AKI-CKD [15].
BẤM VÀO ĐÂY ĐỂ NHẬN CHIẾT XUẤT CISTANCHE CHOTỔN THƯƠNG THẬN CẤP TÍNH
Tuy nhiên, các tình trạng thiếu máu cục bộ khác nhau và khoảng thời gian giữa phẫu thuật cắt thận đối bên và uIRI có thể có tác động đáng kể đến sự tiến triển và mức độ nghiêm trọng của CKD sau AKI. Các nghiên cứu trước đây tập trung vào ảnh hưởng của thời gian thiếu máu cục bộ đến tình trạng xơ hóa thận sau AKI và chưa chú ý nhiều đến nhiệt độ cơ thể trong quá trình thiếu máu cục bộ. Ví dụ, Skrypnyk và cộng sự. [12] đã kiểm soát nhiệt độ thiếu máu cục bộ ở 38 C bằng hệ thống tắm nước, với thời gian thiếu máu cục bộ là 30 phút và quả thận nguyên vẹn đối bên đã được cắt bỏ 8 ngày sau uIRI. Kết quả cho thấy thận thiếu máu cục bộ có những thay đổi xơ hóa đáng kể 28 ngày sau uIRI. Với cùng thời gian thiếu máu cục bộ, Xiao et al. [8] cho thấy những thay đổi xơ hóa đáng kể xảy ra 11 ngày sau uIRI khi nhiệt độ thiếu máu cục bộ được kiểm soát ở mức 37 C - 38 C và khoảng thời gian giữa uIRI và phẫu thuật cắt thận đối bên là 10 ngày. Một số nhà nghiên cứu, chẳng hạn như Colombaro et al. [14] và Li và cộng sự. [16] không đề cập đến nhiệt độ thiếu máu cục bộ trong nghiên cứu của họ.
Trong khi đó, rất ít người nghiên cứu ảnh hưởng của khoảng thời gian giữa phẫu thuật cắt thận đối diện và uIRI trong mô hình này, dẫn đến kết quả rất khác nhau giữa các phòng thí nghiệm khác nhau, điều này cũng ảnh hưởng đáng kể đến các thí nghiệm tiếp theo. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã nghiên cứu tác động của các yếu tố chính ảnh hưởng đến xơ hóa thận sau AKI, bao gồm khoảng thời gian giữa phẫu thuật cắt thận đối diện và uIRI, nhiệt độ cơ thể trong thời gian thiếu máu cục bộ và thời gian thiếu máu cục bộ. Chúng tôi mong muốn cung cấp tài liệu tham khảo để tạo ra một mô hình động vật phù hợp cho việc nghiên cứu quá trình chuyển đổi AKI CKD
Vật liệu và phương pháp Mô hình động vật
Chuột đực C57BL/6J (8–10 tuần tuổi, nặng khoảng 22 g; GemPharmatech Co., Ltd., Nam Kinh, Trung Quốc) được cung cấp thức ăn và nước uống miễn phí tại Trung tâm Thí nghiệm Động vật của Đại học Y Sơn Tây. Các điều kiện chăn nuôi như sau: độ ẩm 40–70%, nhiệt độ 23 C, độ sạch không khí cấp 7, chu kỳ sáng/tối 12-h được kiểm soát trong điều kiện không có mầm bệnh, cho ăn chiếu xạ Co60 và nước tinh khiết. Tất cả các thủ tục cho nghiên cứu này đã được phê duyệt bởi Ủy ban đạo đức động vật của Bệnh viện số 2 của Đại học Y Sơn Tây (số đạo đức: DW2022028).
Giao thức
Xét rằng thời gian thiếu máu cục bộ, nhiệt độ cơ thể trong thời gian thiếu máu cục bộ và thời gian cắt bỏ thận không bị tổn thương đối bên đều có thể tác động đến mức độ nghiêm trọng của AKI và tình trạng xơ hóa thận sau đó, chúng tôi đã nghiên cứu tác động của ba yếu tố trên một cách riêng lẻ, với hai yếu tố còn lại cố định. Ba thí nghiệm đã được tiến hành như sau.
