Tác dụng của axit Perfluorooctanoic đối với hệ vi sinh vật đường ruột và các chất chuyển hóa của vi sinh vật ở chuột C57BL/6JⅡ

2. Vật liệu và phương pháp

2.1. Động vật

Chuột đực C57BL/6J không có mầm bệnh cụ thể 4 tuần tuổi được mua từ Phòng thí nghiệm Jackson (Bar Harbor, ME, Hoa Kỳ). Chuột tiêu thụ nước uống quảng cáo tự do. Cơ sở động vật tại Đại học Georgia được duy trì ở nhiệt độ 22 ◦C và độ ẩm 40−70%, trong chu kỳ sáng: tối 12:12 giờ. Trước thí nghiệm tiếp xúc với PFOA, năm con chuột được nhốt trong một lồng và những con chuột thay đổi lồng ngẫu nhiên mỗi tuần một lần trong bốn tuần. Việc tiếp xúc với PFOA bắt đầu khi chuột được 8 tuần tuổi và thời gian tiếp xúc kéo dài 4 tuần. Khi bắt đầu thử nghiệm, những con chuột được phân ngẫu nhiên vào nhóm phơi nhiễm PFOA hoặc nhóm đối chứng (n=10 con chuột trong mỗi nhóm), với một con chuột trong một lồng. PFOA (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) được dùng cho chuột qua nước uống. Nồng độ cuối cùng của PFOA trong nước uống là 1 phần triệu (ppm). Liều được chọn dựa trên nghiên cứu trước đây của chúng tôi [24]. Chuột đối chứng tiêu thụ nước uống mà không bổ sung PFOA. Quy trình dành cho động vật đã được phê duyệt bởi Ủy ban Chăm sóc và Sử dụng Động vật Thể chế, Đại học Georgia(mã quy trình: A2014 10-014-Y2-A1).

CLICK VÀO cách chữa táo bón tại nhà

2.2. Chiết xuất chất trao đổi chất

Việc chiết xuất các chất chuyển hóa được thực hiện như mô tả trước đây [25]. Tóm lại, 20 µL của mỗi mẫu huyết thanh được chiết bằng 225 µL metanol. Các mẫu được xoáy trong 10 giây. Sau đó, 750 µL metyl tert-butyl ete (MTBE) và 188 µL nước được thêm vào các mẫu trên để tạo ra sự tách pha. Các mẫu được lắc ở 4 ◦C trong 6 phút, sau đó ly tâm ở 14,000× g trong 2 phút. Dung môi chiết được loại khí và làm nguội trước ở −20 ◦C. Pha không phân cực phía trên (350 µL) được thu thập và làm bay hơi đến khô hoàn toàn bằng thiết bị cô đặc bẫy lạnh Labconco Centrivap (Labconco, Kansas, MO, Hoa Kỳ). Đối với các mẫu gan và phân, 225 µL metanol và 750 µLMTBE được thêm vào 10 mg mỗi mẫu. Các mẫu được đồng nhất hóa bằng aGenoGrinder 2010 (SPEX SamplePrep, Metuchen, NJ, USA) ở tốc độ 1500 vòng/phút cho 30 cát sau đó xoáy và lắc ở 4 ◦C trong 6 phút. Sau đó, 188 µL nước được thêm vào các mẫu, sau đó ly tâm ở tốc độ 14,000× g trong 2 phút. Pha không phân cực phía trên (350 µL) được thu lại và làm bay hơi đến khô hoàn toàn. Sau đó, các mẫu đã khô được hòa lại trong 60 µL axetonitril 4:1 và nước (v/v) cùng với chất chuẩn nội. Các mẫu được xoáy xoáy, sau đó được siêu âm trong 5 phút và ly tâm ở tốc độ 14,000× g trong 2 phút. Chất nổi phía trên được thu thập để phân tích LC-MS.

