FOXO điều chỉnh sự biểu hiện của peptide kháng khuẩn và thúc đẩy quá trình thực bào của tế bào máu ở tôm miễn dịch kháng khuẩn
Aug 31, 2023
trừu tượng
Động vật không xương sống dựa vào khả năng miễn dịch bẩm sinh, bao gồm miễn dịch dịch thể và miễn dịch tế bào, để chống lại nhiễm trùng gây bệnh. Các nghiên cứu trước đây cho thấy yếu tố phiên mã hộp trán O (FOXO) tham gia vào phản ứng miễn dịch niêm mạc của động vật có vú và điều hòa miễn dịch dịch thể trong ruột của động vật không xương sống. Tuy nhiên, liệu FOXO có liên quan đến việc điều hòa miễn dịch tế bào và hệ thống ở động vật không xương sống hay không vẫn chưa được biết. Trong nghiên cứu hiện tại, chúng tôi đã xác định được FOXO từ tôm (Marsupenaeus japonicus) và phát hiện ra rằng nó được biểu hiện ở mức tương đối cơ bản ở tôm bình thường, nhưng được điều chỉnh tăng đáng kể ở tôm bị nhiễm Vibrio anguillarum. FOXO đóng một vai trò quan trọng trong việc duy trì sự cân bằng nội môi của hệ vi sinh vật đường ruột và tan máu bằng cách thúc đẩy sự biểu hiện của Relish, yếu tố phiên mã của con đường suy giảm miễn dịch (IMD) đối với sự biểu hiện của peptide kháng khuẩn (AMP) ở tôm. Chúng tôi cũng phát hiện ra rằng nhiễm mầm bệnh đã kích hoạt FOXO và tạo ra sự chuyển vị hạt nhân của nó bằng cách giảm hoạt động AKT serine/threonine kinase. Trong nhân, FOXO được kích hoạt trực tiếp điều chỉnh sự biểu hiện của gen Amp và Relish mục tiêu chống lại sự lây nhiễm của vi khuẩn. Hơn nữa, FOXO được xác định là có liên quan đến khả năng miễn dịch tế bào bằng cách thúc đẩy quá trình thực bào của tế bào máu thông qua việc điều chỉnh tăng cường sự biểu hiện của thụ thể quét thụ thể thực bào C (Src) và hai GTPase nhỏ, Rab5 và Rab7, có liên quan đến quá trình buôn bán thực bào đến lysosome. trong tế bào chất. Kết hợp lại với nhau, kết quả của chúng tôi chỉ ra rằng FOXO phát huy tác dụng của nó đối với cân bằng nội môi của tan máu và hệ vi sinh vật đường ruột bằng cách kích hoạt con đường IMD ở tôm bình thường và trực tiếp hoặc gián tiếp thúc đẩy biểu hiện AMP và tăng cường quá trình thực bào của tế bào máu chống lại mầm bệnh ở tôm bị nhiễm vi khuẩn. Nghiên cứu này cho thấy các chức năng khác nhau của FOXO trong khả năng miễn dịch kháng khuẩn ở niêm mạc (cục bộ) và toàn thân của động vật không xương sống.