Phác đồ 1: Để quan sát ảnh hưởng của khoảng thời gian giữa phẫu thuật cắt thận đối diện và uIRI đến chức năng thận và xơ hóa sau AKI, thời gian thiếu máu cục bộ của thận trái được cố định là 24 phút và nhiệt độ cơ thể cốt lõi được cố định ở mức 37 C trong quá trình thận thiếu máu cục bộ trong khi đó. Việc cắt bỏ thận phải được tiến hành lần lượt vào ngày 7, ngày 10 và ngày 14 (n=8 mỗi nhóm) sau IRI thận trái. Chúng tôi xác định thời gian thiếu máu cục bộ và cắt bỏ thận dựa trên kết quả của các nghiên cứu trước đó [8,10,12,15] và kết quả trước thử nghiệm của chúng tôi. Xem Hình 1(A–C) để biết quy trình nghiên cứu.
Phác đồ 2: Để quan sát ảnh hưởng của nhiệt độ cơ thể trong quá trình thiếu máu cục bộ đến quá trình chuyển tiếp AKI-CKD, thời gian thiếu máu cục bộ của thận trái được cố định là 24 phút và thận phải được cắt bỏ 14 ngày sau IRI thận trái. Nhiệt độ cơ thể cốt lõi được kiểm soát lần lượt ở 36 C, 36,5 C, 37 C, 37,5 C và 38 C (n=8 mỗi nhóm). Xem Hình 1(D) để biết quy trình nghiên cứu.
Phác đồ 3: Để quan sát ảnh hưởng của thời gian thiếu máu cục bộ ở thận đối với quá trình chuyển từ AKI sang CKD, nhiệt độ cơ thể cốt lõi được cố định ở 37 C trong thời gian thiếu máu cục bộ và thận phải được cắt bỏ 14 ngày sau IRI thận trái. Chúng tôi chọn thời điểm này là do xơ hóa thận, sự thay đổi điển hình sau AKI sang CKD, rất rõ ràng theo các báo cáo [8,10,12,15] và kết quả trước thử nghiệm của chúng tôi. Thời gian thiếu máu cục bộ của thận trái được kiểm soát lần lượt là 21 phút, 24 phút, 27 phút và 30 phút (n=8 mỗi nhóm). Xem Hình 1(E) để biết quy trình nghiên cứu.
Tất cả những con chuột đã được phú dưỡng vào lúc 8 tuần sau IRI ở thận trái. Một phần mô thận trái được bảo quản ở nhiệt độ 70 C để phân tích RT-PCR và Western blot tiếp theo, và phần còn lại được cố định trong formalin trung tính để phân tích mô bệnh học. Các mẫu máu được thu thập qua xoang quỹ đạo sau để xét nghiệm sinh hóa.
Hình 1. Sơ đồ điều trị tổn thương tái tưới máu do thiếu máu cục bộ một bên (uIRI) với phẫu thuật cắt thận đối bên muộn. (A–C): Thận trái được điều trị IRI vào ngày 0 và việc cắt bỏ thận phải được tiến hành vào các thời điểm khác nhau (ngày 7, ngày 10 và ngày 14) với thời gian thiếu máu cục bộ cố định ở 24 phút với nhiệt độ cơ thể cốt lõi cố định ở 37 C khi thiếu máu cục bộ thận. (D): Thận trái được điều trị IRI vào ngày 0 và việc cắt bỏ thận phải được tiến hành ở các nhiệt độ cơ thể cốt lõi khác nhau (36 C, 36,5 C, 37 C, 37,5 C và 38 C) với tình trạng thiếu máu cục bộ thời gian thận trái cố định là 24 phút và thận phải được cắt sau 14 ngày kể từ thận trái IRI. (E): Thận trái được điều trị bằng IRI vào ngày 0 và việc cắt bỏ thận phải được tiến hành ở các khoảng thời gian thiếu máu cục bộ khác nhau (21 phút, 24 phút, 27 phút và 30 phút) với nhiệt độ cơ thể cố định ở 37 C trong quá trình thận thiếu máu cục bộ và thận phải được cắt bỏ 14 ngày sau IRI thận trái. Trọng lượng thận, chức năng thận, tổn thương mô thận và xơ hóa thận được đánh giá cho đến ngày thứ 56.