2.3. Hồ sơ chuyển hóa không có mục tiêu

Hồ sơ chuyển hóa không nhắm mục tiêu đã được thực hiện như mô tả trước đây [25]. Hệ thống Vanquish UHPLC (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) được sử dụng để tách chất chuyển hóa bằng cột Acquity UPLC BEH Amide (150 mm × 2,1 mm × 1,7 µm), được ghép nối với cột Acquity VanGuard BEH Amide trước cột (5 mm × 2,1 mm × 1,7 µm, Waters, Milford, MA, USA). Nước cấp LC-MS (100%) với 10 mM amoni formate và 0.125% axit formic (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO , Hoa Kỳ) được sử dụng làm pha động A. Trong khi đó, acetonitril 95:5: nước (v/v) chứa 10 mM amoni formate và 0,125% axit formic được sử dụng làm pha động B. Độ dốc bắt đầu bằng 100% B ở 0– 2 phút, 70% Bat trong 7,7 phút, 40% B ở 9,5 phút và 30% B ở 10,25 phút, tiếp theo là 100% B ở 12,75–16,75 phút. Tốc độ dòng được giữ ở mức 0,4 mL/phút. Phổ được thu thập ở chế độ dương ion hóa phun điện tử (ESI) bằng cách sử dụng Q-Exactive HF (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA). Phạm vi khối lượng được đặt từ m/z 60 đến 900 với chế độ phụ thuộc dữ liệu để thu quang phổ MS/MS. Dữ liệu thô về chuyển hóa không được nhắm mục tiêu lần đầu tiên được chuyển đổi thành tệp ABF bằng trình chuyển đổi ABF (https://www.reifycs.com/AbfConverter/ (truy cập vào ngày 6 tháng 7 năm 2022)). MSDIAL phiên bản 5.1.0.1 đã được sử dụng để xác định và định lượng các chất chuyển hóa [26]. Trình tối ưu hóa danh sách tính năng phổ khối (MS-FLO) đã được sử dụng để cải thiện chất lượng của danh sách tính năng bằng cách gắn cờ các tính năng để quản lý dữ liệu thêm [27]. Thư viện thời gian lưu giữ m/zvà cơ sở dữ liệu quang phổ Fiehn HILIC MS/MS ở MassBank của Bắc Mỹ được sử dụng để xác định các chất chuyển hóa.

2.4. Giải trình tự gen 16S rRNA

Tổng số DNA được chiết xuất từ ​​​​các mẫu phân bằng bộ phân lập DNA PowerSoil® (MO BIO Laboratories, Carlsbad, CA, USA), theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Các đoạn mồi 515F và 806R được sử dụng để khuếch đại vùng V4 của gen 16S rRNA, sau đó bằng cách chuẩn hóa và mã vạch. DNA được giải trình tự trên bộ IlluminaMiSeq v2 với 500 chu kỳ. Dữ liệu giải trình tự gen 16S rRNA được phân tích bằng cách sử dụng Thông tin chi tiết định lượng về Sinh thái vi sinh vật (QIIME) II [28]. Tóm lại, dữ liệu tuần tự thô được khử nhiễu thông qua DADA2, sau đó là lựa chọn đơn vị phân loại vận hành (OTU). SILVA (phiên bản 138), được đào tạo bởi trình phân loại dựa trên Naïve-Bayes dựa trên scikit-learn, đã được sử dụng làm cơ sở dữ liệu.

2.5. Phân tích thống kê

Kích thước hiệu ứng phân tích phân biệt tuyến tính (LEfSe) đã được sử dụng để xác định các giống vi khuẩn có nhiều khả năng giải thích sự khác biệt giữa PFOA và nhóm đối chứng [29]. Để so sánh các chất chuyển hóa, thử nghiệm Mann-Whitney U được sử dụng để tính giá trị p giữa nhóm PFOA và nhóm đối chứng. Tỷ lệ phát hiện sai được sử dụng để sửa nhiều so sánh. Các chất chuyển hóa có giá trị p < 0.05 được coi là đáng kể. Phân tích phân biệt bình phương nhỏ nhất một phần (PLS-DA) và phân tích làm giàu con đường được thực hiện bằng MetaboAnalyst 5.0 [30]. MixOmics được sử dụng để phân tích tổng hợp hệ vi sinh vật đường ruột và các chất chuyển hóa trong phân—đây là một khung tích hợp để phân tích đa biến dữ liệu omics [31].

