Phản ứng Favonoid và Phyto ‑ oxylipin trong lá Lựu (Punica Granatum L.) Phần 1

Xin vui lòng liên hệoscar.xiao@wecistanche.comđể biết thêm thông tin

Trừu tượng:Methyl jasmonate (MeJA) được tạo ra trong thực vật có thể làm trung gian cho phản ứng của chúng đối với các áp lực môi trường. Ứng dụng ngoại sinh của MeJA cũng đã được chứng minh là có thể kích hoạt các con đường truyền tín hiệu và gây ra sự tích tụ phytoalexin trong nhiều loài thực vật. Để hiểu cách cây lựu phản ứng sinh hóa với các áp lực môi trường, phân tích chất chuyển hóa được tiến hành trong lá lựu được ứng dụng MeJA và cho thấy những thay đổi độc đáo về tannin có thể thủy phân, flavonoid và Phyto-oxylipin. Ngoài ra, các phân tích qPCR phiên mã và thời gian thực của lá lựu được xử lý bằng MeJA và mô phỏng đã xác định các gen chuyển hóa biểu hiện khác biệt và các yếu tố phiên mã có khả năng liên quan đến việc kiểm soátcó thể thủy phâncon đường tannin, flavonoid và Phyto-oxylipin. Đặc điểm phân tử, sinh hóa và định dạng sinh học của chỉlipoxygenasevới sự biểu hiện bền vững, do MeJA gây ra cho thấy rằng nó có khả năng oxy hóa các axit béo không bão hòa đa, mặc dù không nằm trong ngăn dưới tế bào nơi tạo ra Phyto-oxylipin không jasmonate (không JA). Những kết quả này chung cho thấy rằng mặc dù sự ức chế rộng rãi của flavonoid và anthocyanins ít nhất được kiểm soát một phần ở cấp độ phiên mã, thì quá trình sinh tổng hợp không phải JA đã gây ra.Phyto-oxylipincó khả năng không được quy định về mặt phiên mã. Nhìn chung, hiểu rõ hơn về cách lá lựu phản ứng với các áp lực từ môi trường sẽ không chỉ thúc đẩy sức khỏe và năng suất của cây trồng mà còn có tác động đến sức khỏe con người vì quả do cây lựu tạo ra là một nguồn giàu hợp chất dinh dưỡng.

Từ khóa:Metyl jasmonat.Flavonoid· Anthocyanin · Axit béo.Phyto-oxylipin· Lipoxygenase

Vui lòng bấm vào đây để biết thêm

Giới thiệu

Khi bị thương hoặc bị tấn công bởi động vật ăn cỏ và mầm bệnh, thực vật sản xuất và phát ra methyl jasmonate (MeJA), được các mô thực vật không bị thương và các cây lân cận cảm nhận để kích hoạt phản ứng phòng vệ (Cheong và Choi 2003). Ngoài ra, ứng dụng ngoại sinh của MeJA đối với thực vật đã được chứng minh là gợi ra các con đường truyền tín hiệu cũng như sản xuất các protein liên quan đến bệnh sinh và các hóa chất phòng vệ được gọi là phytoalexins. Phenolic phytoalexin, ví dụ như flavonoid và anthocyanins, đã thể hiện sự tích lũy tăng lên để đáp ứng với việc xử lý MeJA ở các loại cây khác nhau, chẳng hạn như Arabidopsis thaliana, nho (Vitis vinifera), chuối (Musa acuminate), táo (Malus domestica) và mâm xôi đỏ (Rubus idaeus ) (Pandey et al.2016; Portu et al.2015; De Geyteret al.2012; Shafiq et al.2011; Flo-res and Ruiz del Castillo 2014). Quá trình sinh tổng hợp flavonoid và anthocyanins bắt đầu bằng việc hình thành chalcone naringenin từ coumaroyl CoA và ba phân tử malonyl CoA được xúc tác bởi chalcone synthase (CHS) và sự đồng phân hóa sau đó của chalcone naringenin thành naringenin bởi chalcone isomerase (CHI). Naringenin sau đó được sử dụng để tạo ra bộ xương flavonoid và anthocyanin cốt lõi, chúng được biến đổi thêm với các nhóm chức glycosyl, methyl, hydroxyl và prenyl để tạo ra các cấu trúc và chức năng đa dạng (Tian et al. 2008).

