Nghiên cứu thực nghiệm về tác dụng bảo vệ của Cistanche Total Glycosides (CTG) đối với chấn thương do tái tưới máu do thiếu máu cục bộ ở thận
Mar 09, 2022
Liên hệ: Audrey Hu Whatsapp / hp: 0086 13880143964 Email:audrey.hu@wecistanche.com
ZHU Jun, ZHAO Xi
Trừu tượng:Mục tiêu Thiết lập mô hình sốc xuất huyết và hồi sức chuột để quan sát hiệu quả bảo vệ củacistanche tổng số glycoside(CTG)trên thậnchấn thương do thiếu máu cục bộ-tái tưới máu. Những con chuột SD của Meth ods được phân ngẫu nhiên thành một nhóm phẫu thuật giả, một nhóm gây sốc và hồi sức (nhóm thử nghiệm), và một nhóm CTG, với 10 con chuột trong mỗi nhóm. Sau khi làm mô hình, những con chuột trong nhóm CTG được tiêm vào màng bụng CTG 400 mg / kg. Trong nhóm thực nghiệm và nhóm hoạt động giả, nước muối vật lý 3 ml được tiêm. Nồng độ Cr, BUN và Cys - C được xác định để phát hiện chức năng thận ở mỗi nhóm. Phương pháp đo tế bào dòng chảy được sử dụng để phát hiện tỷ lệ apoptosis của tế bào thận. ELISA được sử dụng để phát hiện biểu hiện XIAP trong mô thận. Kết quả So với nhóm thí nghiệm, mức Cr, BUN và Cys - C rõ ràng đã giảm trongCTGnhóm (P ＜ {{0}}. 01), và quá trình chết rụng tế bào thận đã giảm (P ＜ 0,01). CTG cải thiện đáng kể biểu hiện XIAP (P<0.05). conclusion="">CTGmang lại hiệu quả bảo vệ trêntái tưới máu do thiếu máu cục bộchấn thương thận ở chuột, có thể liên quan đến việc thúc đẩy biểu hiện XIAP.
【Từ khóa】 Thận; Tổn thương tái tưới máu do thiếu máu cục bộ; Cistanche Tổng số Glycosides; XIAP; Apoptosis của tế bào
Tổn thương do thiếu máu cục bộ-tái tưới máu (I / R)là hiện tượng sinh lý bệnh thường gặp của tổn thương thận trong quá trình sốc xuất huyết, chấn thương nặng, ghép thận, phẫu thuật khối u thận. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng quá trình apoptosis là một liên kết quan trọng trong tổn thương chức năng thận do tổn thương I / R [1]. Chất ức chế liên kết nhiễm sắc thể X của protein tự chết (XIAP) là một trong những chất ức chế nội sinh mạnh nhất của quá trình tự chết được tìm thấy cho đến nay [2]. Có rất ít nghiên cứu về tác dụng chống apxe của XIAP trong mô thận sau chấn thương I / R.Cistanche tổng số glycoside(CTG) nằm trong danh sách Các hợp chất glycoside Phenylethanol được chiết xuất từCistanchecó chức năng sinh học đa dạng. Có rất ít nghiên cứu về khả năng bảo vệ thận của nó sau chấn thương I / R. Trong thí nghiệm này, một mô hình hồi sức sốc xuất huyết trên chuột đã được thiết lập và một mô hình chấn thương I / R toàn thân được thiết lập để khám phá tác dụng bảo vệ của tiền xử lý CTG đối với thận khỏi chấn thương I / R và khám phá cơ chế khả thi của nó.
Tác dụng của cistanche: ngăn ngừaTổn thương do thiếu máu cục bộ-tái tưới máu (I / R)
1 Vật liệu và phương pháp
1.1 Vật liệu thí nghiệm
1.1.1 Động vật trong phòng thí nghiệm 30 con chuột SD đực khỏe mạnh loại sạch, được cung cấp bởi Trung tâm Thực nghiệm của Đại học Y học Cổ truyền Trung Quốc Thượng Hải, số chứng chỉ động vật: SYXK (Thượng Hải) 2009-0069, trọng lượng cơ thể (320 ± 30) g.