Thủ tục phẫu thuật
Trước khi phẫu thuật, tất cả những con chuột đều nhịn ăn trong 12 giờ, được tiếp cận với nước miễn phí và được tiêm 3% pentobarbital natri 50 mg/kg vào màng bụng. Trong quá trình gây mê, nhiệt độ trực tràng được duy trì ở mức tương ứng là 36 C, 36,5 C, 37 C, 37,5 C hoặc 38 C ở các nhóm thử nghiệm khác nhau. Để đạt được điều này, con chuột được đặt ngửa trên một tấm đệm sưởi (CW{{10}}, BARBAROUS GROWTH, Chiết Giang, Trung Quốc) ở tư thế đầu và cổ mở rộng để đảm bảo đường thở của nó vẫn được duy trì không bị cản trở và mắt được phủ bằng gạc nước muối ấm để tránh bị khô trong quá trình thực hiện. Sau khi gây mê, lông lưng bên trái của chuột được cạo bằng tông đơ. Da ở vùng phẫu thuật sau đó được lau sạch bằng tăm bông chứa cồn 75%. Nói chung, nhiệt độ cơ thể của chuột giảm sau khi cạo lông. Quy trình phẫu thuật được thực hiện khi nhiệt độ cơ thể trở nên không đổi, có thể mất khoảng 15 phút. Có thể nhìn thấy thận trái bằng cách cắt da lưng trái 0,5 cm cạnh đường giữa và 0,5 cm ở mép dưới lồng xương sườn của chuột. Sau đó chúng tôi dùng một tay bóp bụng trái để thận trái ra khỏi khoang cơ thể, nhấc thận lên bằng kẹp cong cùn (chú ý tránh làm tổn thương thận), tách cuống thận ra và kẹp thật nhanh rồi đặt kẹp vào. thận dưới da để giữ ấm và giữ ẩm. Thiếu máu cục bộ thành công được đặc trưng bởi sự thay đổi màu sắc dần dần của thận từ đỏ sang tím đậm, kéo dài lần lượt 21 phút, 24 phút, 27 phút và 30 phút ở các nhóm thử nghiệm khác nhau. Màu thận chuyển trở lại màu đỏ trong vòng 2–5 phút sau khi nhả kẹp. Sau đó, chúng tôi đóng khoang bụng bằng chỉ khâu nhiều lớp. Da và cơ lưng bên phải được rạch lần lượt vào ngày 7, ngày 10 và ngày 14 sau uIRI ở các nhóm thử nghiệm khác nhau và thận phải đã được cắt bỏ. Sau đó đóng vết thương bằng chỉ khâu tiêu chuẩn. Sau mỗi ca phẫu thuật, 500 lL nước muối được tiêm vào màng bụng để bù lượng dịch mất trong quá trình phẫu thuật. Đồng thời, chuột được đặt trên đệm sưởi trong khoảng 2–3 giờ cho đến khi nó tỉnh hẳn trước khi được chuyển vào chuồng nuôi. Nhóm giả không kẹp cuống thận và các ca phẫu thuật còn lại cũng giống như nhóm uIRI. Tất cả các ca phẫu thuật đều được thực hiện bởi cùng một người có hơn 2 năm kinh nghiệm vận hành mô hình này.
