Hiệu quả và cơ chế của cistanches chiết xuất Herba trong điều trị rối loạn chức năng sinh sản ở chuột bị thiếu hụt thận-yang dựa trên chất chuyển hóa

Tóm tắtNghiên cứu này điều traHiệu ứng bảo vệ sinh sảnVàcơ chế tiềm năng của chiết xuất thảo mộc cistanches(Che) Trên một mô hình chuột củaThiếu thận-yanggây ra bởi adenine. Chuột được chia ngẫu nhiên thành năm nhóm: bình thường, mô hình, Che liều thấp (0. 6 g · kg -1 · d -1) mg · kg -1 · d -1). Những con chuột được sử dụng adenine (200 mg · kg -1 · d -1) bằng cách điều trị trong 14 ngày đầu tiên gây ra sự thiếu hụt yang thận, đồng thời được điều trị bằng thuốc. Sau 14 ngày, mô hình đã bị ngừng, nhưng điều trị bằng thuốc vẫn tiếp tục trong 49 ngày. Nội dung của các thành phần trong CHE được phân tích bằng sắc ký lỏng hiệu suất cao (HPLC). Mô hình thiếu hụt thận yang do adenine gây ra được đánh giá thông qua đặc tính triệu chứng và đo mức testosterone (T) bằng cách sử dụng bộ xét nghiệm miễn dịch miễn dịch liên kết với enzyme (ELISA). Thiệt hại bệnh lý đối với tinh hoàn và mào tinh hoàn được đánh giá dựa trên trọng lượng ướt và thực hiện nhuộm hematoxylin-eosin (HE). Mật độ tinh trùng và khả năng vận động được đo bằng phân tích tinh trùng hỗ trợ máy tính (CASA) và khả năng sống của tinh trùng được đánh giá bằng cách sử dụng bộ dụng cụ nhuộm tinh trùng sống/chết và hình thái tinh trùng được đánh giá bằng cách sử dụng nhuộm eosin, do đó xác định chất lượng tinh trùng chuột. Metabolomi CS đã được sử dụng để phân tích những thay đổi trong các chất chuyển hóa huyết thanh, làm phong phú các con đường trao đổi chất liên quan và khám phá cơ chế Che trong việc cải thiện tổn thương chức năng sinh sản ở chuột vớiHội chứng thiếu hụt thận-yang. So với nhóm bình thường, nhóm mô hình thể hiện đáng kểCác triệu chứng thiếu hụt thận-yang, giảm nồng độ T, giảm trọng lượng ướt tinh hoàn và mào tinh hoàn, và tổn thương bệnh lý đáng kể cho tinh hoàn và mào tinh hoàn. Mật độ tinh trùng, khả năng vận động và khả năng sống, với tỷ lệ bất thường của tinh trùng tăng lên. Ngược lại, chuột được điều trị bằng ChE cho thấy những cải thiện rõ rệt về các triệu chứng thiếu hụt thận-yang, phục hồi mức T, giảm tổn thương bệnh lý cho tinh hoàn và mào tinh hoàn, và cải thiện các thông số tinh trùng khác nhau. Kết quả chuyển hóa cho thấy 286 chất chuyển hóa khác biệt giữa các nhóm bình thường và mô hình (191 điều hòa và 95 điều hòa). Bảy mươi lăm chất chuyển hóa vi phân được xác định giữa các nhóm mô hình và các nhóm CHE liều thấp (21 điều hòa và 54 điều hòa). Tổng cộng có 24 chất chuyển hóa khác biệt phổ biến đã được xác định trên ba nhóm, với 22 trong số các chất chuyển hóa này thể hiện xu hướng điều tiết ngược lại giữa hai nhóm so sánh. Các chất chuyển hóa này chủ yếu liên quan đến chuyển hóa axit linoleic, chuyển hóa lipid ether và axit pantothenic và coenzyme sinh tổng hợp, cũng như các chất chuyển hóa bao gồm 13- hydroperoxylinoleic (13- hpode) Che có thể cải thiện các triệu chứng thiếu hụt thận trong yang ở chuột, giảm tổn thương cơ quan sinh sản và tăng cường chất lượng tinh trùng. Việc điều hòa chuyển hóa lipid có thể là một cơ chế tiềm năng thông qua đó Che cải thiện chức năng sinh sản ở chuột vớiThiếu thận-yang. Các hợp chất hoạt tính sinh học tiềm năng của ChE bao gồmEchinacoside, verbascoside, Salidroside, Betaine và Cistanoside A.