lợi ích bổ sung cistanche-làm thế nào để tăng cường hệ thống miễn dịch
Nhấn vào đây để xem các sản phẩm Tăng cường miễn dịch Cistanche
【Hỏi thêm] Email:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692
Giới thiệu
Các protein thuộc họ O của yếu tố phiên mã hộp đầu não (FOXO) tham gia vào các quá trình sinh học quan trọng khác nhau của sinh vật, bao gồm điều hòa chu kỳ tế bào, sửa chữa DNA bị hư hỏng, khả năng miễn dịch chống ung thư và điều chỉnh tuổi thọ [1,2]. Động vật có vú có bốn loại protein FOXO khác nhau (FOXO1, FOXO3, FOXO4 và FOXO6); tuy nhiên, động vật không xương sống chỉ có một FOXO, còn được gọi là Daf-16 trong Caenorhabditis elegans [3]. Hoạt động phiên mã của FOXO được điều chỉnh bởi một số loại sửa đổi sau dịch mã, chẳng hạn như quá trình phosphoryl hóa, acetyl hóa, methyl hóa và phổ biến hóa [4]. Những sửa đổi này ảnh hưởng đến sự chuyển vị hoặc thoát ra khỏi hạt nhân của FOXO và sự tương tác của nó với các chất đồng ức chế và đồng kích hoạt, có thể thúc đẩy hoặc làm giảm hoạt động FOXO và điều hòa các chức năng sinh học khác nhau của nó [5,6]. Sau khi kích hoạt, FOXO tham gia vào nhiều chức năng sinh lý bằng cách điều hòa quá trình phiên mã của nhiều loại gen mục tiêu [7]. FOXO được kích hoạt bởi các kích thích ngoại bào khác nhau, bao gồm các yếu tố tăng trưởng, cytokine và hormone [8]. Các tín hiệu tăng trưởng, chẳng hạn như insulin hoặc yếu tố tăng trưởng giống insulin 1 (IGF{19}}), tương tác với các thụ thể của con đường insulin và kích hoạt tín hiệu phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K), dẫn đến quá trình phosphoryl hóa FOXO bởi serine/threonine kinase, protein kinase B (AKT) [9]. FOXO được phosphoryl hóa chuyển từ nhân sang bào tương, hoặc ngăn chặn sự chuyển vị của nó từ bào tương sang nhân, nơi nó trở nên phổ biến, dẫn đến sự thoái hóa của nó bởi proteasome [10]. Ngược lại, khi không có tín hiệu tăng trưởng bên ngoài, đường truyền tín hiệu PI3K-AKT không hoạt động và FOXO không được phosphoryl hóa sẽ chuyển vào nhân để thúc đẩy quá trình phiên mã gen mục tiêu [11]. FOXO cũng tham gia vào các phản ứng miễn dịch bẩm sinh chống vi khuẩn và chống vi rút của động vật không xương sống [12,13]. Sự kích hoạt mãn tính của FOXO trong ruột lão hóa của Drosophila sẽ ức chế sự biểu hiện của protein nhận biết peptidoglycan SC2 (một chất điều hòa tiêu cực của con đường suy giảm miễn dịch (IMD)) và phá vỡ cân bằng nội môi miễn dịch đường ruột [14]. FOXO điều chỉnh trực tiếp các gen peptide kháng khuẩn (AMP) trong các mô biểu mô của Drosophila không bị nhiễm bệnh để đáp ứng với căng thẳng do đói, độc lập với con đường miễn dịch bẩm sinh đáp ứng với mầm bệnh [15]. Tuy nhiên, nhiễm mầm bệnh cũng có thể khiến FOXO của tế bào ruột xâm nhập trực tiếp vào nhân từ tế bào chất trong ruột Drosophila [12]. Sự điều hòa AMP phụ thuộc vào FOXO cũng xảy ra trong các mô biểu mô của động vật có vú, cho thấy rằng điều này được bảo tồn về mặt tiến hóa ở động vật [16]. Một số nghiên cứu cho thấy FOXO được kích hoạt bởi mầm bệnh hoặc kích thích cytokine trong phản ứng miễn dịch niêm mạc [17]. Sự chuyển vị trí của chúng vào nhân và liên kết với các gen khởi động của gen mục