Ergosta-7,9(11),22-trien-3 -ol Giải cứu sự thiếu hụt AD bằng cách điều chỉnh kích hoạt microglia nhưng không phải ứng suất oxy hóa

trừu tượng: Ergosta-7,9(11),22-trien-3 -ol (EK100) được phân lập từ loại nấm dược liệu đặc trưng của Đài Loan Antrodia camphorate, được biết đến với công dụng tăng cường sức khỏe và chống lại tác dụng lão hóa trong y học dân gian. Bệnh Alzheimer (AD) là một căn bệnh lớn liên quan đến lão hóa. Chúng tôi đã nghiên cứu hiệu quả và cơ chế tiềm năng của ergosta-7,9(11),22-trien-3 -ol đối với các triệu chứng AD. Drosophila với sự biểu hiện quá mức tế bào thần kinh của amyloid- ( A ) ở người đã được sử dụng làm mô hình AD. Chúng tôi đã so sánh tuổi thọ, chức năng vận động, học tập, trí nhớ, stress oxy hóa và dấu ấn sinh học của quá trình kích hoạt tiểu thần kinh đệm và tình trạng viêm của ergosta-7,9(11),22-trien-3 -ol- nhóm được xử lý so với nhóm đối chứng không được xử lý. Ergosta-7,9(11), phương pháp xử lý 22-trien-3 -ol đã cải thiện hiệu quả tuổi thọ, chức năng vận động, khả năng học tập và trí nhớ của mô hình AD so với mẫu đối chứng không được xử lý. Các dấu hiệu sinh học của hoạt hóa microglia và viêm đã giảm, trong khi quá trình peroxy hóa lipid phổ biến, hoạt tính catalase và hoạt tính superoxide dismutase vẫn không thay đổi. Tóm lại, ergosta-7,9(11),22-trien-3 -ol giải quyết tình trạng thiếu hụt AD bằng cách điều chỉnh quá trình kích hoạt tiểu thần kinh đệm chứ không phải ứng suất oxy hóa.

Glycoside của cistanche cũng có thể làm tăng hoạt động của SOD trong các mô tim và gan, đồng thời làm giảm đáng kể hàm lượng lipofuscin và MDA trong mỗi mô, loại bỏ hiệu quả các gốc oxy phản ứng khác nhau (OH-, H₂O₂, v.v.) và bảo vệ chống lại tổn thương DNA gây ra bởi gốc OH. Cistanche phenylethanoid glycoside có khả năng loại bỏ gốc tự do mạnh mẽ, khả năng khử cao hơn vitamin C, cải thiện hoạt động của SOD trong huyền phù tinh trùng, giảm hàm lượng MDA và có tác dụng bảo vệ nhất định đối với chức năng màng tinh trùng. Cistanche polysacarit có thể tăng cường hoạt động của SOD và GSH-Px trong hồng cầu và mô phổi của chuột lão hóa thực nghiệm do D-galactose gây ra, cũng như làm giảm hàm lượng MDA và collagen trong phổi và huyết tương, đồng thời tăng hàm lượng elastin, có tác dụng nhặt rác tốt đối với DPPH, kéo dài thời gian thiếu oxy ở chuột già, cải thiện hoạt động của SOD trong huyết thanh và làm chậm quá trình thoái hóa sinh lý của phổi ở chuột già thực nghiệm. Với sự thoái hóa hình thái tế bào, các thí nghiệm đã chỉ ra rằng Cistanche có khả năng chống oxy hóa tốt và có tiềm năng trở thành dược phẩm ngăn ngừa và điều trị các bệnh lão hóa da. Đồng thời, echinacoside trong Cistanche có khả năng đáng kể trong việc loại bỏ các gốc tự do DPPH và có khả năng loại bỏ các loại oxy phản ứng và ngăn chặn sự thoái hóa collagen do gốc tự do gây ra, đồng thời cũng có tác dụng sửa chữa tốt đối với tổn thương anion gốc tự do của thymine.

Nhấp vào Lợi ích của viên nén Cistanche

【Để biết thêm thông tin:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】

từ khóa: Bệnh Alzheimer; ruồi giấm; EK100; ergosta-7,9(11),22-đã thử-3 -ol

1. Giới thiệu

Antrodia camphorata là một loại nấm dược liệu độc đáo của Đài Loan và là cây trồng kinh tế quan trọng đối với ngoại thương của Đài Loan trong thế kỷ 19 [1]. Cuốn sách lịch sử đầu tiên của Đài Loan, Tâi-uân Thong-sú (nghĩa đen là Lịch sử chung của Đài Loan), đã ghi lại những công dụng y học bản địa của Antrodia camphorate, bao gồm loại bỏ mầm bệnh, "cải thiện sức khỏe", "tiếp thêm sinh lực cho máu", "giải độc rượu", " bảo vệ gan" và "chống lão hóa" [2–4]. Vì chúng ta phải đối mặt với thách thức sức khỏe dân số toàn cầu do lão hóa [5], nghiên cứu khoa học về y học bản địa để khai thác kiến ​​thức chống lão hóa là rất quan trọng.