 

Từ khóa Cistanches Herba Extract; Thiếu thận-yang; oligasthenospermia; adenine; chuyển hóa; Chuyển hóa lipid

 

 

Khách hàng hành trìnhvề cistanche để cải thiện chức năng sinh sản

 

 

 

Hội chứng thiếu hụt kítlà một loại hội chứng thiếu sót do thiếu thận do thiếu thận, thất bại của chức năng nóng lên và thất bại của biến đổi Qi. Y học hiện đại tin rằng đó là một bệnh trao đổi chất gây ra bởi các rối loạn thần kinh bao gồm cả trục vùng dưới đồi-tuyến vùng (HPG) vùng dưới đồi (HPG). Bệnh nhân nam lâm sàng thường cho thấy các triệu chứng như giảm ham muốn, thể tích tinh dịch thấp, vận động tinh trùng thấp và đau thắt lưng. Các triệu chứng nghiêm trọng có thể dẫn đến vô sinh và dị tật bẩm sinh [1]. Làm nóng Yang thận là phương pháp điều trị cốt lõi của y học cổ truyền Trung Quốc cho vô sinh nam gây ra bởi thiếu thận của Yang [2]. Cistanche sa mạc là thân thịt khô với lá có vảy của cây cistanche sa mạc ycma của gia đình Orobanchaceae. Nó có tác dụng làm săn chắc Yang Yang và mang lại lợi ích cho bản chất và máu. Nó thường được sử dụng để điều trị thiếu hụt Yang thận, bất lực và vô sinh [3]. Theo thống kê, sa mạc Cistanche cũng là loại thuốc được sử dụng thường xuyên nhất trong các đơn thuốc làm giảm thận và tăng cường của Yang trong suốt các thời đại [4]. Các nghiên cứu dược lý hiện đại đã xác nhận rằng các chiết xuất như tổng glycoside và oligosacarit của sa mạc cistanche có thể điều chỉnh cân bằng nội môi của trục HPG và trục tuyến giáp-tuyến yên-tuyến thượng thận ở chuột bị thiếu hụt thận [5]. Chiết xuất cistanche sa mạc cũng có thể cải thiện sự hình thành tinh trùng và rối loạn chức năng tình dục ở chuột bị thiếu hụt thận [6-7]. Tuy nhiên, các cơ chế tiềm năng của các hiệu ứng trị liệu này chưa được khám phá theo chiều sâu. Chuyển hóa kết hợp động kết hợp các thay đổi chất chuyển hóa với các quá trình sinh học một cách tổng thể, cho thấy bản chất trao đổi chất của các quá trình sinh lý và bệnh tật và các cơ chế dược động học của thuốc. Đặc điểm toàn diện và năng động này phù hợp với khái niệm y học cổ truyền Trung Quốc [8]. Do đó, nghiên cứu này đã sử dụng công nghệ chuyển hóa để khám phá hiệu quả và cơ chế của chiết xuất sa mạc cistanche trên tổn thương chức năng sinh sản ở chuột bị thiếu hụt thận do adenine gây ra và để giải thích ý nghĩa khoa học hiện đại của sa mạc cistanche trong việc điều chỉnh yang.

1 vật liệu

1.1 Động vật

50 SPF Lớp 9- Chuột SD đực tuần tuổi, cân 330-340 g, được mua từ Bắc Kinh Huafukang Biotech Co., Ltd., Số giấy phép SCXK (BEIJING) Các động vật được giữ trong phòng động vật SPF của Trung tâm động vật thí nghiệm của Viện Matera Medica Trung Quốc, Học viện Khoa học Y tế Trung Quốc Trung Quốc, với ánh sáng sinh học tự nhiên, độ ẩm và nhiệt độ liên tục, và chế độ ăn uống và hoạt động miễn phí. Thí nghiệm động vật đã thông qua đánh giá đạo đức về phúc lợi động vật thực nghiệm của Viện Matera Medica Trung Quốc, Học viện Khoa học Y khoa Trung Quốc Trung Quốc (phê duyệt đạo đức số 2021B166).