Thuốc thảo dược tự nhiên để giảm táo bón-Cistanche

Cistanche là một chi thực vật ký sinh thuộc họ Orobanchaceae. Những loại cây này được biết đến với đặc tính chữa bệnh và đã được sử dụng trong Y học cổ truyền Trung Quốc (TCM) trong nhiều thế kỷ. Các loài Cistanche chủ yếu được tìm thấy ở các vùng khô cằn và sa mạc ở Trung Quốc, Mông Cổ và các khu vực khác ở Trung Á. Cây Cistanche có đặc điểm là thân màu vàng, nhiều thịt và được đánh giá cao vì lợi ích sức khỏe tiềm tàng của chúng. Trong TCM, Cistanche được cho là có đặc tính bổ và thường được sử dụng để nuôi dưỡng thận, tăng cường sinh lực và hỗ trợ chức năng tình dục. Nó cũng được sử dụng để giải quyết các vấn đề liên quan đến lão hóa, mệt mỏi và sức khỏe tổng thể. Trong khi Cistanche có lịch sử sử dụng lâu dài trong y học cổ truyền, nghiên cứu khoa học về hiệu quả và độ an toàn của nó vẫn đang được tiến hành và còn hạn chế. Tuy nhiên, nó được biết là có chứa nhiều hợp chất hoạt tính sinh học khác nhau như phenylethanoid glycoside, iridoids, lignans và polysaccharides, có thể góp phần vào tác dụng chữa bệnh của nó.

Wecistanche'sbột cistanche, viên cistanche, viên nang cistanchevà các sản phẩm khác được phát triển bằng cách sử dụngsa mạcbể chứa nướclàm nguyên liệu đều có tác dụng tốt trong việc giảm táo bón. Cơ chế cụ thể như sau: Cistanche được cho là có lợi ích tiềm năng trong việc giảm táo bón dựa trên cách sử dụng truyền thống và một số hợp chất nhất định mà nó chứa. Mặc dù nghiên cứu khoa học cụ thể về tác dụng của Cistanche đối với táo bón còn hạn chế, nhưng nó được cho là có nhiều cơ chế có thể góp phần tạo nên tiềm năng giảm táo bón. Tác dụng nhuận tràng:Cistanchetừ lâu đã được sử dụng trong Y học cổ truyền Trung Quốc như một phương thuốc chữa táo bón. Nó được cho là có tác dụng nhuận tràng nhẹ, có thể giúp thúc đẩy nhu động ruột và gây táo bón. Tác dụng này có thể là do các hợp chất khác nhau trong Cistanche, chẳng hạn như glycosid phenylethanoid và polysacarit. Làm ẩm đường ruột: Dựa trên cách sử dụng truyền thống, Cistanche được coi là có đặc tính giữ ẩm, đặc biệt nhắm vào đường ruột. Thúc đẩy quá trình hydrat hóa và bôi trơn ruột có thể giúp làm mềm các công cụ và tạo điều kiện cho việc đi lại dễ dàng hơn, từ đó làm giảm táo bón. Tác dụng chống viêm: Táo bón đôi khi có thể liên quan đến tình trạng viêm ở đường tiêu hóa. Cistanche chứa một số hợp chất nhất định, bao gồm phenylethanoid glycoside và lignan, được cho là có đặc tính chống viêm. Bằng cách giảm viêm trong ruột, nó có thể giúp cải thiện nhu động ruột đều đặn và giảm táo bón.