Trong số các bệnh chính liên quan đến lão hóa, chẳng hạn như thoái hóa điểm vàng, xơ vữa động mạch, ung thư và đột quỵ, bệnh Alzheimer (AD) là một vấn đề khó giải quyết do cơ chế bệnh lý khó nắm bắt của nó. Phương pháp điều trị bệnh AD hiệu quả vẫn chưa có [6]. Các giả thuyết bệnh lý hiện tại về AD bao gồm nhưng không giới hạn ở, giảm choline acetyltransferase, độc tính kích thích glutamate, tập hợp amyloid beta (A), phosphoryl hóa tau, kháng insulin não [7] và thay đổi hệ vi sinh vật đường ruột [8]. Tuy nhiên, bất kể loại nguyên nhân khởi phát AD nào có liên quan, stress oxy hóa và kích hoạt microglia gây viêm là những dấu hiệu phổ biến đi kèm với sự thoái hóa thần kinh của AD [9,10]. Thật thú vị, viêm thần kinh và stress oxy hóa là những sự kiện có liên quan đến nhau được quan sát thấy ở AD và được đưa ra giả thuyết trong bệnh lý AD. Một mặt, các mảng lão hóa của sự lắng đọng A gây ra các phản ứng viêm, kích hoạt microglia, giải phóng cytokine và tế bào hình sao, dẫn đến những hậu quả không mong muốn như tổn thương tế bào thần kinh tiến triển và cuối cùng là rối loạn chức năng nhận thức. Việc kích hoạt các phản ứng miễn dịch ban đầu có thể chống lại mầm bệnh xâm nhập bằng A hoặc loại bỏ lượng A dư thừa; tuy nhiên, quá trình này chắc chắn tạo ra các loại oxy phản ứng (ROS), có thể gây tổn thương tế bào thần kinh trong môi trường vi mô. Mặt khác, A có thể gây ra ROS theo cách không bị viêm nhiễm. Ví dụ, A đã được tìm thấy trong màng ty thể của AD sau khi chết và có thể xâm nhập vào ty thể, gây ra sự gián đoạn chuỗi vận chuyển điện tử (ETC) và dẫn đến việc tạo ra ROS. Ngược lại, ROS tăng cao có thể kích hoạt giải phóng cytokine và bắt đầu quá trình viêm [7,9,10]. Do đó, các phân tử chống oxy hóa và chống viêm có thể là phương pháp điều trị tiềm năng cho AD.

Antrodia camphorate, đặc biệt là một trong số các hợp chất được cô lập trong nước dùng nguyên vẹn ergosta-7,9(11),22-trien-3 -ol (còn được gọi là EK100), thể hiện khả năng chống oxy hóa và chống -các hoạt động viêm nhiễm [11–13]. Hơn nữa, Chang et al. [14] đã chỉ ra rằng antroquinonol, một hợp chất khác được phân lập từ sợi nấm lên men của Antrodia camphorate, giúp cải thiện khả năng học tập và trí nhớ trong mô hình chuột AD với chứng astrogliosis và stress oxy hóa thấp hơn. Tuy nhiên, không thể xác nhận mối quan hệ nhân quả giữa giảm astrogliosis và stress oxy hóa khi điều trị bằng antroquinonol và việc giảm stress oxy hóa đã được coi là yếu tố trung gian [14]. Độ an toàn của EK100 đã được thử nghiệm trước đây theo Hướng dẫn 407 của Tổ chức Hợp tác và Phát triển Kinh tế (OECD) trên mô hình chuột ở liều 10 và 20 mg/kg-ngày [15]. Do đó, chúng tôi đã áp dụng nồng độ cho ăn tự do tương đương với ruồi giấm trong nghiên cứu này.

Mô hình ruồi giấm (Drosophila melanogaster) biểu hiện quá mức A 42 là một mô hình động vật AD được thiết lập tốt [16], với các triệu chứng AD đặc trưng bao gồm giảm tuổi thọ, thiếu hụt khả năng học tập và vận động [17], stress oxy hóa [18] và kích hoạt vi thần kinh đệm. [19]. Các thách thức về mô hình hóa AD ở Drosophila melanogaster bao gồm không có hoạt động BACE ở Drosophila và sự khác biệt về giới tính, cho thấy các triệu chứng nghiêm trọng hơn ở các tệp nam. Những điều này không được quan sát thấy ở người sau Công nguyên [20]. Do đó, chúng tôi đã sử dụng ruồi biểu hiện peptide A 42 của con người để làm mẫu AD, trong đó việc sản xuất A 42 không yêu cầu hoạt động BACE. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã kiểm tra xem liệu EK100 có cải thiện các triệu chứng của AD hay không và quan trọng hơn là liệu cả hai điều chỉnh của stress oxy hóa và chứng loạn thần kinh đệm sao có cần thiết để cải thiện AD hay không.

2. Kết quả

2.1. Ergosta-7,9(11),22-trien-3 -ol Đã giải cứu sự sống sót và leo trèo của AD Drosophila

Chẩn đoán AD có liên quan đến việc giảm tuổi thọ trung bình [21] và gần một nửa số bệnh nhân AD bị rối loạn hoạt động [22]. Do đó, chúng tôi đã kiểm tra xem chiết xuất Antrodia camphorata ergosta-7,9(11),22-trien-3 -ol (EK100) có cải thiện khả năng sống sót và khả năng leo trèo của Mô hình AD Drosophila. Chúng tôi nhận thấy rằng việc điều trị bằng 125 hoặc 250 µg/mL ergosta-7,9(11),22-trien-3 -ol đã cải thiện đáng kể khả năng sống sót của AD Drosophila (p < 0,01) (Hình 1A và Bảng bổ trợ S1), nhưng chỉ với liều lượng cao (250 µg/mL) đã cải thiện khả năng leo của AD Drosophila (Hình 1B). Vì sự suy giảm khả năng sống sót và khả năng vận động là các triệu chứng lâm sàng của AD, nên nồng độ 250 µg/mL giúp cải thiện cả hai triệu chứng này đã được sử dụng trong các cuộc điều tra sau đây.

2.2. Ergosta-7,9(11),22-trien-3 -ol Rescued Learning and One Hour Memory of AD Drosophila

Tiếp theo, chúng tôi đã kiểm tra xem liệu phương pháp điều trị ergosta{{0}},9(11),22-trien-3 -ol có cải thiện các khiếm khuyết về học tập và trí nhớ, một triệu chứng đặc trưng của AD hay không. Ruồi AD được xử lý bằng ergosta- 7,9(11),22-trien-3 -ol ở nồng độ 250 ug/mL trong 14 ngày và chịu các bài kiểm tra khả năng học tập và trí nhớ với T-mê cung. Như được hiển thị trong Hình 2A, so với điều khiển kiểu đại diện (AD(-)/EK(-)), khả năng học của điều khiển AD (AD( plus )/EK(-)) giảm đáng kể (p < 0,01), trong khi ergosta-7,9(11),22-trien-3 -ol cải thiện đáng kể khả năng học tập của AD (p < 0,05). Hơn nữa, ergosta-7,9(11), phương pháp điều trị 22-trien-3 -ol cũng cải thiện trí nhớ một giờ về AD đã bị suy giảm (Hình 2B).