tiêu được kích thích bởi con đường kinase protein được hoạt hóa bằng mitogen (MAP) và bị ức chế bởi con đường PI3K/AKT. Các gen mục tiêu của FOXO bao gồm các phân tử tín hiệu gây viêm, phân tử bám dính và thụ thể chemokine [17]. Liệu FOXO có liên quan đến phản ứng miễn dịch toàn thân chống lại mầm bệnh hay không vẫn chưa rõ ràng. Thúc đẩy sự biểu hiện của AMP chống lại mầm bệnh là một cơ chế quan trọng của khả năng miễn dịch bẩm sinh ở động vật không xương sống [18]. Trong khả năng miễn dịch bẩm sinh của Drosophila, con đường Toll và IMD có liên quan đến việc điều chỉnh biểu hiện AMP và AMP đóng vai trò quan trọng trong việc loại bỏ mầm bệnh xâm nhập [19–21]. Tương tự như khả năng miễn dịch của côn trùng, các con đường Toll, IMD và Janus kinase (JAK)/tín hiệu và bộ kích hoạt phiên mã (STAT) có liên quan đến việc điều chỉnh biểu hiện AMP ở động vật giáp xác [22,23]. Liệu FOXO có thể điều chỉnh sự biểu hiện của AMP độc lập với các con đường Toll, IMD và JAK/STAT chống lại sự lây nhiễm mầm bệnh ở động vật giáp xác hay không cần phải làm rõ. Ngoài khả năng miễn dịch dịch thể, động vật không xương sống còn dựa vào khả năng miễn dịch tế bào để thực hiện các chức năng miễn dịch bẩm sinh chống lại sự lây nhiễm mầm bệnh. Quá trình thực bào bởi tế bào máu là một trong những cơ chế quan trọng để miễn dịch tế bào chống lại nhiễm trùng mầm bệnh [24]. Các nghiên cứu trước đây đã phát hiện ra rằng quá trình tự thực qua trung gian FOXO là cần thiết để phát triển tế bào diệt tự nhiên (NK) [25]. Hơn nữa, FOXO còn tham gia vào việc thúc đẩy quá trình thực bào của vi khuẩn bằng bạch cầu trung tính [26]. Mặc dù không có tế bào miễn dịch chuyên biệt ở động vật giáp xác, chẳng hạn như tế bào NK hoặc bạch cầu trung tính, nhưng tế bào máu của tôm có thể phát huy khả năng miễn dịch bẩm sinh toàn thân chống lại nhiễm vi khuẩn gây bệnh thông qua quá trình thực bào [27]. Tuy nhiên, liệu FOXO có tham gia vào quá trình thực bào mầm bệnh của tế bào máu ở tôm hay không vẫn chưa rõ ràng. Nuôi tôm là một trong những ngành sản xuất protein động vật phát triển nhanh nhất thế giới và đã đóng góp đáng kể vào việc đáp ứng nhu cầu ngày càng tăng về protein động vật trên toàn thế giới. Hiện nay, sản lượng tôm toàn cầu đạt khoảng 4,88 triệu tấn với giá trị khoảng 39 tỷ USD [28]. Tuy nhiên, việc nuôi số lượng lớn động vật cùng nhau sẽ gây ra căng thẳng đáng kể cho động vật, tạo điều kiện thuận lợi cho mầm bệnh, bao gồm vi khuẩn và vi rút, nhân lên và gây bệnh lâm sàng, dẫn đến thiệt hại kinh tế lớn cho ngành [29]. Các nghiên cứu về cơ chế miễn dịch của tôm có thể cung cấp các chiến lược mới để phòng ngừa và kiểm soát dịch bệnh [30]. Trong nghiên cứu hiện tại, chúng tôi đã xác định được FOXO ở tôm kuruma (Marsupenaeus japonicus). Sau khi loại bỏ biểu hiện Foxo, tiếp theo thử thách Vibrio anguillarum, chúng tôi nhận thấy khả năng loại bỏ vi khuẩn và tỷ lệ sống của tôm giảm đáng kể. Nghiên cứu sâu hơn chỉ ra rằng FOXO đã thúc đẩy sự biểu hiện của AMP một cách trực tiếp hoặc gián tiếp và tăng cường quá trình thực bào của vi khuẩn ở tôm. Các cơ chế có thể có về tác dụng của FOXO chống lại sự lây nhiễm mầm bệnh ở tôm đã được phân tích.