Cistanche có thể cải thiện khả năng miễn dịch

In addition to phenolic phytoalexins, the production of Phyto-oxylipins upon MeJA induction has also been reported in a few plant species (Deboever et al.2020). Phyto-oxylipins are oxygenated fatty acids and derivatives that play a role in plant growth, development, stress response, and innate immunity(Wasternack and Feussner 2018). The initial step of Phyto-oxylipin biosynthesis involves oxidation of polyunsaturated fatty acids(PUFAs) to fatty acid hydroperoxides (HPOs)by lipoxygenases(LOXs)(Andreou and Feussner 2009). Plant LOXs are grouped into two subfamilies according to their protein sequences; type ILOXs are highly homologous(>75% độ giống nhau) và không chứa peptit tín hiệu, trong khi LOX loại II có độ tương đồng trình tự thấp tổng thể (<35%)but all="" contain="" a="" chloroplast="" target="" peptide="" (feussner="" and="" wasternack="" 2002).="" plant="" loxs="" can="" also="" be="" classified="" based="" on="" enzymatic="" activities;9-loxs="" and="" 13-loxs="" target="" the="" c-9="" and="" c-13="" position="" of="" the="" fatty="" acid="" substrate,="" respectively="" (feussner="" and="" wasternack="" 2002).="" hpos="" generated="" by="" loxs="" can="" be="" further="" transformed="" to="" various="" phyto-oxylipins,="" such="" as="" hydroxy="" fatty="" acids="" by="" reductases,="" keto="" fatty="" acids="" by="" loxs,="" epoxy="" fatty="" acids="" by="" per-oxygenases(pxgs),="" and="" dihydroxy="" fatty="" acids="" by="" loxs="" or="" α-dioxygenase="" α-doxs).="" notably,13-hydroperoxy-linolenic="" acid(an="" hpo)produced="" from="" linolenic="" acid="" by="" 13-lox="" can="" initiate="" a="" series="" of="" reactions="" to="" form="" jasmonic="" acid(ja),="" meja,="" and="" the="" bioactive="" ja-isoleucine="">

Lựu (Punica granatum L.) là một loại cây trồng làm vườn đặc sản có giá trị nhờ các hợp chất phenolic dồi dào trong quả của nó, chẳng hạn như flavonoid, anthocyanins và tannin có thể thủy phân (HTs) có nguồn gốc từ một chất trung gian của con đường shikimate (Ono et al.2016 ). Cho đến nay, nhiều nghiên cứu đã tập trung vào vai trò của phenol lựu trong việc giảm bớt căng thẳng và bệnh tật ở người (Wu và Tian 2017). vết thương, mầm bệnh, cảm ứng MeJA) trên lá và quả. Hai báo cáo gần đây đã đánh giá xử lý MeJA trước khi thu hoạch về chất lượng quả lựu sau thu hoạch (Koushesh Saba và Zarei 2019; Garcia-Pastor et al.2020). Tổng số anthocyanins, flavonoid và phenol của trái cây được xử lý MeJA, nhưng không phải lá, được phân tích chung bằng máy quang phổ. Một trong những nghiên cứu cũng phân tích các anthocyanin riêng lẻ bằng phương pháp khối phổ (Garcia-Pastor et al.2020). Tuy nhiên, vẫn chưa rõ làm thế nào các mô của cây lựu, cả lá hoặc quả, phản ứng với các áp lực môi trường trước khi đậu quả.