Xét nghiệm chức năng thận
Mức SCr được đo bằng Bộ Creatinine (Phương pháp Jaffe, 100020170, Khoa học và Công nghệ sinh học Biosino). Mức BUN được đo bằng Bộ Urea (Phương pháp Urease-Glutamate Dehydrogenase, Khoa học và Công nghệ sinh học Biosino).
Xét nghiệm trọng lượng thận
Sau khi đi tiểu, trọng lượng cơ thể của chuột được đo bằng cân điện tử chính xác. Thận tươi được rửa ba lần trong nước muối đã được làm lạnh trước, sau đó lượng nước dư thừa trên thận được loại bỏ bằng giấy lọc. Những viên nang thận được bóc ra trên đá và những quả thận được cân ngay lập tức. Tỷ lệ trọng lượng thận so với trọng lượng cơ thể được tính toán để đánh giá trọng lượng thận đã điều chỉnh tính bằng mg/g.
Điểm nhuộm Hematoxylin-eosin (HE) và điểm tổn thương thận
Các mô thận cố định bằng formalin trung tính được khử nước thường xuyên, nhúng vào parafin, cắt lát (3 lm) và nhuộm HE để quan sát tổn thương của các mô thận. Mười trường được chọn ngẫu nhiên của vỏ thận của mỗi phần được chụp bằng kính hiển vi ánh sáng ở độ phóng đại 400. Hai nhà nghiên cứu bệnh học đã ghi nhận tổn thương ở cầu thận và ống thận riêng biệt. Chấn thương ống thận được cho điểm theo thang điểm {{20}}–4 sử dụng các tiêu chí sau [17]: 0, không có chấn thương; 1, ảnh hưởng 1–25% diện tích thận; 2, ảnh hưởng đến 26–50% diện tích thận; 3, ảnh hưởng 51–75% diện tích thận; và 4, ảnh hưởng đến 75–100% diện tích thận. Mức độ tổn thương ống thận được đánh giá bán định lượng bằng cách tính diện tích tổn thương ống thận. Tổn thương cầu thận được đánh giá và cho điểm theo thang điểm từ 0–4 theo phần trăm diện tích giãn nở gian mạch hoặc xơ cứng bằng các tiêu chí sau [17]: 0, cầu thận bình thường; 1, 1–25% diện tích bị thương; 2, 26–50% diện tích bị thương; 3, 51–75% diện tích bị thương; và 4, 76–100% diện tích bị thương. Điểm tổn thương cầu thận cuối cùng ¼ 0 (% cầu thận loại 0) þ 1 (% cầu thận loại 1) þ 2 (% cầu thận loại 2) þ 3 (% cầu thận loại 3) þ 4 (% cầu thận loại 4). Hơn 50 cầu thận đã được ghi trên mỗi con chuột.
Nhuộm ba màu của Masson
Các mô thận cố định bằng formalin trung tính được khử nước thường xuyên, nhúng vào parafin, cắt lát (3 lm) và nhuộm màu ba màu của Masson để quan sát tình trạng xơ hóa thận. Trong các lát cắt nhuộm màu ba màu của Masson, hai mươi trường vỏ thận không chồng chéo được chụp dưới độ phóng đại 200. Phần mềm phân tích hình ảnh Image-Pro Plus được sử dụng để đo và phân tích tự động. Tỷ lệ phần trăm diện tích xơ hóa được sử dụng để xác định mức độ xơ hóa kẽ thận [8].