cistanche tubulosa-cải thiện hệ thống miễn dịch
Kết quả
FOXO được biểu hiện ở mức cơ bản ở tôm không bị cảm nhiễm và được điều chỉnh tăng lên ở tôm cảm nhiễm với V. anguillarum
Từ trình tự phiên mã tế bào máu của M. japonicus, chúng tôi đã thu được trình tự cDNA có độ dài đầy đủ của Foxo (số gia nhập GenBank: MW080526). So sánh miền cho thấy protein FOXO được dự đoán có miền Forkhead (FH), tương tự như các FOXO của Homosapiens bao gồm FOXO1, FOXO3, FOXO4 và FOXO6, đồng thời có quá trình phosphoryl hóa AKT tương tự (Hình S1A). Kết quả phân tích phát sinh gen cho thấy FOXO được chia thành hai cụm bao gồm FOXO của động vật có xương sống và động vật không xương sống, còn FOXO tôm được tập hợp trong nhánh động vật không xương sống trong cây phát sinh gen (Hình S1B). Tương tự như FOXO của con người [31], tôm FOXO có các vị trí biến đổi quá trình phosphoryl hóa kinase (ERK) được điều hòa ngoại bào và các vị trí biến đổi acetyl hóa CREB Binding Protein (CBP), nhưng không có các vị trí biến đổi khử acetyl sir tuin 1 (SIRT1) và c-JUN N-terminal vị trí sửa đổi phosphoryl hóa kinase (JNK) (Hình S2). Các kháng thể đa dòng nhận biết tôm FOXO đã được điều chế bằng cách sử dụng miền FH tái tổ hợp của FOXO được biểu hiện ở Escherichia coli (Hình 1A). Phân tích sự phân bố FOXO trong mô ở mức độ mRNA và protein cho thấy rằng nó được biểu hiện trong tất cả các mô được thử nghiệm (Hình 1B). Quá trình biểu hiện FOXO theo thời gian trong tế bào máu và ruột của tôm bị nhiễm V. anguillarum được phân tích bằng qPCR và phương pháp Western blot. Kết quả cho thấy FOXO được điều hòa tăng cường trong tế bào máu và ruột ở cấp độ mRNA (Hình 1C và 1D) và ở cấp độ protein (Hình 1E và 1F). Những kết quả này cho thấy FOXO có liên quan đến phản ứng với nhiễm trùng V. anguillarum và thôi thúc chúng tôi khám phá chức năng của FOXO trong khả năng miễn dịch của tôm.
FOXO tham gia điều hòa cân bằng nội môi của huyết tán và hệ vi sinh đường ruột ở tôm khỏe mạnh
Để khám phá chức năng của FOXO trong quá trình cân bằng nội môi và tán huyết của hệ vi sinh vật đường ruột ở tôm, người ta đã thực hiện can thiệp RNA và phân tích tải lượng vi khuẩn. Kết quả cho thấy biểu hiện của Foxo giảm đáng kể ở tôm Foxo-RNAi (Hình 2A và 2B). Tác động ngoài mục tiêu của Foxo RNAi cũng được phân tích bằng cách phát hiện biểu hiện của các gen khác thuộc họ Fox (bao gồm Foxk2 và Foxn3). Kết quả cho thấy việc hạ gục Foxo không làm giảm mức độ biểu hiện của Foxk2 hoặc Foxn3 (Hình S3A–S3C). Sử dụng các xét nghiệm hóa mô miễn dịch huỳnh quang và phương pháp làm mờ phương Tây, chúng tôi đã quan sát thêm sự phân bố FOXO dưới tế bào trong ruột và tế bào máu của tôm bị vi khuẩn tấn công sau khi Foxo im lặng. Kết quả cho thấy so với nhóm dsGfp, mức FOXO trong nhân giảm đáng kể ở tôm Foxo-RNAi, ngay cả khi tôm bị nhiễm V. anguillarum (S3D–S4E' Figs). Tất cả các kết quả trên cho thấy rằng xét nghiệm Foxo RNAi của chúng tôi có thể vô hiệu hóa Foxo một cách đặc biệt trong tế bào máu và ruột (bao gồm cả trong tế bào chất và nhân). Tiếp theo, chúng tôi phân tích lượng vi khuẩn trong bạch huyết và ruột sau khi Foxo bị tiêu diệt ở tôm trong điều kiện bình thường (không có vi khuẩn). Kết quả cho thấy số lượng vi khuẩn trong máu và ruột tăng lên đáng kể sau khi biểu hiện Foxo bị tiêu diệt thành công (Hình 2C và 2D). Chúng tôi đã phân tích sâu hơn về tỷ lệ sống của tôm Foxo-RNAi khi không bị nhiễm khuẩn và kết quả cho thấy tỷ lệ sống của tôm Foxo-knockdown giảm đáng kể so với đối chứng (Hình 2E). Để xác minh thêm những kết quả này, chúng tôi đã phân tích tỷ lệ sống của tôm Foxo-RNAi được điều trị bằng kháng sinh và kết quả cho thấy so với nhóm DSGfp, tỷ lệ sống của tôm không có mầm bệnh giảm không đáng kể (Hình 2F). Tất cả các kết quả cho thấy FOXO đóng vai trò trong cân bằng nội môi của hệ vi sinh vật in vivo (bao gồm cả hệ vi sinh vật tan máu và đường ruột) ở tôm trong điều kiện bình thường.