 

1.2 Thuốc

Các lát cắt sa mạc Cistanche được mua từ Bắc Kinh Tongrentang (cửa hàng Chongwenmen), số hàng loạt 1806016, và được xác định bởi Zhu Jingjing, một nhà nghiên cứu tại Viện Matera Medica của Trung Quốc. Cân 500 g sa mạc Cistanche và thêm
10 lần lượng ethanol 70% để chiết xuất trào ngược trong 2,5 giờ, lọc, thêm 8 lần lượng ethanol 70% vào dư lượng và chiết xuất hồi lưu trong 2,5 giờ, lọc, kết hợp hai bộ lọc và giảm áp suất để làm khô chiết xuất thành bột. Năng suất bột khô là 47%và lưu trữ ở trạng thái khô.

1.3 thuốc thử

Echinacoside, verbascoside, salidroside, betaine, cistancheside A, tubuloside A và axit caffeic đã được mua từ Thành Đô Gelipu Biotechnology Co. Jot -11356, jot11627 và jot -10196, tương ứng; Acetonitril sắc ký, metanol cấp sắc ký và axit photphoric cấp phân tích đã được mua từ Công ty TNHH Công nghệ Đô Đế, với số lô Sigma-WXBF1922V, SIGMA-WXBF2452V; Adenine được mua từ Thượng Hải Yuanye Biotech Co., Ltd., với số lô S18009; L-Carnitine (LC) đã được mua từ Công ty TNHH Dược phẩm Thẩm Dương số 1, với số lô số 210372;
Bộ dụng cụ phát hiện độc tế bào calcein/PI đã được mua từ Công ty TNHH Công nghệ Biolab, Công ty TNHH Công ty TNHH Bắc Kinh HR0444; Bộ xét nghiệm miễn dịch miễn dịch liên kết với enzyme (T) (T) được mua từ Công ty TNHH Công nghệ sinh học Vũ Hán, Ltd., số lô E-el {3}} c; Nước amoniac được mua từ Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd., lô số 10002108; Giải pháp nhuộm Hematoxylin-eosin (HE) được mua từ Bắc Kinh Zhongshan Jinqiao Biotechnology Co., Ltd., số lô BSBA -4025.

 

2.2 Phân tích các thành phần hóa học của chiết xuất sa mạc Cistanche

2.2.1 Chuẩn bị giải pháp chứng khoán tham khảo

Cân chính xác 10,41 mg salidroside, 11,19 mg echinacoside, 10. 86 mg cistancheside A, 10,19 mg tubuloside A, 10,28 mg đạt được.

 

2.2.2 Chuẩn bị giải pháp tham chiếu hỗn hợp

Chính xác là pipet 1 ml dung dịch chứng khoán tham chiếu salidroside, 5 ml echinacoside, 2 ml cistancheside A, 100 μl tubuloside A, 350 μL verbascoside và giảm 100 μl axit caffeic vào cùng một loại bình chứa dung dịch. Cân bằng chính xác 12,24 mg betaine vào bình thể tích 10 ml, thêm 50% metanol để hòa tan và pha loãng vào nhãn hiệu, lắc tốt và thu được dung dịch tham chiếu Betaine.

2.2.3 Chuẩn bị giải pháp kiểm tra

Cân bằng chính xác 310,14 mg mẫu thử nghiệm vào bình định mức 25 ml, thêm nước để hòa tan và pha loãng vào nhãn hiệu, lắc đều và lọc.

 

2.2.4 Điều kiện sắc ký
Phương pháp phát hiện Betaine: Cột Xamide (4,6 mm × 250 mm, 5 μm); pha di động acetonitril-water (80:20); Nhiệt độ cột 30 độ; tốc độ dòng 1 ml · phút -1; Tiêm thể tích 10 μl.
Các điều kiện phát hiện thành phần khác: Kromasil 100-5- C18 Cột (4,6 mm × 250 mm, 5 m); Pha di động acetonitril (A)

và {{0}}. Dung dịch axit photphoric 1% (b); Nhiệt độ cột 30 độ; tốc độ dòng 1 ml · phút -1; Khối lượng tiêm 10 μl, rửa giải gradient (0 ~ 10 phút, 10%a; 10 ~ 20 phút, 10%~ 15%a; 20 ~ 25 phút, 15%a; 25 ~ 40 phút, 15%~ 22%a).