Để bắt đầu phân tích các tương tác giữa cây lựu và các yếu tố môi trường, chúng tôi đã nghiên cứu phản ứng trao đổi chất của lá lựu đối với ứng dụng MeJA ngoại sinh bằng cách sử dụng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) và sắc ký lỏng-điện cực ion hóa song song khối phổ (LC-ESI-MS / MS) . Những thay đổi độc đáo về HTs, flavonoid và anthocyanins cũng như những thay đổi về lipid, axit béo và Phyto-oxylipin đã được quan sát thấy trong lá lựu được xử lý bằng MeJA. Phân tích bảng điểm so sánh, được xác thực bằng phân tích qPCR thời gian thực, cho thấy rằng các gen cấu trúc và / hoặc điều hòa liên quan đến chuyển hóa HT, flavonoid, anthocyanin và Phyto-oxylipin được biểu hiện khác biệt trong lá lựu được xử lý bằng MeJA và mô hình. Gen LOX duy nhất có biểu hiện điều hòa bền vững trong các lá được xử lý bằng MeJA phải chịu thêm các đặc tính phân tử, sinh hóa và phát sinh loài.

Nguyên liệu và phương pháp

Các chất chuẩn glucose -glucogallin và pentagalloyl được mua từ Shanghai Yuanye Bio-Technology Co. Ltd (Thượng Hải, Trung Quốc). Các hóa chất được sử dụng trong xét nghiệm LOX được lấy từ các nhà cung cấp sau: 3- (dimethylamino) axit benzoic (DMAB) (Thuốc thử Adamas, Co., Ltd., Thượng Hải, Trung Quốc), axit linoleic (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Hoa Kỳ), 3- metyl -2- benzothiazolinone (MBTH) và hemoglobin (Sangon Biotech Co., Ltd., Thượng Hải, Trung Quốc).

Nguyên liệu thực vật Quả và hạt lựu (cv. Wonderful) được cung cấp một cách hào phóng bởi Học viện Khoa học Nông nghiệp và Lâm nghiệp Panzhihua và được xác định bởi Tiến sĩ Binjie Ge tại Vườn Bách thảo Chenshan Thượng Hải. Một mẫu chứng từ (số CSHO173966) đã được gửi tại khu thảo mộc của Vườn Bách thảo Chenshan Thượng Hải, Thượng Hải, Trung Quốc. Cây giống lựu được trồng trong phòng tăng trưởng được kiểm soát nhiệt độ trong 6 tuần ở 25 độ C và 16 giờ sáng / 8 giờ tối. Nồng độ MeJA để phun lên các mô thực vật được báo cáo nằm trong khoảng từ 100 đến 250 μM （Ku et al.2014; Hickman và cộng sự.2017). Các nồng độ khác nhau của MeJA ban đầu được áp dụng cho lá lựu, trong đó MeJA 200μM dẫn đến phản ứng trao đổi chất rõ ràng trong phân tích sơ bộ và được sử dụng cho các phân tích biểu hiện gen và chất chuyển hóa được mô tả trong nghiên cứu này. Trước khi xử lý MeJA, một nửa số cây lựu đã được chuyển đến một phòng sinh trưởng khác với các điều kiện tương tự. Trong khi cây trong một phòng sinh trưởng được phun 200 μM MeJA, những cây trong phòng sinh trưởng khác được phun nước (tức là đối chứng giả). Lúc 2- giờ, 3- giờ, 6- h, 12- h, 24- h, 30- h, 36- h, 48- h và 72- h sau khi điều trị, khởi hành từ 3 5 cây mô phỏng hoặc cây xử lý MeJA được gộp chung lại, tạo thành một bản sao sinh học. Ba bản sao sinh học được thu thập cho các thí nghiệm xử lý mô phỏng và xử lý MeJA; mỗi bản sao sinh học được chia thành các phần nhỏ để phân tích hồ sơ chất chuyển hóa và phân tích biểu hiện gen.