2.3. Ergosta-7,9(11),22-đã thử-3 -ol Kích hoạt vi mô thần kinh đệm được điều biến trong AD Drosophila

Tiếp theo, chúng tôi đã kiểm tra xem liệu phương pháp xử lý ergosta-7,9(11),22-trien-3 -ol có làm giảm kích hoạt vi thần kinh đệm trong AD hay không. Trong AD, microglia được kích hoạt đi kèm với quá trình thực bào và thoái hóa thần kinh [23]. Ở Drosophila, dấu hiệu nhấn chìm tế bào vi thần kinh đệm, và do đó là dấu hiệu kích hoạt vi thần kinh đệm, là biểu hiện của lớp vải (Drpr) và CED xuôi dòng [24]. Sau khi xử lý bằng ergosta-7,9(11),22-trien-3 -ol, ruồi AD bị loại bỏ và RNA được chiết xuất từ ​​đầu ruồi cho RT-qPCR. Như được hiển thị trong Hình 3A, cả Drpr đều được điều chỉnh giảm đáng kể ở ergosta-7,9(11),22-trien-3 -AD Drosophila được xử lý bằng ol so với AD không được xử lý. Điều này ngụ ý rằng ergosta-7,9(11),22-trien-3 -ol đã giảm kích hoạt vi thần kinh đệm ở AD Drosophila. Hơn nữa, ergosta-7,9(11), phương pháp điều trị 22-trien-3 -ol cũng làm giảm viêm hệ thần kinh trung ương, như được tiết lộ trong quá trình điều chỉnh giảm các gen liên quan đến viêm (Hình 3B) .

2.4. Ergosta-7,9(11),22-đã thử-3 -ol Không điều chỉnh ứng suất oxy hóa phổ biến trong AD Drosophila

Tiếp theo, chúng tôi đã kiểm tra xem liệu sự điều biến của stress oxy hóa phổ biến—tức là toàn bộ cơ thể—có cần thiết cho ergosta-7,9(11),22-trien-3 -ol để giải cứu AD hay không. Ergosta-7,9(11),22-đã thử- 3 -xử lý ol không làm thay đổi quá trình peroxy hóa lipid (Hình 4A), hoạt tính catalase (Hình 4B), hoạt tính superoxide dismutase (Hình 4C) , hoặc sự biểu hiện của các gen liên quan đến stress oxy hóa (Hình

3. Thảo luận

Nghiên cứu này báo cáo về hiệu quả và cơ chế tiềm ẩn có thể có của ergosta-7,9(11),22-try-3 -ol, một chiết xuất từ ​​Antrodia camphorate, để điều chỉnh triệu chứng của AD bằng Drosophila mô hình với biểu hiện quá mức của con người-A. Ergosta-7,9(11),22-trien-3 -ol đã cải thiện hiệu quả khả năng học tập và trí nhớ, đồng thời kéo dài tuổi thọ của bệnh nhân mắc AD. Ngoài ra, các dấu hiệu sinh học của quá trình kích hoạt microglia và viêm đã giảm, trong khi stress oxy hóa phổ biến không thay đổi.

Có nhiều nguồn gây ra stress oxy hóa trong AD, bao gồm nhưng không giới hạn ở việc kích hoạt khả năng miễn dịch bẩm sinh—ví dụ, sự tích tụ A, sự phá vỡ ty thể bởi A , tau tăng phospho hóa và chuyển hóa kim loại kém cũng là những nguồn [25]. Mặc dù chứng viêm và căng thẳng oxy hóa có thể gây ra lẫn nhau, nhưng chúng ta có thể cho rằng những thay đổi đồng bộ của chúng chỉ xảy ra trong những trường hợp mà các nguồn căng thẳng oxy hóa khác không đổi. Tuy nhiên, đây không phải là trường hợp trong nghiên cứu này. Đồng thời, việc giảm khả năng miễn dịch bẩm sinh, đặc biệt là kích hoạt microglia, làm suy giảm sự đóng góp của nó vào việc giải phóng A , điều này có thể dẫn đến tích lũy A. Thú vị thay, bản thân sự tích lũy A lại kích hoạt quá trình tạo ra stress oxy hóa theo nhiều cách. Do đó, việc giảm kích hoạt vi mô và phản ứng viêm của EK1000 phần nào có thể bảo vệ tế bào thần kinh khỏi các cuộc tấn công miễn dịch ngoài mục tiêu nhưng sẽ phải trả giá bằng sự suy giảm độ thanh thải A. Do đó, kết quả của nghiên cứu này có thể phản ánh hạn chế của chiến lược nhắm mục tiêu microglia, ít nhất là trong mô hình AD Drosophila.

Hệ thống miễn dịch bẩm sinh qua trung gian microglia được mô tả là con dao hai lưỡi trong các bệnh thoái hóa thần kinh, đặc biệt là AD [26,27]. Microglia được kích hoạt cố gắng loại bỏ mầm bệnh độc hại như A , nhưng chắc chắn gây ra tổn thương tế bào thần kinh trong môi trường vi mô. Tính ưu việt của 250 µg/mL EK100 trong vòng 35 ngày có thể ngụ ý rằng chiến lược giảm kích hoạt vi tế bào thần kinh đệm bị giới hạn ở giai đoạn bệnh lý, ít nhất là trong trường hợp mô hình AD của ruồi giấm. Hơn nữa, việc giảm đáng kể các dấu ấn sinh học để kích hoạt vi mô và phản ứng viêm đã không thể chuyển thành sự cải thiện đáng kể tương tự về khả năng sống sót và chức năng CNS có thể được giải thích một phần bằng tính năng con dao hai lưỡi của microglia. Điều này ngụ ý rằng kích hoạt microglia không phải là yếu tố duy nhất và cũng không phải là yếu tố chi phối tiến trình AD. Kích hoạt vi mô thần kinh đệm thấp hơn cũng ngụ ý rằng sự xuống cấp của A được biểu hiện quá mức đã bị tắt một phần trong mô hình ruồi giấm, điều này cũng có thể giải thích tỷ lệ tử vong cao hơn đối với nồng độ EK100 cao hơn trong độ tuổi từ 35 đến 52 ngày.