RT-PCR
MRNA tổng số được chiết xuất từ mô thận của mỗi nhóm bằng Trizol và đo nồng độ, sau đó chuyển đổi thành cDNA (Bộ phiên mã ngược Taka). Phương pháp huỳnh quang Taqman (TB Green Premix Ex Taq II Real-time RT-PCR) đã được sử dụng để định lượng các biểu hiện RNA fibronectin (FN) và collagen I (COL-I) trong các mô thận. Các đoạn mồi cụ thể đã được sử dụng cho FN (chuyển tiếp: 50 -GGAGTGGCACTGTCAACCTC-30 và đảo ngược: 50 -ACTGGATGGGGTGGGAAT-30 ) và COL-I (chuyển tiếp: 50 -ACATGTTCAGCTTTGTGGACC{ {9}} và đảo ngược: 50 -TAGGCCATTGTGTATGCAGC-30 ) [18] (được cung cấp bởi Sangon Biotech Co., Ltd., Thượng Hải, Trung Quốc). Các điều kiện khuếch đại như sau: 95 C trong 30 giây, 95 C trong 5 giây, 60 C trong 30 giây, 40 chu kỳ; 95 C trong 10 giây, 65 C trong 5 giây và 95 C/5 C. Sau khi phân tích đường cong khuếch đại và đường cong hòa tan của sản phẩm, mức mRNA tương đối được xác định bằng phương pháp CT so sánh (2-DDCt) với 18SrRNA (chuyển tiếp: 50 - CGGACACGGACAG GATTGACAG-30 và đảo ngược: 50 -AATCGCTCCACCAACT AAGAACGG-30 ) làm tham chiếu nội bộ.
phong cách phương Tây
Dung dịch đệm ly giải xét nghiệm miễn dịch phóng xạ (RIPA) được sử dụng để ly giải các mô thận và nồng độ protein được xác định bằng phương pháp BCA. Điện di trên gel gradient được sử dụng để tách protein khỏi 50 lg mẫu. Sau đó, protein được chuyển đến màng nitrocellulose. Sau khi ngăn chặn bằng sữa không béo 5% trong 2 giờ, màng được làm mờ qua đêm ở 4 C bằng kháng thể đơn dòng chống chuột của thỏ chống lại Actin cơ trơn (a-SMA) (1:1000, No.19245, Công nghệ Tín hiệu Tế bào ), FN (1:1000, No.ab2413, ABCam) hoặc COL-I (1:1000, No.72026, Công nghệ tín hiệu di động), tương ứng. Vào ngày hôm sau, màng được làm ấm lại ở nhiệt độ phòng trong 0,5 giờ. Sau khi được rửa bằng TBST, các màng được ủ bằng HRP kết hợp AfiniPure dê kháng thỏ IgG(H þ L)(1:1000, No.BA1054, Công nghệ sinh học BOSTER) trong 2 giờ. Sau khi được rửa bằng TBST một lần nữa, chúng được nhuộm bằng thuốc thử phát quang hóa ECL có độ nhạy cực cao để hình dung các tế bào miễn dịch. b-actin được đo trên cùng màng với chất tham chiếu bên trong. Biểu hiện protein được xác định bằng cách định lượng biểu hiện tương đối của protein mục tiêu so với b-actin.
Phân tích dữ liệu và thống kê
Tất cả dữ liệu được kiểm tra được thể hiện dưới dạng trung bình ± độ lệch chuẩn. So sánh giữa hai nhóm được truy cập bằng một bài kiểm tra t độc lập. So sánh giữa nhiều nhóm được ANOVA một chiều truy cập khi phân phối dữ liệu bình thường và phương sai đồng nhất, Welch ANOVA được sử dụng để đánh giá ý nghĩa thống kê khi phương sai không đồng nhất, sau đó là bài kiểm tra hậu kỳ của Tukey để so sánh nhiều lần. Tất cả các phân tích thống kê được thực hiện bằng phần mềm GraphPad Prism 8.0. p < 0.05 được coi là có ý nghĩa thống kê.
Dịch vụ hỗ trợ của Wecistanche-Nhà xuất khẩu cistanche lớn nhất ở Trung Quốc:
Email:wallence.suen@wecistanche.com
Whatsapp/Điện thoại:+86 15292862950
Mua sắm để biết thêm thông số kỹ thuật
https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop
