Xác định năm thành phần trong Rehmannia Glutinosa và thiết lập dấu vân tay HPLC

Tóm tắt:Phương pháp xác định hàm lượng năm thành phần trongRehmannia glutinosa, cụ thể là,rehmannoside D, Sư tử tiểu,echinacoside,cistancheside AVàverascoside, đã được thành lập và dấu vân tay sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) của Địa hoàng được thành lập để cung cấp cơ sở khoa học cho việc kiểm soát chất lượng Địa hoàng. Cột Shiseido CAPCELL PAK C18 đã được sử dụng, với dung dịch axit formic acetonitril-0.1% làm pha động, rửa giải gradient, nhiệt độ cột 30 độ, xác định bước sóng thay đổi và tốc độ dòng 1,0 mL/phút. Dấu vân tay HPLC của Rehmannia glutinosa được phân tích bởi "Hệ thống đánh giá độ tương tự dấu vân tay sắc ký y học Trung Quốc (2012 Edition)" software to evaluate its quality consistency. The results showed that according to the established content determination method, the five components had a good linear relationship within their respective concentration ranges (R2>{{0}}.999 0), RSD của kiểm tra độ chính xác, kiểm tra độ lặp lại và kiểm tra độ ổn định là 0,12%~1,58% và tỷ lệ thu hồi mẫu trung bình là 96,5% ~98,6%; dấu vân tay Rehmannia glutinosa HPLC đã được thiết lập đã xác định được 23 đỉnh chung và độ tương tự giữa mẫu Rehmannia glutinosa và dấu vân tay đối chứng là 0.904~0.950. Kết quả cho thấy phương pháp xác định hàm lượng đã được thiết lập và dấu vân tay HPLC phù hợp để đánh giá chất lượng Địa hoàng và xác định Địa hoàng thô và Địa hoàng đã nấu chín, với độ chính xác cao và khả năng tái sản xuất tốt, đồng thời có thể cung cấp hỗ trợ kỹ thuật cho việc kiểm soát chất lượng của địa chỉ. Dược liệu Rehmannia glutinosa.

Từ khóa:Rehmannia glutinosa; xác định nội dung; dấu vân tay; đánh giá chất lượng

CISTANCHE THẢO DƯỢC MỚI VỚIECHINACOSIDE,CISTANCHESIDE AVÀĐỘNG TỪ

Rehmannia glutinosalà củ rễ tươi hoặc khô của cây Scrophulariaceae Rehmannia glutinosa Libosch. Do các phương pháp chế biến khác nhau nên nó chủ yếu được chia thành địa hoàng tươi, địa hoàng sống và địa hoàng nấu chín [1-2]. Các khu vực sản xuất chính là đất Hà Nam, Sơn Tây, Thiểm Tây, v.v. Trong số đó, địa hoàng thô có tác dụng thanh nhiệt, làm mát máu, nuôi dưỡng âm và thúc đẩy sản sinh chất lỏng, chủ yếu dùng để chữa nóng trong máu, làm ấm độc tố và các vết đốm, v.v.; Địa hoàng nấu chín có tác dụng bổ huyết âm, bổ tinh, bổ tủy, chủ yếu dùng chữa thiếu máu, nhiễm clo các loại, hồi hộp, bồn chồn, v.v.[1-2]. Hai loại này có đặc tính và mùi vị khác nhau nhưng đều thuộc kinh gan và thận. Rehmannia glutinosa chứa các thành phần hóa học phức tạp, chủ yếu bao gồm iridoids, ionones, phenylanol glycoside, flavonoid, v.v. [3-5].

Sau khi Rehmannia glutinosa được xử lý bằng các phương pháp chế biến khác nhau, loại, hàm lượng và tỷ lệ các thành phần hóa học trong mỗi sản phẩm chế biến sẽ khác nhau rất nhiều, dẫn đến sự khác biệt đáng kể về hoạt tính dược lý của nó [6-10]. theo

Các nghiên cứu liên quan[11-12] cho thấy trong quá trình Địa hoàng thay đổi từ "thô" sang "nấu chín", hàm lượng các thành phần hóa học như catalpol, motherwort, stachyose và axit amin đều giảm đáng kể và hàm lượng của fructose, 5-hydroxymethylfurfural, v.v. Hàm lượng của , isorebascoside, v.v. đã tăng lên đáng kể. Hiện nay, việc kiểm soát chất lượng địa hoàng sống và chín chủ yếu sử dụng hàm lượng catalpol và rehmanniaside D làm chỉ số đánh giá. Các chỉ số của hệ thống đánh giá còn tương đối đơn lẻ, gây khó khăn cho việc kiểm soát toàn diện chất lượng địa hoàng. Ngoài ra, các nghiên cứu đã chỉ ra rằng hàm lượng Rehmannia glutinosa D thay đổi trước và sau khi chế biến. Nó nhỏ và có độ đặc hiệu kém trong việc mô tả các thay đổi thành phần sau khi xử lý và mức độ xử lý [12-13].