Antroquinonol, một chiết xuất khác từ Antrodia camphorate, đã được báo cáo về hiệu quả của nó trong điều trị chuột AD, trong đó việc giảm căng thẳng oxy hóa đã được coi là yếu tố trung gian [14]. Do đó, điều này có thể ngụ ý rằng antroquinonol và ergosta-7,9(11),22-trien-3 -ol cải thiện các triệu chứng AD thông qua các con đường độc lập, làm trung gian cho stress oxy hóa hoặc không, tương ứng. Do đó, sẽ rất thú vị nếu kiểm tra xem liệu việc điều trị đồng thời với antroquinonol và ergosta-7,9(11),22-trien-3 -ol có tác dụng hiệp đồng trong việc cải thiện AD hay không.

Đối với giai đoạn đầu của AD, trọng tâm chính của thiết kế thuốc là loại bỏ sự lắng đọng A, (chẳng hạn như trong kháng thể đơn dòng aducanumab được phê duyệt gần đây [28], bất chấp những tranh cãi về lợi ích lâm sàng tối thiểu và tính không hiệu quả của một trong hai thử nghiệm lâm sàng giai đoạn III [29]), hoặc cố gắng tăng sự hấp thu vi mô của A [30–32]. Tuy nhiên, đối với các giai đoạn AD vừa phải hoặc nặng, việc kích hoạt quá mức microglia ngược lại làm trầm trọng thêm tình trạng thoái hóa thần kinh [33], và do đó cần có các chiến lược điều trị thay thế.

4. Vật liệu và phương pháp

4.1. Fly Stock Bảo dưỡng và Đo tuổi thọ

Chủng A Drosophila chuyển gen H29.3/CyO thu được từ [16] và được lai xa với w(CS10) trong sáu thế hệ. Dòng elav-GAL4c155 của trình điều khiển nơ-ron thần kinh được lai xa với w(CS10) trong sáu thế hệ. Dòng mắt trắng w1118 (Bloomington Drosophila Stock Center #3605) lai xa với dòng Canton S (Bloomington Drosophila Stock Center #64349) 10 lần (w (CS10)) được sử dụng làm giống tiêu chuẩn. Dòng elav-GAL4c155 của trình điều khiển thần kinh pan được lấy từ Trung tâm Chứng khoán Bloomington Drosophila (#458). Kiểu gen của ruồi thí nghiệm—tức là mô hình AD—là [elav; H29.3/ plus ], được chọn từ thế hệ con F1 không có dấu hiệu CyO. Ruồi được duy trì trong môi trường tiêu chuẩn bột ngô ở 25 ◦C trong chu kỳ sáng tối 12 giờ. Đối với T-mê cung, [elav; Ruồi H29.3/ plus ] được thu thập (cả hai giới lẫn lộn và không còn trinh) và nuôi cấy có hoặc không xử lý EK100 cho đến d14 sau khi xuất hiện. Để sống sót, leo trèo và RT-qPCR, chỉ những con ruồi đực được sử dụng. Các mẫu RNA được thu thập ở d30 sau khi xuất hiện khi cả tuổi thọ và đường cong leo trèo đều cho thấy sự tách biệt đáng kể so với mô hình AD chưa được xử lý.

Trong một phân tích về tuổi thọ, 20 đến 30 con ruồi được nuôi trong lọ thức ăn có hoặc không có CS; ít nhất bốn lọ đã được chuẩn bị cho mỗi lần điều trị. Các lọ thức ăn được thay 2 đến 3 ngày một lần và số ruồi chết được đếm vào thời điểm đó. Ít nhất ba lần lặp lại đã được tiến hành cho mỗi thử nghiệm. Tỷ lệ sống sót được định nghĩa là số ruồi còn sống chia cho tổng số ruồi khi bắt đầu thử nghiệm.

4.2. Ergosta-7,9(11),22-trien-3 -ol (Ek100)

Ergosta-7,9(11),22-trien-3 -ol được chiết xuất từ ​​loại quà tặng từ Antrodia camphorata, như đã mô tả trước đây [34]. Ergosta-7,9(11),22-trien-3 -ol tạo thành bột màu vàng nhạt ở nhiệt độ phòng. Dung dịch gốc được chuẩn bị ở nồng độ 6,25 mg/mL trong EtOH ngay trước khi sử dụng. Đối với các thử nghiệm về tuổi thọ và chống trục địa lý, nồng độ cuối cùng là 125 và 250 µg/mL. Đối với các thử nghiệm về trí nhớ học tập và biểu hiện gen, nồng độ cuối cùng là 250 µg/mL. Trọng lượng phân tử của EK100 là 396,65. Vậy nồng độ mol tương ứng lần lượt là 315 hoặc 630 µM. Ruồi được xử lý bằng hai liều EK100 với nồng độ cuối cùng là 125 và 250 µg/mL được trộn trong thức ăn bằng cách cho ăn Ad libitum. Thực phẩm đối chứng chứa cùng một lượng dung môi EtOH như các nhóm thử nghiệm với nồng độ EtOH cuối cùng là 3 phần trăm v/v. Việc xử lý bắt đầu từ khi xuất hiện cho đến thời điểm thu thập dữ liệu của mỗi xét nghiệm. Đối với thử nghiệm sinh tồn và leo trèo, việc điều trị được thực hiện trong suốt vòng đời. Số lượng ruồi cho mỗi lần sao chép được mô tả trong phần phương pháp của mỗi xét nghiệm. Chúng tôi cũng đã thử nghiệm các thử nghiệm về tuổi thọ với ruồi hoang dã được xử lý/không được xử lý để đảm bảo an toàn cho ergosta-7,9(11),22-trien-3 -ol trong các mô hình ruồi (Hình bổ sung S1 ).