1.1.2 Thuốc thử thực nghiệmCTG(mua từ Zhejiang Hangzhou Xinghui Tianli Pharmaceutical Co., Ltd., số lô: 20081516); natri pentobarbital (số lô: P3761), propidium iodide (PI), Rhodamin123 (cả hai đều được mua (từ Sigma, Hoa Kỳ); Bộ xác định chuột XIAP ELISA Kit (mua từ Công ty TNHH Công nghệ sinh học Kemin Thượng Hải, số lô CSB-ELO26172MO) .
1.1.3 Dụng cụ thí nghiệm Máy đọc vi lượng (Công ty Thermo của Mỹ); Máy dò sinh lý đa thông số (mua của Công ty NIHON KOHDEN, Nhật Bản); Máy đo lưu lượng (mua từ Công ty Becton-Dickinson, Hoa Kỳ); 24 G trocar (Công ty thiết bị y tế Sơn Đông Jierui).
1.2 Phương pháp thực nghiệm
1.2.1 Chuẩn bị mô hình động vật Chuột SD được nhịn ăn 12 giờ trước khi thí nghiệm và được gây mê bằng cách tiêm vào màng bụng natri pentobarbital (50 mg / kg). Những con chuột được cố định ở tư thế nằm ngửa, và rạch một đường 3 cm ở bụng dưới bên trái và tách ra. Trong động mạch đùi, một trocar 24 G được đưa vào, một máy kiểm tra sinh lý đa thông số được kết nối, một ống tiêm 20 ml được gan hóa, và huyết áp giảm xuống 40 mm Hg. Huyết áp giảm xuống 40 mm Hg. Coi như đã hết sốc, duy trì huyết áp trong 90 phút. Nó là (13 ± 3) ml, và sau đó máu tự thân trong ống tiêm được đưa trở lại từ từ. Mất khoảng 30 phút để khôi phục huyết áp về hơn 90% giá trị cơ bản. Được coi là hồi sức thành công [3]. Rút kim trocar ra, thắt động mạch đùi và khâu vết mổ. Sau khi chuột tỉnh dậy, chúng được đưa trở lại chuồng để quan sát, đồng thời được tiếp cận thức ăn và nước uống miễn phí. 24 giờ sau khi hồi sức, chuột được gây mê bằng pentobarbital natri (50 mg / kg) bằng cách tiêm trong phúc mạc, phẫu thuật mở bụng, và 5 ml máu được lấy từ tĩnh mạch chủ dưới. Những con chuột bị giết ngay lập tức, và thận trái và phải được lấy ra để sử dụng.
1.2.2 Phân nhóm và sử dụng động vật 30 con chuột được chia ngẫu nhiên thành nhóm phẫu thuật giả, nhóm hồi sức chống sốc (nhóm thực nghiệm) và nhóm CTG, với 10 con chuột trong mỗi nhóm.
Nhóm thí nghiệm được tiêm trong phúc mạc 3 ml nước muối thường 2 giờ trước khi lấy máu. bên trongCTGnhóm, CTG được tiêm 2 giờ trước khi chuột rút máu, và liều được tiêm vào khoang bụng với liều 400 mg / kg. Nhóm phẫu thuật giả chỉ tiến hành gây mê, mổ mở ổ bụng và tách đặt trocar động mạch đùi và khâu vết mổ,… không lấy máu và hồi sức, còn lại đều giống nhóm thực nghiệm.
1.3 Các chỉ số và phương pháp kiểm tra
1.3.1 Việc xác định creatinin máu (Cr), nitơ urê (BUN), cystatin C Cr, BUN và cystatin C được xác định bởi phòng thí nghiệm của bệnh viện chúng tôi. Cystatin C là một dấu hiệu nội sinh về sự thay đổi mức lọc cầu thận. Khi chức năng thận bị suy giảm, mức lọc cầu thận giảm và nồng độ cystatin C trong máu có thể tăng hơn 10 lần. Độ chính xác chẩn đoán của cystatin C tốt hơn đáng kể so với creatinin huyết thanh.
1.3.2 Xác định tốc độ chết của tế bào Phương pháp đo tế bào dòng chảy được sử dụng để phát hiện tốc độ chết của tế bào thận. Lấy một quả thận và cắt nhỏ bằng một lưỡi dao, thêm một ít PBS và chuyển nó vào một ống nghiệm. Thêm 0. 3 phần trăm trypsin để phân hủy trong nồi cách thủy 37 độ và ủ trong 2 0 phút. Khi chất trong ống nghiệm trở nên đục, thêm PBS hai lần để ngừng quá trình phân hủy, lọc bằng lưới nylon 3 0 0 mesh, loại bỏ tạp chất và sử dụng máy ly tâm nhiệt độ thấp Máy ly tâm ở 1500 g / s để 5 phút, loại bỏ phần nổi phía trên, điều chỉnh nồng độ tế bào thành 1 × 106 ~ 1,5 × 106 / ml, lấy 0,4 ml huyền phù tế bào ở trên và thêm 10 ul / ml Rhodamin 123 0 ．4 ml, ủ trong Cách thủy 37 độ tránh ánh sáng, đậy nắp ống nghiệm, tráng bằng PBS hai lần sau 30 min, sau đó ly tâm ở 1500 g / s trong 5 min, loại bỏ phần nổi phía trên và tráng lại theo cách tương tự. Thêm PI 0,4 ml, nhuộm trong 15 phút, và kiểm tra tỷ lệ phần trăm tế bào bình thường, hoại tử và tế bào chết trong thận. Theo ái lực của hai thuốc nhuộm này trong các loại tế bào, người ta biết rằng chỉ có tế bào màu PI là tế bào chết, chỉ có tế bào màu Rhodamin123 là tế bào sống và cả hai tế bào màu đều là tế bào apoptotic.
1.3.3 Xét nghiệm miễn dịch liên kết enzym (ELISA) được sử dụng để phát hiện sự biểu hiện của XI-AP trong mô thận chuột. Thận của mỗi nhóm được lấy, và các mô thận tươi được xử lý bằng dịch lọc mô. Ly tâm ở 1500 g / s trong máy ly tâm nhiệt độ thấp trong 5 phút. Lấy phần nổi phía trên và thao tác theo hướng dẫn của Bộ công cụ ELISA XI-AP. Shanghai Jiaoda Fenghe Technology Co., Ltd. chịu trách nhiệm thử nghiệm.
1.4 Xử lý thống kê
Tất cả dữ liệu được phân tích thống kê bằng phần mềm SPSS17. 0 và dữ liệu được biểu thị dưới dạng trung bình ± độ lệch chuẩn (x ± s) và P<0.05 indicated="" that="" the="" difference="" was="" statistically="">
cistanche tổng số glycoside
2 kết quả
2.1 Các chỉ số chức năng thận Cr, BUN, Cystatin C So sánh Cr, BUN, Cystatin C ở nhóm thực nghiệm cao hơn đáng kể so với nhóm phẫu thuật giả (P<0.01), indicating="" that="" the="" rat="" kidney="" i/r="" model="" was="" prepared="">
So với nhóm thực nghiệm, giá trị Cr, BUN và Cystatin C trongCTGnhóm đã giảm đáng kể, và sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (P<0.01). the="" results="" are="" shown="" in="" table="">
Bảng 1 So sánh các chỉ số chức năng thận Cr, BUN và Cystatin C của chuột trong từng nhóm (x ± s)
Lưu ý: So với nhóm hoạt động giả mạo, một P ＜ {{0}}. 01; so với nhóm thử nghiệm, bP ＜ 0,01
2.2 Tỷ lệ apoptosis của tế bào thận và sự biểu hiện của XIAP trong mô thận. Chỉ một số tế bào trong mô thận của nhóm hoạt động giả mạo trải qua quá trình apoptosis.
Số lượng apoptosis ở nhóm thực nghiệm đã tăng lên đáng kể và sự khác biệt có ý nghĩa thống kê so với nhóm hoạt động giả (P<0.01); the="" number="" of="" apoptosis="" in="" the="" ctg="" group="" was="" decreased="" compared="" with="" the="" experimental="" group,="" and="" the="" difference="" was="" statistically="" significant="" (p=""><0.01)>
Nhóm vận hành giả chỉ có biểu hiện XIAP yếu, trong khi nhóm thực nghiệm có biểu hiện XIAP tăng đáng kể (P<0.01). compared="" with="" the="" experimental="" group,="" the="" ctg="" group="" can="" significantly="" increase="" the="" expression="" of="" xiap=""><0.05). the="" results="" are="" shown="" in="" table="">
Bảng 2 So sánh tỷ lệ apoptosis và biểu hiện XIAP của tế bào thận chuột trong mỗi nhóm (x ± s)
Lưu ý: So với nhóm hoạt động giả mạo, aP ＜ {{0}}. 01 cái; So với nhóm thực nghiệm, b P ＜ 0. 05, cP<0.>
3 Thảo luận
Cơ chế của tổn thương thận I / R rất phức tạp. Là một quá trình bệnh lý xảy ra qua nhiều con đường dưới tác dụng của nhiều yếu tố khác nhau như quá tải ion canxi, tổn thương peroxy hóa lipid, apxe hóa và hoại tử, trong đó các caspase nội sinh Quá trình chết phụ thuộc caspase là một trong những dạng chính của biểu mô ống thận. tổn thương tế bào do chấn thương thận I / R [4]. Chất ức chế họ protein apoptosis (IAP) là chất ức chế caspase duy nhất được tìm thấy trong tế bào động vật có vú cho đến nay, có thể ngăn chặn hiệu quả sự xuất hiện của quá trình apoptosis. XIAP là thành viên ức chế caspase mạnh nhất trong họ IAP, có thể ức chế quá trình chết rụng tế bào do nhiều kích thích bệnh lý gây ra và có tác dụng bảo vệ các cơ quan bị tổn thương [5].
Hiện nay, phương pháp thiết lập mô hình động vật tổn thương I / R thận phần lớn là cắt bỏ một bên thận và kẹp bên còn lại của cuống thận hoặc động mạch thận [6] để mô phỏng tình trạng thận ghép. Tác giả đã sử dụng mô hình hồi sức / sốc xuất huyết trong nghiên cứu này, mô hình này gần với quá trình sinh lý bệnh của quá trình tái tưới máu do thiếu máu cục bộ toàn thân xảy ra trong sốc chấn thương lâm sàng. Trong thí nghiệm này, BUN, Cr và cystatin trong máu của chuột SD Lượng C tăng lên đáng kể và chức năng thận bị suy giảm nghiêm trọng. Nó là một mô hình động vật lý tưởng để nghiên cứu tổn thương thận I / R.
CTG là một thành phần thuốc quan trọng của y học cổ truyền Trung QuốcCistanche. Cistanchevốn có tính ấm, vị ngọt mặn, thuộc kinh thận và ruột già, vốn có trong Thần Nông Bản Thảo Dược Sư. "Bến Tĩnh" nói: "Dưỡng sinh năm lao và bảy thương, dưỡng trung, dưỡng ngũ tạng, cường âm, dưỡng tinh và khí." Cũng thế."Cistancheđã được sử dụng ở đất nước tôi trong hai nghìn năm. Nó đứng đầu trong các công thức tăng cường sức mạnh trong quá khứ và chỉ đứng sau nhân sâm trong các công thức bổ dưỡng.Cistanchecó thểcải thiện chức năng tình dục, điều hòa nội tiết thần kinh, nâng cao chức năng miễn dịch của cơ thể. Chất chống oxy hóa, thúc đẩy chuyển hóa vật chất, bảo vệ cơ tim do thiếu máu cục bộ và các chức năng khác. Là thành phần thuốc chính củaCistanche, CTG có nhiều chức năng. Nghiên cứu về nãothiếu máu cục bộ-tái tưới máungười mẫu
Các nghiên cứu đã phát hiện ra rằngCTGcó thể làm giảm các axit amin kích thích trong mô não sau khi tái tưới máu do thiếu máu cục bộ và bảo vệ mô não của chuột SD [7]. CTG có tác dụng chống oxy hóa mô chuột và có tác dụng bảo vệ nhất định đối với tình trạng thiếu oxy não cấp tính ở chuột và tổn thương cơ tim ở chuột [8]. CTG có thể cải thiện đáng kể hành vi thần kinh của chuột mô hình Parkinson và ức chế sự giảm số lượng tế bào thần kinh dopamine trong chất nền [9]. Bằng cách tăng cường hoạt động của các enzym thu dọn gốc tự do, ngăn chặn quá trình peroxy hóa lipid, ức chế sự lắng đọng peptide -amyloid trong não, và ức chế quá trình apoptosis của tế bào não, CTG làm tăng đáng kể chuột mắc bệnh Alzheimer -amyloid peptide gây ra khả năng học tập và ghi nhớ [10]. Nghiên cứu này cho thấy rằng sau khi áp dụng tiền xử lý CTG, hàm lượng BUN, Cr và cystatin C trong máu của chuột SD giảm đáng kể, và tổn thương chức năng thận cũng giảm. CTG làm tăng protein XIAP ức chế apoptosis trong các mô thận của tổn thương I / R và ngăn chặn các tế bào. Sự xuất hiện của quá trình apoptosis đóng vai trò bảo vệ làm tổn thương thận.
người giới thiệu
[1] Cassis P, Azzollini N, Solini S, và cộng sự. Cả darbepoetin alfa và erythropoietin carbamyl hóa đều ngăn ngừa rối loạn chức năng ghép thận do thiếu máu cục bộ / tái tưới máu ở chuột ［J］． Cấy ghép, 2011, 92 (3): 271-279.
[2] West T, Stump M, Lodygensky G, et al. Thiếu chất ức chế liên kết X của protein apoptosis dẫn đến tăng apoptosis và mất mô sau chấn thương sọ não ở trẻ sơ sinh ［J］． ASN Neuro, 2009, 1 (1). PII: e00004. doi: 10. 10421AN20090005.
[3] Fu X, Tian H, Wang D, et al. Nhiều cơ quan bị tổn thương và hỏng do sốc và tái tưới máu sau vết thương do đạn bắn ［J］． J Trauma, 1996, 40 (3 Suppl): S 135-139.
[4] Padanilam BJ. Chết tế bào do chấn thương thận cấp tính: quan điểm về sự đóng góp của quá trình chết và hoại tử ［J］． Am J Physiol Renal Physiol, 2003, 284 (4): F 608- F627.
[5] Galbán S, Hwang C, Rumble JM, et al. Tác dụng bảo vệ tế bào của IAP được tiết lộ bởi một chất đối kháng phân tử nhỏ ［J］． Biochem J, 2009, 417 (3): 765-771.
[6] Wu Jianguo, Zhang Dan, Wu Xinsheng, v.v., Thiết lập và kinh nghiệm mô hình tổn thương thận do thiếu máu cục bộ-tái tưới máu cấp tính ở chuột [J]. Thông tin Y tế: Sổ tay Phẫu thuật, 2007, 20 (12): 1103-1105.
[7] Zhu Zheng. Tác dụng của Cistanche Glycosides đối với các axit amin kích thích trong mô não của chuột sau khi thiếu máu cục bộ não và tái tưới máu [J]. Y học An Huy, 2010, 14 (12): 1393 -1394.
[8] Julia Y, Wang XW, Wubuli AS, et al. Tác dụng bảo vệ của tổng số glycoside của cistanche Desticola khi thiếu oxy ［J］． Đại diện Chin Pharm, 2003, 20 (1): 73-76.
[9] Li Wenwei, Yang Ru, Cai Dongfang, et al. Tác dụng bảo vệ của tổng số glycoside của cistanche đối với tế bào thần kinh dopaminergic ở chuột mô hình bệnh MPTP Parkinson
[10] Liu Fengxia, Wang Xiaowen, Luo Lan ... Bản tin Dược học Trung Quốc, 2006, 22 (5): 595-599.