Vì vậy, để đánh giá chất lượng của địa hoàng một cách toàn diện hơn, nghiên cứu này đã thiết lập mối quan hệ giữa rehmanniaside D và Yimu trong địa hoàng.

Phương pháp xác định hàm lượng của năm thành phần phổ biến, bao gồm glucoside, echinaceaside, cistancheoside A, và verascoside, đồng thời thiết lập dấu vân tay HPLC của Địa hoàng để phân tích hàm lượng các thành phần chính trong Địa hoàng từ các khu vực sản xuất khác nhau cũng như trước và sau khi chế biến, nhằm cung cấp thông tin phục vụ việc kiểm soát chất lượng địa hoàng. Hỗ trợ kỹ thuật.

Dụng cụ, thuốc thử và thuốc thử

Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao Agilent 1260 (máy dò là mảng diode); cân phân tích điện tử có phạm vi thay đổi (METTLER TOLEDO); máy làm sạch siêu âm kỹ thuật số (Nhà máy thiết bị siêu âm Thượng Hải, KH-500DE). Metanol (Tập đoàn Sinopharm) là loại dùng cho phân tích; acetonitril (Merck) là loại sắc ký; nước là nước đóng chai Watsons. Chất tham chiếu Rehmannia glutinosa D (số lô RFSD8401909016, độ tinh khiết 98,0%), chất tham chiếu leonurus glycoside (số lô RFS-Y22002208010, độ tinh khiết 98,0%) và chất tham chiếu cistancheside A (mẻ số RFS-R05002009014, độ tinh khiết 96,0%) đều được mua từ Công ty TNHH Công nghệ sinh học Thành Đô Ruifensidean; Chất tham chiếu echinacoside (số lô 111670-201907, độ tinh khiết 91,8%) và chất tham chiếu verascoside (số lô 11530-201914, độ tinh khiết 95,2%) đều được mua từ Viện Kiểm định Thực phẩm và Dược phẩm Trung Quốc. Các mẫu địa hoàng (SX1~SX4, HN1 và HN2) được thu thập từ các vùng sản xuất khác nhau (xem Bảng 1), trong đó SX4 và HN2 lần lượt được hấp bởi SX1 và HN1, còn SX2 và SX3 được thu thập từ cùng một vùng sản xuất. Tất cả các mẫu đều được xác định là hàng thật bởi Song Pingshun, trưởng khoa y học Trung Quốc của Viện Kiểm soát Ma túy tỉnh Cam Túc.

Bảng 1 Thông tin các mẫu tinh dịch Rehmanniae

2.1 Điều kiện sắc ký

Cột Shiseido CAPCELL PAK C18 (250.0 mm×4,6 mm, 5 μm) đã được sử dụng, acetonitril được sử dụng làm pha động A và dung dịch axit formic 0,1% được sử dụng làm pha động B . Các điều kiện rửa giải gradient là: 0-3 phút, 1%A; 3-9 phút, 1%A→5%A; 9-24 phút, 5%A→35%A; 24-35 phút, 35%A→65%A; 35-40 phút, 65%A→90%A. Phát hiện bước sóng thay đổi (0-24 phút, 203 nm; 24-40 phút, 330 nm). Thể tích tiêm là 15 μL dung dịch đối chiếu và 20 μL dung dịch mẫu.

2.2 Chuẩn bị dung dịch

2.2.1 Chuẩn bị dung dịch đối chiếu

Lấy lượng thích hợp của năm chất đối chiếu trên, thêm metanol 70% để chuẩn bị dung dịch đối chiếu hỗn hợp có nồng độ khối lượng là 0,4 mg/mL.

2.2.2 Chuẩn bị dung dịch thử

Cân khoảng 1,0 g bột địa hoàng (đã qua rây số 2), cân chính xác, cho vào bình nón có nắp đậy kín, thêm chính xác 25 ml metanol 70%, đậy kín, cân, xử lý siêu âm (công suất 300). W, tần số 50 kHz) trong 30 phút, để nguội đến nhiệt độ phòng, cân lại, bù khối lượng bằng metanol 70%, lọc và lấy dịch lọc thu được.