Phân tích hồ sơ chuyển hóa

Lá lựu được đông khô, cân và nghiền thành bột mịn bằng cách sử dụng hạt zirconia trong máy nghiền hạt (Mixer Mill MM 400, Retsch GmbH, Haan, Đức) trong những năm 90 ở tần số 30 Hz. Đối với phân tích HPLC, mẫu lá được chiết xuất trong 70% metanol trong 60 phút dưới chế độ siêu âm và ly tâm ở tốc độ 13, 000 vòng / phút trong 10 phút. Phần nổi phía trên được chuyển vào lọ HPLC, trong đó 30μL được tiêm vào HPLC pha ngược (Agilent 1200, Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) và được phân tích như đã mô tả trước đây (Wil-son et al.2019). Các chất chuyển hóa được phát hiện bằng cách hấp thụ UV ở 254 nm, 280 nm, 320 nm và 360 nm. Đường chuẩn của -glucogallin và pentagalloyl glucose đã được xây dựng; chúng được sử dụng để chuyển đổi diện tích của các pic phù hợp với thời gian lưu và phổ hấp thụ của -glucogallin và pentagalloyl glucose thành các nồng độ tương ứng.

For LC-ESI-MS/MS analysis, the homogenized leaf sample(100 mg) was extracted in 1 mL of 70% methanol at 4℃Covernight.On the following day, the methanolic extract was centrifuged at 10,000×g for 10 min and the supernatant was passed through a CNWBOND Carbon-GCB SPE cartridge（ANPEL, Shanghai, China） and a 0.22-μm syringe filter(ANPEL) prior to metabolite analysis. The extract （2 μL） was analyzed using LC-ESI-MS/MS (Shim-pack UFLC, Shimadzu, Kyoto, Japan; QTRAP6500, Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)and a reverse phase C1s column(ACQUITY UPLC HSS T3,1.8 βm, 2.1 mm×100 mm, Waters, Milford, MA, USA).Metabolites were eluted using solvents(A)water containing 0.04%acetic acid,and(B)acetonitrile containing0.04% acetic acid at a gradient of 0-11 min,95-5%A;11-12 min,5% A;12-12.1 min,5-95%A;12.1-15min,95%A.The flow rate was maintained at 0.4 mL min-1. Linear ion trap (LIT) and triple quadrupole(QQQ)MS scans were acquired in positive-and negative-ion modes. The turbo spray ion source was operated at 500℃C with an ionization voltage of 5500 V. The ion source gas I, gas I, and curtain gas were set at 55 psi,60 psi, and 25 psi, respectively. The collision gas (nitro-gen) was set at 5 psi. For the MRM analysis, declustering potential (DP)and collision energy(CE) were optimized for each precursor-product ion transition. For metabolite identification, the LC-ESI-MS/MS data were compared with an MS2T library of commercial standards and previously identified compounds published in mass spectral databases (when commercial standards are not available)(Chen et al.2013). Pomegranate metabolites were annotated based on the retention times, accumulate m/z values, and fragmentation patterns that match the MS2T library entries(Chen et al.2013). Metabolite quantification was performed using the MRM method as described by Dresen et al. (Dresen et al.2010). The biological replicates of each treatment (mock or MeJA)were averaged for comparative metabolite analysis. The Variable Importance in Projection(VIP) value was obtained from the Orthogonal Partial Least Squares Discriminant Analysis(OPLS-DA)model. Metabolites with ILog, FCl>1, and VIP>=1 được coi là đã thay đổi đáng kể.

Phân tích bảng điểm

RNA tổng số được chiết xuất từ ​​lá lựu bằng thuốc thử TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) và định lượng bằng Nanodrop2000 (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA). Tính toàn vẹn của các mẫu RNA đã được xác minh thông qua phân tách trên gel agarose (không nhìn thấy sự phân hủy) và xác định tỷ lệ OD20 / 28o (giữa 1,8 và 2,2) bằng Nanodrop2000. Việc làm giàu mRNA từ RNA tổng số được thực hiện bằng cách sử dụng các hạt từ tính oligo (dT) (Invitrogen). Thư việnmRNA-Seq được xây dựng bằng cách sử dụng bộ công cụ chuẩn bị thư viện Truseq RNA (Illumina, San Diego, CA, USA). Phân tích bảng điểm được thực hiện trên Illumina HiSeq4000 và 55-60 triệu trong số 150- lần đọc kết thúc ghép nối bp (PE150) đã được thu được cho mỗi thư viện mẫu. Dữ liệu trình tự thô được xử lý bằng cách loại bỏ trình tự bộ điều hợp cũng như ngắn (<50 bp),="" low="" quality=""><30), and="" poly(="">10%)reads using SeqPrep (https://github.com/jstjohn/seqprep)and Sickle (HTTPS: GitHub. com/Joshi/sickle). Over 95% of the cleaned reads were uniquely mapped to the reference pomegranate genome for each sample library using HISAT2(Kim et al.2015) and the mapped reads were assembled using StringTie(Pertea et al.2015). The assembled transcriptome sequences were annotated using NCBI NR(ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/db/). Transcript abundance was determined by the RNA-Seq by Expectation-Maximization(RSEM) method and expressed as Transcripts Per Kilobase Million(TPM)(Li and Dewey 2011). Differential gene expression analysis was performed using DESeq2 (Love et al.2014), with a thresh-old of the log, FCl>1 và giá trị P đã điều chỉnh<>

Phân tích qPCR thời gian thực

RNA tổng số được chiết xuất từ ​​lá lựu đã được xử lý bằng MeJA và mô phỏng bằng cách sử dụng Bộ thực vật tinh khiết RNAprep (Tiangen Biotech Co., Ltd., Bắc Kinh, Trung Quốc). Phiên mã ngược (RT) được thực hiện bằng cách sử dụng RNA tổng số và Bộ thuốc thử PrimeScriptTM RT (Takara Bio Inc., Kusatsu, Nhật Bản). PCR định lượng (qPCR) được thực hiện bằng cách sử dụng bộ kit TB GreenTM Premix Ex Taq TM (Tli RNaseH Plus) ( Takara) và Hệ thống PCR thời gian thực StepOnePlus (Ther-moFisher Scientific). Phân tích đường cong nóng chảy được tiến hành và cho thấy một sản phẩm khuếch đại duy nhất cho mỗi cặp mồi. Đối với phân tích RT-qPCR, ba bản sao sinh học và mỗi bản sao có ba bản sao kỹ thuật đã được kiểm tra đối với các mẫu thử nghiệm và được xử lý MeJA. Sự biểu hiện gen được phân tích bằng phương pháp so sánh C, (△ AC) (Livak và Schmittgen 2001), và mức ý nghĩa được xác định bằng cách sử dụng phép thử t của Student hai bên. Trình tự mồi cho phân tích qPCR thời gian thực và hiệu quả khuếch đại của các cặp mồi được trình bày trong Bảng S1.

Sự biểu hiện và tinh sạch của các protein tái tổ hợp và các xét nghiệm enzyme

Khung đọc mở của Pgr 0 25417 (mã hóa LOX giả định) được tổng hợp để sử dụng codon tối ưu ở E. coli (Genewiz, Tô Châu, Trung Quốc) và được nhân bản trong pET28a. Plasmid tái tổ hợp được biến đổi thành E. coli BL21 (DE3) ô. Cấy 5- mL Luria Bertani (LB) với 5 0 ug mL-Ikanamycin được bắt đầu từ một khuẩn lạc đơn lẻ và ủ qua đêm với lắc ở 37C. Môi trường nuôi cấy qua đêm được sử dụng để cấy vào môi trường 100- mL LB với 50ug mL-'kanamycin và cho phép phát triển đến OD600 là 0,5. Isopropyl - - D-thiogalactoside (IPTG) sau đó được thêm vào nồng độ cuối cùng là 0,1 mM để cảm ứng sự biểu hiện protein. Sau khi ủ với lắc ở 16 độ trong 18 giờ, các tế bào được thu hoạch bằng cách ly tâm. Các viên tế bào được đặt lại trong bộ đệm ly giải (50 mM NaH, PO, pH 7.4.300 mM NaCl, 10 mM imidazole) và được đồng nhất bằng cách sử dụng chất phá vỡ tế bào (Constant Systems Ltd, Northants, Anh). Hạt Ni-NTA (ThermoFisher Scientific) với đệm rửa (50 mM NaH, PO, pH 7.4.300 mM NaCl, 25 mM imidazole) và đệm rửa giải (50 mM NaH, PO, pH 7.4.300 mM NaCl, 500 mM imidazole). Các protein tinh khiết được tách trên gel SDS-PAGE 10% để hình dung về độ tinh khiết của protein. Nồng độ của các protein tinh khiết được xác định bằng cách sử dụng xét nghiệm Bradford (Bradford 1976).