4.3. Xét nghiệm chống độc

Giao thức hiện tại dựa trên phương pháp đã xuất bản trước đó [35], với một số sửa đổi. Tóm lại, một lọ nhựa hình trụ trong suốt có đường kính 2,5 cm và cao 9,5 cm (dài hơn cũng được nhưng sẽ khó xử lý hơn) được sử dụng làm thiết bị geotaxis. Đáy lọ được phủ một lớp thức ăn cho ruồi để làm đệm. Một dấu 5 cm phía trên đệm được gắn vào bề mặt ngoài của lọ. Đầu kia của lọ đã mở và ruồi được nạp vào từ đó. Vì thử nghiệm được tiến hành đồng thời với thử nghiệm sinh tồn, nên số lượng ruồi được nạp giống hệt với số còn sống tại thời điểm đó. Những con ruồi đã được nạp vào lọ; phần trên được bịt kín bằng nắp và phần dưới của lọ bị đập liên tục (trong hai giây) vào bề mặt cứng mà nó đang đứng (trong trường hợp này là băng ghế trong phòng thí nghiệm). Tiếng gõ đủ mạnh để làm lũ ruồi giật mình và khiến chúng bò dọc theo thành lọ, nhưng không đủ mạnh để gây tổn hại về thể chất cho chúng. Toàn bộ quá trình được quay video trong 18 giây, với số lượng ruồi leo trên mốc 5 cm được ghi nhận và biểu thị bằng phần trăm cho mỗi nhóm. Số lượng ruồi leo qua mốc 5 cm đã được đếm. Bốn lần lặp lại đã được tiến hành cho mỗi nhóm. Tỷ lệ phần trăm khả năng leo trèo được định nghĩa là số lượng ruồi leo lên chia cho tổng số ruồi khi bắt đầu thử nghiệm. Khả năng leo trèo cũng đã được thử nghiệm ở ruồi hoang dã được xử lý/không được xử lý để đảm bảo an toàn cho ergosta-7, 9 (11), 22-trien-3 -ol trong các mô hình ruồi (Hình bổ sung S2) .

4.4. Nền tảng bộ nhớ và học tập Drosophila (T-Maze)

Để quan sát quá trình học tập và trí nhớ của Drosophila, khoảng 100 con ruồi đầu tiên được đặt trong buồng cốc phía trên, có thể được cung cấp điện áp và gây sốc điện cho ruồi. Ruồi được phân phối đầu tiên bằng mùi 1 (MCH) cùng với sóng xung kích điện. Sau đó ruồi được truyền mùi 2 (OCT) không có sóng điện giật. Sau khi huấn luyện, những con ruồi được chuyển đến không gian bên dưới, trong đó hai mặt thoáng được cung cấp mùi 1 hoặc mùi 2 tương ứng. Bằng cách quan sát hướng di chuyển của ruồi, có thể ước tính độ lệch của mùi 2 so với mùi 1 bằng Chỉ số hiệu suất (PI), được định nghĩa là sự khác biệt về số lượng ruồi giữa hai mùi chia cho tổng số ruồi. Chỉ số Hiệu suất thể hiện khả năng học tập và trí nhớ của Drosophila [36]. Một nhóm ruồi khác được tạo điều kiện với các cặp mùi đảo ngược sao cho mỗi mùi được dùng một lần như một cú sốc điện cộng và một lần như một cú sốc điện -. PI của hai thử nghiệm này được tính trung bình là PI cuối cùng của một lần lặp lại. "Bộ nhớ 1 giờ" đã được kiểm tra sau khoảng cách 1 giờ đối với khóa đào tạo, trong khi "việc học" thì ngược lại, được kiểm tra sau khoảng cách 1,5 phút đối với khóa đào tạo. Chúng tôi cũng đã thử nghiệm việc tránh MCH và OCT của ruồi AD có hoặc không có xử lý EK100 để đảm bảo rằng việc xử lý không gây ra sai lệch đối với mùi khó chịu (Hình bổ sung S3).

4.5. PCR định lượng

Đầu và thân được tách ra trước khi chiết RNA. Đối với một lần lặp lại, ruồi được gây mê bằng CO2; được thu thập, 100 lần một lần, trong các ống Eppendorf; và sau đó ngâm trong nitơ lỏng trong 1 phút để làm cho cơ thể giòn. Các xác chết đông lạnh thu được sau đó được chất lên các chồng sàng sàng lắc (Bunsekifurui, số 40 và số 25) và khuấy trộn. Các thi thể bị vỡ ra và được sắp xếp theo kích thước của các mắt lưới sàng thành hai phần riêng biệt: "phần đầu" và "cơ thể". Tổng số RNA được chiết xuất bằng bộ RNeasy Mini (Qiagen, Düsseldorf, Đức), sau đó được sử dụng để tổng hợp cDNA bằng Bộ tổng hợp cDNA VersoTM (Thermo Science, Waltham, MA, USA). Mức độ biểu hiện RNA của các gen được nghiên cứu đã được định lượng bằng PCR thời gian thực (Ứng dụng Biosystems 7700, Thermo Science, Waltham, MA, USA) với Maxima SYBR Green qPCR Master Mix (Thermo Science, Waltham, MA, USA). Các kết quả đã được chuẩn hóa thành lượng Gapdh hoặc Rpl32 tương đối. Các mồi được sử dụng được liệt kê dưới đây. Gapdh: 50 -GAAAAAGCGGCAGTCGTAAT-30 và 50 -AATTCCGATCTTCGACATGG-30 ; Drpr: 50 -TGTGATCATGGTTACGGAGGAC-30 và 50 -CAGCCGGGTGGGCAA-30 ; CED: 50 - CGTTTACAAGGAGCGACT-30 và 50 -TTCCCAGATTGAAGAGCAGG-30 ; Mèo: 50 -TGACT ACAAAAACTCCCAAACG-30 và 50 -TTGATTCCAAATGGGTGCTC-30 ; PHGPx: 50 -TGACA TCGGCGAGGGT-30 và 50 -CGGTCTGCTTGGCCTTTA-30 ; Cnc: 50 -GCCAACTATGTGG TGGAGT-30 và 50 -ACGCTGCGATTCAGACG-30 ; SOD1: 50 -GTCGACGAGAATCGTCAC CT-30 và 50 -GGAGTCGGTGATGTTGACCT-30 ; SOD2: 50 -AAATTTCGCAAACTGCAAGG- 3 0 và 50 -GGTCGCCATTTGTTGCTATT-30 ; SOD3: 50 -TCAGCATGGGTGCTCACTAT-30 và 50 -TAATGCCCGTGGAGTTGG-30 ; mkk3: 50 -CCGCTACCCATACGACAAT-30 và 5 0 -GAATTCCGGCGAAAATGT-30 ; mekk1: 50 -TTTAACGGCAGTGGAACTGT-30 và 50 - TGCATCTGCAACTGCTCAC-30 ; imd: 50 -AGATCGACCAGGCCATAATC-30 và 50 -AATCC ACTGGAGCAACAGC-30 ; rac1: 50 -CCGTGTTCGACAACTACTCG-30 và 50 -AGTCGGTCG TAGTCCTCCTG-30 ; thưởng thức: 50 -GCCATACTCCCTTGGAATTG-30 và 50 -TCTCCCTTCTCCG GATACAC-30 ; Rpl32: 50 -CGGATCGATATGCTAAAGCTGT-30 và 50 -CGACGCACTCTGTTG TCG-3.