2.3 Phương pháp điều tra

2.3.1 Điều tra tính đặc hiệu

Lấy dung dịch đối chiếu hỗn hợp trong phần “2.2.1” và dung dịch thử (mẫu SX1) trong phần “2.2.2”, bơm và đo theo các điều kiện sắc ký trong phần “2.1”. Kết quả cho thấy sắc ký đồ của mẫu Rehmannia cho pic sắc ký có cùng thời gian lưu với các chất chuẩn đối chiếu Rehmannia glutinosa D, Leonurin, Echinacoside, Cistanche Deserticola A và Verbascoside (xem Hình 1), cho thấy phương pháp này có tác dụng mạnh. tính đặc hiệu.

2.3.2 Điều tra mối quan hệ tuyến tính

Thêm 70% metanol vào dung dịch tham chiếu hỗn hợp, pha loãng lần lượt 5 lần, 10 lần, 25 lần, 50 lần, 100 lần và 250 lần, bơm và đo theo các điều kiện sắc ký trong "2.1". Các đường cong tiêu chuẩn được vẽ với nồng độ khối lượng của từng tham chiếu là trục hoành (x) và diện tích pic sắc ký tương ứng là trục tung (y). Kết quả được thể hiện trong Bảng 2, chỉ ra rằng mỗi thành phần có mối quan hệ tuyến tính tốt trong phạm vi nồng độ khối lượng tương ứng.

1.rehmannioside D; 2. leonuride; 3. echinacoside; 4. castanosid A;5. Acteoside

Hình 1 Sắc ký đồ khảo sát độ đặc hiệu

Bảng 2 Mối quan hệ tuyến tính của 5 thành phần trong Tinh dịch Rehmanniae

2.3.3 Điều tra độ chính xác

Lấy dung dịch thử (mẫu SX1) trong phần “2.2.2” và thực hiện phép thử bơm theo các điều kiện sắc ký trong phần “2.1”. Tiêm mẫu liên tục 6 lần, ghi lại diện tích pic của từng thành phần và tính RSD diện tích pic của Địa hoàng glutinosa D, glycoside cây mẹ, glycoside echinacea, cistanche glycoside A và verascoside trong mẫu thử nghiệm là 0. 46%, 0.12%, 0.85%, 0.48% và 0.82%, tương ứng, cho thấy thiết bị có độ chính xác tốt.

2.3.4 Nghiên cứu độ lặp lại

Sáu mẫu của cùng một mẫu rễ Rehmannia (SX1) được chuẩn bị song song theo phương pháp trong “2.2.2” và được bơm và xác định theo các điều kiện sắc ký trong “2.1”. RSD của hàm lượng glycoside rễ cây địa hoàng D, glycoside cây mẹ, glycoside echinacea, cistanche glycoside A và verascoside trong sáu mẫu là 0.46%, 0.69%, 1.42%, {{ 12}}.48% và 1.58% tương ứng cho thấy phương pháp này có độ lặp lại tốt.

2.3.5 Nghiên cứu độ ổn định

Lấy dung dịch thử (mẫu SX1) theo "2.2.2" rồi bơm và đo theo các điều kiện sắc ký theo "2.1" tại 0 h, 2 h, 4 h, 6 h, 8 h, 1{{ 15}} giờ, 12 giờ, 18 giờ và 24 giờ tương ứng. RSD của các vùng cao nhất của Địa hoàng glutinosa D, glycoside cỏ mẹ, echinacoside, cistanche glycoside A và verascoside là 0,94%, 1.04%, 0,73% , 0,83% và 0,71% tương ứng, cho thấy dung dịch thử có độ ổn định tốt trong vòng 24 giờ.

2.3.6 Tỷ lệ thu hồi mẫu

{{0}}.5 g mẫu rễ Rehmannia (SX1) với hàm lượng đã biết gồm 5 thành phần được cân chính xác cho vào bình nón có nắp đậy và thêm 6 phần song song vào, đồng thời thêm 5 dung dịch đối chiếu có nồng độ nhất định tương ứng. Các mẫu được chuẩn bị theo phương pháp trong "2.2.2", và các mẫu được bơm và đo theo các điều kiện sắc ký trong "2.1". Tỷ lệ thu hồi đã được tính toán và kết quả được trình bày trong Bảng 3. Tỷ lệ thu hồi mẫu trung bình của từng thành phần là 96,5%~98,6% và RSD là 0,73%~1,52%, cho thấy phương pháp này có độ chính xác tốt.