Đối với xét nghiệm LOX, axit linoleic được sử dụng làm chất nền trong phương pháp đo màu hai bước với những sửa đổi nhỏ （Anthon và Barrett 2 0 0 8）. Hỗn hợp phản ứng 500- μL, bao gồm 5 0 mM Na-photphat, pH 6, 1 0 mM DMAB, 0,5 mM axit linoleic và nhiều lượng protein tái tổ hợp tinh khiết khác nhau (1,5 mg mL -), được ủ ở 25 độ trong 10 phút. Dung dịch thứ hai （500 μL） chứa 0,2 mM MBTH và 0,1 mg mL-'hemoglobin được thêm vào hỗn hợp phản ứng, được ủ thêm 5 phút. Phản ứng được kết thúc bằng cách thêm 500μL 1 phần trăm （w / v） natri lauryl sulfat. Sự hấp thụ ánh sáng ở bước sóng 598 nm đã được xác định. Bản địa hóa dưới tế bào và phân tích phát sinh loài Một tìm kiếm bộ gen của quả lựu có chú thích (Qin và cộng sự 2017) đã xác định được 1l LOX có độ dài đầy đủ giả định (786 aa đến 970 aa), bao gồm Pgr025413, Pgr020032, Pgr025418, Pgr025417, PgrO18982, PgrO189802, PgrO189802 -dãy độ dài trong GenBank XP _031395793), Pgr009839, Pgr008562, Pgr025678 và PgrO13780. Các vị trí phân tách và bản địa hóa dưới tế bào của các peptit tín hiệu cho LOX quả lựu đã được dự đoán bằng cách sử dụng TargetP 2.0 (http://www.cbs.dtu.dk/servi ces / TargetP /) (Almagro Armenteros et al.2019).

Phân tích trang liên kết TF

Để dự đoán vị trí liên kết của TFs, 1000 bp ngược dòng mã khởi đầu ATG của các gen mục tiêu đã được lấy từ Ngân hàng gen và được tìm kiếm dựa trên TF Eucalyptus Grandis trong PlantRegMap (phiên bản 5) (Tian et al.2020). nhận dạng trang web được đặt ở P Nhỏ hơn hoặc bằng le -4. Phân tích thống kê cho dữ liệu định lượng chất chuyển hóa, transcriptome và qPCR thời gian thực được mô tả trong các phần tương ứng.

Kết quả

MeJA điều chỉnh các con đường truyền tín hiệu và trao đổi chất của tế bào trong lá lựu

Để hiểu phản ứng phiên mã trên toàn bộ bộ gen của quả lựu đối với kích thích MeJA, các bản sao của lá lựu ở 2- h, 6- h, 24- h và 72- h sau MeJA hoặc xử lý mô phỏng (mỗi lần có ba lần lặp lại sinh học) được phân tích (Hình S1). Khoảng 55 triệu lần đọc trình tự thô (đầu ghép nối 2 × 150 bp) đã được thu được cho mỗi bộ phiên mã với hàm lượng GC khoảng 52 phần trăm và giá trị Q30 nằm trong khoảng 91,6 đến 95 phần trăm (Bảng S2). Đối với tất cả các bản sao chép, hơn 96% số lần đọc trình tự đã được làm sạch được ánh xạ tới bộ gen của quả lựu tham chiếu (Qin và cộng sự.2017) (Bảng S3). Phần lớn các bản sao được tập hợp có kích thước nhỏ hơn 1000 bp (34,3%), 1000bp— 2000 bp (32,9 phần trăm), hoặc 2000 bp — 3000 bp (18,1 phần trăm) (Bảng S4).