4.6. Xét nghiệm căng thẳng oxy hóa

Ba lần lặp lại quá trình peroxy hóa lipid, hoạt tính catalase và hoạt tính superoxide dismutase được đo bằng BIOXYTECH LPO-586 (OxisResearch, OXIS International, Beverly Hills, CA, USA), Bộ xét nghiệm Catalase (Cayman Chemical, Ann Arbor, MI) , USA) và Superoxide Dismutase Assay Kit (Cayman), tương ứng, theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Tóm lại, hoạt tính SOD được đánh giá bằng cách đo sự phân hủy của các gốc superoxide được tạo ra bởi xanthine oxidase do bộ kit cung cấp và được phát hiện bằng cách biến đổi muối tetrazolium thành thuốc nhuộm formazan, sau đó được định lượng bằng độ hấp thụ ở 440–460 nm. Hoạt tính của CAT được đánh giá bằng cách đo sự hình thành formaldehyde từ metanol với sự có mặt của H2O2 được xúc tác bởi CAT, được phát hiện bởi chất tạo màu 4-amino-3- hydrazino-5-mercapto-1 do bộ cung cấp ,2,4-triazole, sau đó được định lượng bằng độ hấp thụ ở bước sóng 540 nm. Hoạt tính peroxid hóa lipid được đánh giá bằng cách đo sự phân hủy của peroxit axit béo không bão hòa đa thành malonaldehyde (MDA) và 4-hydroxyalkenal, được phát hiện bởi N-methyl{17}}phenylindole tạo màu được cung cấp trong bộ dụng cụ, sau đó được định lượng bằng độ hấp thụ ở 586 nm. Đối với các thử nghiệm SOD, Cat và LPO, số lượng toàn bộ ruồi đồng nhất của mỗi lần lặp lại lần lượt là 50, 50 và 100.

4.7. Phân tích thống kê

Tầm quan trọng của sự khác biệt giữa các đường cong sinh tồn và đường cong leo núi của các nhóm kiểm soát và ergosta-7,9(11),22-trien-3 -ol được xử lý được đánh giá theo thứ hạng log (Mantel– Cox) và các phép thử Gehan–Breslow–Wilcoxon. Tầm quan trọng của sự khác biệt giữa chỉ số hiệu suất của bộ nhớ học tập của ergosta-7,9(11),22-trien-3 -ol được xử lý và nhóm kiểm soát được đánh giá bằng bài kiểm tra t của Sinh viên.

5. Kết Luận

Chúng tôi đã xác minh rằng ergosta-7,9(11),22-trien-3 -ol (EK100) từ Antrodia camphorate giúp cải thiện khả năng sống sót, khả năng học tập và trí nhớ trong mô hình Drosophila mắc bệnh AD, đồng thời giảm các dấu ấn sinh học kích hoạt microglia và viêm. Ngoài ra, việc điều chỉnh triệu chứng không xảy ra thông qua giảm căng thẳng oxy hóa phổ biến, có nghĩa là ergosta-7,9(11) và 22-trien-3 -ol cải thiện các triệu chứng AD thông qua các con đường khác nhau Chiết xuất Antrodia long não, antroquinonol. EK100 giảm kích hoạt vi thần kinh đệm và viêm một cách hiệu quả, điều này có thể giúp đảo ngược tình trạng suy giảm nhận thức điển hình liên quan đến AD, chẳng hạn như suy giảm khả năng học tập và trí nhớ.

Nguyên liệu bổ sung:Sau đây là có sẵn trực tuyến. Hình S1: Sự sống sót của ruồi hoang dã được điều trị bằng EK100; Hình S2: Sự leo lên của ruồi hoang dã được xử lý bằng EK100; Hình S3: Khử mùi khó chịu của ruồi AD được xử lý bằng EK100; Bảng S1: Thống kê các đường cong sinh tồn.

Sự đóng góp của tác giả:H.-PL, Y.-HK và W.-YL đã thiết kế các thí nghiệm. Y.-HK đã đóng góp vào việc chuẩn bị EK100. JC, L.-ZC, M.-SC, L.-WS và T.-NC đã thực hiện các thí nghiệm. Tất cả các tác giả đã tham gia vào việc chuẩn bị bản thảo. Tất cả các tác giả đã đọc và đồng ý với phiên bản xuất bản của bản thảo.

Kinh phí: Công trình này được hỗ trợ bởi các khoản trợ cấp từ Bộ Khoa học và Công nghệ ở Đài Loan (MOST 108-2320-B-039-031-MY3, MOST 109-2314-B-039-030, MOST 110-2314- B-039-009), Bệnh viện & Đại học Y khoa Trung Quốc (CMU109-MF-85, CMU108-MF-68, CMU108-MF{{12 }}, CMU109- AWARD-02, và DMR-109-150) và từ Chương trình Trung tâm Nghiên cứu Khu vực Nổi bật trong khuôn khổ Dự án Mầm giáo dục Đại học của Bộ Giáo dục (MOE) ở Đài Loan (CMRC-CHM-2-1).

Tuyên bố của Ủy ban Đánh giá Thể chế:Không áp dụng.

Tuyên bố đồng ý có hiểu biết:Không áp dụng.

Tuyên bố về tính khả dụng của dữ liệu:Dữ liệu được sử dụng để hỗ trợ những phát hiện của nghiên cứu này được bao gồm trong bài báo.