 

2.3 Phát hiện chỉ số

2.3.1 Các thông số động của tinh trùng tinh trùng

Khoang bụng chuột được mổ xẻ để phơi bày mào tinh hoàn bên trái của nó. Đuôi mào tinh hoàn bên trái đã nhanh chóng bị cắt và đặt trong 2 ml môi trường nuôi cấy DMEM không có màu đỏ phenol được làm nóng trước trong bồn nước 37 độ. Nó được cắt thành các mảnh bằng kéo nhãn khoa, lắc nhẹ và đặt trong bể nước 37 độ để ủ trong 10 phút để cho phép tất cả các tinh trùng bơi ra khỏi mào tinh hoàn và điều chế huyền phù tinh trùng. 10 μl huyền phù tinh trùng đã được giảm trên một slide đếm tinh trùng và kỹ thuật CASA được sử dụng để quan sát và ghi lại mật độ tinh trùng, vận tốc đường trung bình (VAP), vận tốc cong (VCL), tuyến tính (lin), lắc lư (WOB), đường thẳng (Str).

 

2.3.2 Sự vận động của tinh trùng và tốc độ biến dạng

Pipet 20 μl huyền phù tinh trùng mới được chuẩn bị vào một propidium iodide (PI) (PI) (PI) (pha loãng {2}}) và calcein-am (pha loãng 200 lần) dung dịch nhuộm hỗn hợp, ủ trong bể nước 37 độ trong 30 phút và quan sát thấy dưới kính hiển vi huỳnh quang. Đếm tổng số tinh trùng sống sót và tinh trùng chuyển tiếp trong mỗi 200 tinh trùng trong các lĩnh vực khác nhau. Tinh trùng sống: Đầu tinh trùng, cơ thể và đuôi đều là huỳnh quang màu xanh lá cây, và hoạt động của tinh trùng có thể được nhìn thấy dưới kính hiển vi. Tinh trùng chuyển tiếp: Đầu tinh trùng là huỳnh quang màu đỏ, và cơ thể rõ ràng là huỳnh quang màu xanh lá cây. Tại thời điểm này, tinh trùng đang trong thời kỳ chuyển tiếp của cái chết. Tinh trùng chết: Chỉ có đầu tinh trùng là huỳnh quang màu đỏ và toàn bộ cơ thể không có huỳnh quang màu xanh lá cây.
Lấy 100 μL huyền phù tinh trùng và đặt nó vào bể nước 60 độ để bất hoạt trong 10 phút, sau đó vẽ 5 μl và thả nó lên slide, trải đều và làm khô nó, cố định bằng methanol, nhuộm nó bằng thuốc nhuộm eosin, rửa sạch với nước chảy, để nó đứng. Đếm số lượng tinh trùng bất thường trong mỗi 200 tinh trùng trong các trường khác nhau dưới kính hiển vi và tính tỷ lệ.

 

2.3.3 Nhuộm bệnh lý của mào tinh hoàn và tinh hoàn

Sau khi cố định trong 4% paraformaldehyd ở nhiệt độ phòng trong 48 giờ, các mô tinh hoàn và tinh hoàn được đặt trong các hộp nhúng, mất nước bằng ethanol được phân loại, được nhúng trong parafin và cắt lát. Sau khi sương và hydrat hóa, anh ta nhuộm màu đã được thực hiện, và những thay đổi bệnh lý của tinh hoàn và các mô mào tinh hoàn đã được quan sát dưới kính hiển vi quang học để xác định mức độ tổn thương trong cấu trúc của ống tinh hoàn, tổn thương trong mật độ biểu tinh và mật độ tinh trùng.

 

2.3.4 Nội dung T Serum T

Sau khi thu thập máu quỹ đạo, nó được để lại ở nhiệt độ phòng trong 2,5 giờ, được ly tâm tại 3 000 r · min -1 trong 20 phút, và chất nổi trên bề mặt được thực hiện để phát hiện mức t huyết thanh theo hướng dẫn của bộ T.