To identify pathways that are significantly enriched with differentially expressed genes (DEGs)at the above-mentioned time points, genes that show significantly different expression(log, FCl>1, điều chỉnh P<0.05)between meja-="" and="" mock-treated="" leaves="" were="" compared="" to="" the="" kyoto="" encyclopedia="" of="" genes="" and="" genomes(kegg)database="" (fig.s1).="" application="" of="" meja="" modulated="" the="" expression="" of="" genes="" in="" plant="" hormone="" and="" mitogen-activated="" protein="" kinase="" (mapk)signaling="" pathways="" as="" well="" as="" fatty="" acid="" metabolism="" at="" all="" time="" points,="" with="" the="" only="" exception="" of="" those="" in="" plant="" hormone="" pathways="" at="" 24-h="" (fig.="" s1).="" while="" changes="" in="" aromatic="" amino="" acid="" metabolic="" (including="" the="" shikimate="" pathway)genes="" became="" evident="" at="" 6-h="" after="" meja="" treatment="" (fig.s1b),="" a="" surge="" of="" modified="" expression="" of="" flavonoid="" metabolic="" genes="" was="" observed="" for="" the="" 24-h="" and="" 72-h="" post-meja="" treatment="" leaves="" (figs.="" slc="" and="" s1d).="" shikimate="" and="" ht="" pathway="" genes="" and="" ht="" metabolites="" were="" induced="" in="" meja-treated="" pomegranate="" leave="" as="" revealed="" in="" the="" transcriptome="" and="" kegg="" pathway="" enrichment="" analysis,="" three="" shikimate="" biosynthetic="" path-way="" genes="" showed="" upregulated="" expression="" in="" meja-treated="" leaves="" relative="" to="" mock="" controls="" at="" 6-h,="" including="" 3-deoxy-d-arabinose-heptulosonate-7-phosphate="" synthase="" (dahps),="" 3-dehydrogenate="" synthase(dhs),="" and="" the="" bifunctional="" 3-dehydrogenate="" dehydratase/shikimate="" dehydrogenase="" (dhq/sdh;="" abbreviated="" as="" sdh)(figs.s1b="" and="" la).in="" particular,="" three="" isoforms="" of="" pomegranate="" sdhs="" were="" identified="" and="" showed="" differential="" expression="" in="" the="" transcriptome="" analysis,="" pgr020271,="" pgr019030,="" and="">

Để xác định liệu những thay đổi về lượng shikimate và phiên mã gen sinh tổng hợp HT có thể ảnh hưởng đến mức độ của các chất chuyển hóa có nguồn gốc từ những con đường này hay không, các chất chuyển hóa phenolic đã được chiết xuất từ ​​lá được thu hoạch ở 24- h, 30- h. 36- h, 48- h và 72- h sau MeJA hoặc ứng dụng giả và được phân tích bởi HPLC (Hình 2). Cần lưu ý rằng các mốc thời gian này được chọn để tính đến thời gian cần thiết cho quá trình tổng hợp protein và sản xuất và tích lũy chất chuyển hóa sau những thay đổi biểu hiện quan sát được của các gen sinh tổng hợp shikimate và HT tại 6- h. Thời gian lưu và phổ hấp thụ của hai chất chuyển hóa được rửa giải ở 4,57 phút (đỉnh 1) và 24,98 phút (đỉnh 2) phù hợp với thời gian lưu của các chất trung gian của con đường HT -glucogallin và hợp kim Penta-glucose, tương ứng (Hình la và 2a). Cả hai đỉnh đều cho thấy những thay đổi đáng kể trong các khu vực đỉnh tích hợp tại nhiều thời điểm (Hình 2b). Cụ thể, đỉnh 1 tăng lên ở các lá được xử lý MeJA so với các lá điều khiển giả tại 30- h, 36- h và 48- h (Hình 2b). Điều thú vị là, các lá được xử lý MeJA 2in cao điểm ban đầu giảm ở 24- h, nhưng sau đó tăng lên ở 30- h và 36- h trước khi trở lại mức tương tự như các điều khiển giả ở 48- h và 72- h (Hình 2b). Giảm hầu hết các flavonoid và anthocyanins, cũng như tăng flavon và flavonoid methyl hóa, rõ ràng trong lá lựu được xử lý bằng MeJA