Xung đột lợi ích:Y.-HK là một trong những nhà phát minh nhưng không phải là người được chuyển nhượng bằng sáng chế US-9757393-B2 có tên "Các dẫn xuất của ergostatrien-3- -ol từ aniridia long não và việc sử dụng chúng để chống đường huyết, hạ mỡ máu và giảm mỡ gan". Các tác giả khác tuyên bố rằng họ không có lợi ích cạnh tranh. Các nhà tài trợ không có vai trò gì trong việc thiết kế nghiên cứu; trong việc thu thập, phân tích hoặc giải thích dữ liệu; trong quá trình viết bản thảo, hoặc trong quyết định công bố kết quả.

Sẵn có mẫu:Các mẫu của các hợp chất có sẵn từ các tác giả.

Người giới thiệu

1. Davidson, JW Đảo Formosa, Quá khứ và Hiện tại: Lịch sử, Con người, Tài nguyên và Triển vọng Thương mại. Trà, long não, đường, vàng, than đá, lưu huỳnh, cây kinh tế và các sản phẩm khác; Macmillan & Company: New York, NY, Mỹ, 1903.

2. Tsai, Z.; Liaw, S. Việc sử dụng và tác dụng của nấm linh chi; Sheng-Yun Publishers, Inc.: Taichung, Taiwan, 1985; trang 116–117.

3. Chen, C.-J. Nghiên cứu nuôi cấy rắn và hoạt tính sinh học của Antrodia camphorata. phùng. Khoa học. 2001, 16, 65–72.

4. Geethangili, M.; Tzeng, Y.-M. Xem xét tác dụng dược lý của Antrodia camphorate và các hợp chất hoạt tính sinh học của nó. Bổ sung dựa trên Evid. thay thế. y tế. 2011, 2011, 212641. [CrossRef] [PubMed]

5. Ôgura, S.; Jakovljevic, MM Già hóa dân số toàn cầu-chăm sóc sức khỏe, hậu quả kinh tế và xã hội. Đằng trước. Public Health 2018, 6, 335. [CrossRef] [PubMed]

6. Cummings, J.; Lee, G.; Ritter, A.; Zhong, K. Đường ống phát triển thuốc điều trị bệnh Alzheimer: 2018. Chứng mất trí nhớ Alzheimer. Bản dịch độ phân giải lâm sàng. Khoảng thời gian 2018, 4, 195–214. [CrossRef] [PubMed]

7. Sharma, P.; Srivastava, P.; Seth, A.; Tripathi, PN; Banerjee, AG; Shrivastava, SK Xem xét toàn diện các cơ chế sinh bệnh liên quan đến bệnh Alzheimer và các chiến lược điều trị tiềm năng. Ăn xin. thần kinh. 2019, 174, 53–89. [CrossRef] [PubMed]

8. Sochocka, M.; Donskow-Łysoniewska, K.; Diniz, BS; Kurpas, D.; Brzozowska, E.; Leszek, J. Sự thay đổi hệ vi sinh vật đường ruột và cơ chế bệnh sinh do viêm nhiễm của bệnh Alzheimer—Một đánh giá quan trọng. mol. thần kinh. 2019, 56, 1841–1851. [Tham khảo chéo]

9. Agostinho, P.; A Cunha, R.; Oliveira, C. Viêm dây thần kinh, stress oxy hóa và cơ chế bệnh sinh của bệnh Alzheimer. Curr. dược phẩm. Des. 2010, 16, 2766–2778. [Tham khảo chéo]

10. Galasko, D.; Montine, TJ Dấu ấn sinh học của tổn thương oxy hóa và viêm nhiễm trong bệnh Alzheimer. Dấu ấn sinh học. y tế. 2010, 4, 27–36. [Tham khảo chéo]

11. Kuo, Y.-H.; Lin, T.-Y.; Bạn, Y.-J.; Ôn, K.-C.; Sung, P.-J.; Tưởng, H.-M. Tác dụng chống viêm và chống nắng của ergostatrien-3 -ol, được phân lập từ Antrodia camphorata, trên da chuột không có lông. Phân tử 2016, 21, 1213. [CrossRef]

12. Chao, T.-Y.; Hsieh, C.-C.; Từ, S.-M.; Wan, C.-H.; Liên, G.-T.; Tseng, Y.-H.; Kuo, Y.-H.; Hsieh, S.-C. Ergostatrien-3 -ol (EK100) từ Antrodia camphorata làm giảm căng thẳng oxy hóa, viêm và tổn thương gan trong ống nghiệm và trong cơ thể. trước Dinh dưỡng. Khoa học thực phẩm 2021, 26, 58. [CrossRef]

13. Tsai, T.-C.; Tùng, Y.-T.; Kuo, Y.-H.; Liao, J.-W.; Tsai, H.-C.; Chong, K.-Y.; Chen, H.-L.; Chen, C.-M. Tác dụng chống viêm của Antrodia camphorata và Hợp chất hoạt tính của nó, Ergostatrien-3 -ol, trong Mô hình thiếu máu cục bộ trên da chuột. FASEB J. 2015, 29, LB444.

14. Chang, W.-H.; Trần, MC; Cheng, IH Antroquinonol làm giảm mức amyloid não và cải thiện khả năng học tập và trí nhớ không gian trong mô hình chuột biến đổi gen mắc bệnh Alzheimer. Khoa học. Dân biểu 2015, 5, 1–12. [CrossRef] [PubMed]

15. Chen, Y.-M.; Sung, H.-C.; Kuo, Y.-H.; Từ, Y.-J.; Hoàng, C.-C.; Liang, H.-L. Tác dụng của Ergosta-7, 9 (11), 22-trien-3 -ol từ Antrodia camphorate đối với hồ sơ sinh hóa và hiệu suất tập thể dục của chuột. Phân tử 2019, 24, 1225. [CrossRef]

16. Finelli, A.; Kelkar, A.; Song, H.-J.; Dương, H.; Konsolaki, M. Một mô hình nghiên cứu độc tính gây ra bệnh Alzheimer 42-ở Drosophila melanogaster. mol. Tế bào. Thần kinh học. 2004, 26, 365–375. [CrossRef] [PubMed]

17. Bình, Y.; Hahm, E.-T.; Waro, G.; Bài hát, Q.; Võ-Bá, D.-A.; Licursi, A.; Bảo, H.; Ganoe, L.; Finch, K.; Tsunoda, S. Liên kết khả năng bị kích thích quá mức do 42-gây ra với thoái hóa thần kinh, thiếu hụt khả năng học tập và vận động cũng như tuổi thọ ngắn hơn trong mô hình bệnh Alzheimer. gen PLoS. 2015, 11, e1005025. [CrossRef] [PubMed]