 

2.4 Phân tích chuyển hóa

2.4.1 Chuẩn bị mẫu huyết thanh

Vào ngày lấy mẫu, những con chuột được gây mê và máu toàn phần được thu thập qua động mạch chủ bụng. Máu được giữ ở nhiệt độ phòng trong 2,5 giờ và ly tâm tại 3 000 r · min -1 cho 2 0 phút. Chất nổi trên bề mặt được chia thành các ống ly tâm 2 ml với các số tương ứng và được lưu trữ ở mức -80. Thaw ở 4 độ trước khi thử nghiệm, xoáy trộn các mẫu, chuyển chính xác 5 0 μl các mẫu huyết thanh thành các ống EP 0,5 ml, thêm 300 μl 20% acetonitril Supernatant và đặt nó vào một ống EP 0,5 ml sạch khác, để nó đứng ở mức -20 trong 30 phút, sau đó ly tâm ở 4 độ, 12 000 r · min -1 trong 3 phút, lấy 180 μl siêu chất để tiêm.

 

2.4.2 Điều kiện sắc ký

Waters Acreper UPLC HSS T3 C18 Cột (2,1 mm × 1 0 0 mm, 1,8 m). Các pha di động là 0. 1% axit formic trong nước (a) và 0,1% dung dịch axit formic-acetonitril (b), với độ rửa giải trí (0-11 min, 5% -90% b; 12. 1-14 phút, 5% b). Nhiệt độ cột là 40 độ và tốc độ dòng chảy là 0,40 ml · phút -1.

 

2.4.3 Điều kiện phổ khối

Nguồn ion electrospray được quét ở các chế độ ion dương và âm. Khí phun là 50 psi (1 psi≈6,895 kPa), khí nóng phụ là 60 psi, khí rèm là 35 psi và nhiệt độ nguồn ion là 550 độ. Ở chế độ ion dương, điện áp ion hóa là 5 500} v, chế độ độ nhạy cao được áp dụng, điện áp giảm là 60 v và năng lượng va chạm là 30 V. ở chế độ ion âm, điện áp ion hóa Chế độ quét độ nhạy của dữ liệu bán định lượng đã được thông qua.

 

2.4.4 Xử lý và phân tích dữ liệu

Dữ liệu thô của phát hiện LC-MS đã được chuyển đổi thành định dạng MZML bằng phần mềm Proteowizard và gói phần mềm XCMS được sử dụng để điều chỉnh thời gian khai thác, căn chỉnh và lưu giữ đỉnh cao. Phân tích hồi quy vector hỗ trợ (SVR) đã được sử dụng để điều chỉnh diện tích cực đại và các đỉnh có tốc độ bị thiếu vượt quá 5 0% được lọc. Các đỉnh sau khi sàng lọc được tích hợp vào Thư viện công cộng, cơ sở dữ liệu được xây dựng bởi Công ty TNHH Công nghệ sinh học Vũ Hiêu, và Thuật toán MetDNA để xác định thông tin cấu trúc của các chất chuyển hóa. Sau đó, gói R đã được sử dụng để thực hiện phân tích thống kê đơn biến và phân tích thống kê đa biến bằng phương pháp kiểm tra t của học sinh và phân tích phân biệt bình phương nhỏ nhất trực giao (OPLS-DA), tương ứng. Các điều kiện sàng lọc chất chuyển hóa vi phân được đặt thành tầm quan trọng khác nhau trong phép chiếu (VIP)> 1, thử nghiệm hai mặt p <0. ID CPD _ thu được đã được nhập vào trang web Metabo Analys 6.0
(https://www.metaboanalyst.ca/) để phân tích làm giàu. P của xét nghiệm siêu âm đã được sử dụng để xác định các con đường chính với sự làm giàu đáng kể.

 

2.5 Phân tích thống kê

𝑥̅ ± S được biểu thị dưới dạng trung bình ± độ lệch chuẩn (𝑥̅ ± S) và phân tích phương sai một chiều được sử dụng để so sánh dữ liệu giữa nhiều nhóm. P<0.05 was considered statistically significant.