To investigate whether exogenous application of MeJA may trigger broad-scale metabolic changes in pomegranate, metabolite profiling analysis was conducted on leaves collected at 72-h after mock- or MeJA treatment using LC-ESI-MS/MS. Metabolite annotation and quantification were performed using an MS/MS spectral tag (MS2T)library and multiple reaction monitoring(MRM), respectively. Of the 658 metabolites that were detected,29 showed increased and 73 exhibited decreased accumulation in MeJA-treated leaves compared to the mock controls (ILog, FCl>1; Bảng S5 và S6). Đối với các chất chuyển hóa được tích lũy khác biệt, có sự làm giàu tổng thể của các chất chuyển hóa tham gia vào quá trình chuyển hóa thứ cấp / chuyên biệt của thực vật (67 trong số 102), đặc biệt là các hợp chất phenolic (63 trong số 102) (Bảng S6).

Trong số các phenol, sự giảm liên quan của một loạt các flavonoid và anthocyanins (42 trong số 73 hợp chất bị giảm) là rõ ràng trong lá được xử lý MeJA (Hình 3; Bảng S6). Điều thú vị là, ba flavon và flavon mono- hoặc di-O-metyl hóa, bao gồm di-O-metyl quercetin, chrysoberyl O-hexosyl-O-hexoside và bán 5- O-hexoside, đã tăng lên trong lá được xử lý MeJA (Hình 3; Bảng S6). Một số chất trung gian của con đường flavonoid và anthocyanin, bao gồm luteolin, chrysoberyl, dihydrokaempferol, dihydroquercetin, dihydromyricetin, epicatechin, delphinidin, và pelargonidin, được phát hiện nhưng không cho thấy những thay đổi đáng kể trong lá xử lý MeJA (Hình 3; Bảng S5). Các dẫn xuất hydroxycin-namoyl, isoflavone và coumarin nằm trong số các phenol khác cho thấy giảm tích lũy khi cảm ứng MeJA (Bảng S6). Ngược lại, hai axit phenolic, 2, 3- axit dihydroxybenzoic và axit protocatechuic (3, 4- axit dihydroxybenzoic) và một coumarin, 6- metyl coumarin, được tăng lên trong lá được xử lý bằng MeJA (Bảng S6).

Phù hợp với các flavonoid và anthocyanin đã được khử phần lớn trong lá lựu được xử lý bằng MeJA, bản sao của hai enzym quan trọng để sinh tổng hợp flavonoid và anthocyanin. CHS (Pgr005566) và CHI (Pgr025966), đã giảm đáng kể ở 6- h và 24- h sau khi ứng dụng MeJA theo phân tích transcriptome (Hình 4). Phân tích qPCR thời gian thực được thực hiện để kiểm tra biểu thức CHS và CHI với các mốc thời gian bổ sung, bao gồm 2- h, 3- h, 6- h, 12- h, {{ 11}} h, 48- h và 72- h (Hình 4). Bảng điểm .CHS giảm trong các lá được MeJA xử lý ở 3- h và vẫn thấp hơn đáng kể so với các bản giả kiểm soát cho đến 72- h, với mức giảm lớn nhất là 12- h. Ngược lại, việc giảm biểu hiện CHI chỉ đáng kể ở 24- h, 48- h và 72- h sau điều trị MeJA (Hình 4).

Bài viết này được trích từ Planta (2021) 254: 89 https://doi.org/10.1007/s00425-021-03735-9