18. Đối thủ, T.; Trang, RM; Chandraratna, DS; Sendall, TJ; Ryder, E.; Lưu, B.; Lewis, H.; Rosahl, T.; Hider, R.; Hóa học Camargo, L. Fenton và stress oxy hóa làm trung gian độc tính của peptide -amyloid trong mô hình Drosophila của bệnh Alzheimer. Ơ. J. Thần kinh học. 2009, 29, 1335–1347. [Tham khảo chéo]

19. Ray, A.; Speese, SD; Logan, MA Glial draper giải cứu Một độc tính trong mô hình Drosophila của bệnh Alzheimer. J. Thần kinh học. 2017, 37, 11881–11893. [Tham khảo chéo]

20. Jeibmann, A.; Paulus, W. Drosophila melanogaster như một sinh vật mẫu của bệnh não. quốc tế J. Mol. Khoa học. 2009, 10, 407–440. [CrossRef] [PubMed]

21. Brookmeyer, R.; Hành lang, MM; Curriero, FC; Kawas, C. Sống sót sau chẩn đoán bệnh Alzheimer. Vòm. thần kinh. 2002, 59, 1764–1767. [Tham khảo chéo]

22. Lâm, LC; Đường, W.; Leung, V.; Chiu, HF Hồ sơ hành vi của bệnh Alzheimer ở ​​người cao tuổi Trung Quốc–một nghiên cứu xác thực về phiên bản Trung Quốc của thang đánh giá bệnh lý hành vi bệnh Alzheimer. quốc tế J. Lão sư. tâm thần. 2001, 16, 368–373. [CrossRef] [PubMed]

23. Schwab, C.; McGeer, PL Các khía cạnh viêm của bệnh Alzheimer và các rối loạn thoái hóa thần kinh khác. J. Bệnh Alzheimer. 2008, 13, 359–369. [CrossRef] [PubMed]

24. MacDonald, JM; Bãi biển, MG; Porpiglia, E.; Sheehan, AE; Watts, RJ; Freeman, MR Thụ thể nhận chìm xác tế bào Drosophila Draper làm trung gian giải phóng thần kinh đệm của các sợi trục bị cắt đứt. Thần kinh 2006, 50, 869–881. [Tham khảo chéo]

25. Trần, Z.; Zhong, C. Stress oxy hóa trong bệnh Alzheimer. Thần kinh học. Bò đực. 2014, 30, 271–281. [Tham khảo chéo]

26. Stankovic, ND; Teodorczyk, M.; Ploen, R.; Zipp, F.; Schmidt, MH Microglia–tương tác mạch máu: Con dao hai lưỡi trong bệnh lý não. Acta bệnh thần kinh. 2016, 131, 347–363. [Tham khảo chéo]

27. Konishi, H.; Tín hiệu Kiyama, H. Microglial TREM2/DAP12: Con dao hai lưỡi trong các bệnh thần kinh. Đằng trước. Tế bào. Thần kinh học. 2018, 12, 206. [CrossRef] [PubMed]

28. Sevigny, J.; Chiao, P.; Bussière, T.; Weinreb, PH; Williams, L.; Maier, M.; Dunstan, R.; Salloway, S.; Chen, T.; Ling, Y. Kháng thể aducanumab làm giảm mảng bám A trong bệnh Alzheimer. Thiên nhiên 2016, 537, 50–56. [Tham khảo chéo]

29. Lalli, G.; Schott, JM; Hardy, J.; De Strooper, B. Aducanumab: Một giai đoạn mới trong phát triển điều trị bệnh Alzheimer? EMBO Mol. y tế. 2021, 13, e14781.

30. Takata, K.; Kitamura, Y.; Saeki, M.; Terada, M.; Kagitani, S.; Kitamura, R.; Fujikawa, Y.; Maelicke, A.; Tomimoto, H.; Taniguchi, T. Galantamine gây ra sự thanh thải amyloid qua trung gian kích thích các thụ thể acetylcholine nicotinic vi thần kinh đệm. J. Sinh học. hóa học. 2010, 285, 40180–40191. [CrossRef] [PubMed]

31. Mandrekar-Colucci, S.; Karlo, JC; Landreth, GE Các cơ chế làm cơ sở cho thụ thể được kích hoạt bằng chất tăng sinh peroxisome nhanh chóng- -thanh thải amyloid qua trung gian và đảo ngược sự thiếu hụt nhận thức trong mô hình bệnh Alzheimer ở ​​chuột. J. Thần kinh học. 2012, 32, 10117–10128. [Tham khảo chéo]

32. McGeer, PL; McGeer, EG Nhắm mục tiêu microglia để điều trị bệnh Alzheimer. Ý kiến ​​chuyên gia. Có. Mục tiêu 2015, 19, 497–506. [CrossRef] [PubMed]

33. Bài hát, WM; Colonna, M. Bản sắc và chức năng của microglia trong thoái hóa thần kinh. tự nhiên miễn dịch. 2018, 19, 1048–1058. [CrossRef] [PubMed]

34. Kuo, Y.-H.; Lin, C.-H.; Shih, C.-C. Ergostatrien-3 -ol từ Antrodia camphorata ức chế bệnh tiểu đường và tăng lipid máu ở chuột được điều trị bằng chế độ ăn nhiều chất béo thông qua điều hòa các gen liên quan đến gan, chất vận chuyển glucose 4 và quá trình phosphoryl hóa protein kinase kích hoạt AMP. J. Nông nghiệp. Hóa chất thực phẩm 2015, 63, 2479–2489. [CrossRef] [PubMed]

35. Le Bourg, E.; Lints, FA Hypergravity và lão hóa ở Drosophila melanogaster. 4. Hoạt động leo núi. Lão khoa 1992, 38, 59–64. [Tham khảo chéo]

36. Waddell, S.; Quinn, WG Ruồi, gen và học tập. Ann. Mục sư Thần kinh học. 2001, 24, 1283–1309. [CrossRef] [PubMed]

【Để biết thêm thông tin:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】