lợi ích bổ sung cistanche-tăng khả năng miễn dịch
FOXO tham gia vào quá trình điều hòa tan máu và cân bằng nội môi hệ vi sinh đường ruột bằng cách thúc đẩy biểu hiện Relish và Amp ở tôm khỏe mạnh
Các nghiên cứu trước đây chứng minh rằng tôm khỏe mạnh chứa số lượng vi khuẩn thấp nhưng ổn định trong máu tuần hoàn và lượng vi khuẩn cao mặc dù không đổi trong đường tiêu hóa và các tác nhân miễn dịch, chẳng hạn như peptide kháng khuẩn (AMP) được điều chỉnh bởi yếu tố hạt nhân kappa B (NF). Con đường -κB) và các loại oxy phản ứng (ROS) được điều chỉnh bởi con đường oxydase kép (DUOX), đóng một vai trò thiết yếu trong việc cân bằng nội môi, tan máu và hệ vi sinh vật đường ruột [32–34]. Để khám phá cơ chế tham gia của FOXO trong việc điều hòa tan máu và cân bằng nội môi hệ vi sinh vật đường ruột trong điều kiện bình thường, trước tiên chúng tôi đã phát hiện sự phân bố FOXO dưới tế bào trong tế bào máu và ruột trong điều kiện bình thường. Kết quả cho thấy tín hiệu yếu của FOXO trong nhân tế bào máu và tế bào ruột tôm trong điều kiện bình thường (Hình 3A và 3B), cho thấy rằng một ít FOXO đã được kích hoạt bởi hệ vi sinh vật in vivo ở tôm trong điều kiện bình thường. Biểu hiện AMP được điều chỉnh bởi con đường IMD trong ruột của Drosophila [35]. Do đó, chúng tôi giả định rằng yếu tố phiên mã Relish có thể là gen mục tiêu của FOXO. Chúng tôi đã phát hiện biểu hiện mRNA của Relish, yếu tố phiên mã của con đường IMD, trong tế bào máu và ruột tôm sau khi Foxo bị đánh bại. Kết quả cho thấy biểu hiện Relish giảm đáng kể ở tôm Foxo-knockdown (Hình 3C và 3D), và kết quả tương tự cũng thu được ở mức protein (Hình 3E và 3E'). Kết quả cho thấy FOXO có thể thúc đẩy sự biểu hiện của Relish và kích hoạt con đường IMD. Để xác nhận rằng FOXO tham gia vào quá trình cân bằng nội môi trong đường tiêu hóa và bạch huyết thông qua tín hiệu IMD, người ta đã thu được tôm không có mầm bệnh (Hình 3F) và phát hiện thấy sự kích hoạt RELISH cũng như biểu hiện AMP. So với đối chứng, lượng FOXO và RELISH trong nhân tế bào ruột và tế bào máu giảm đáng kể (Hình 3G và 3H). Trong khi đó, sự biểu hiện của AMP, bao gồm Crustins (CrusI-2 đến 5) và các yếu tố kháng lipopolysaccharide (Alf A1, B1, C1, D1 và E1), có thể được điều chỉnh bởi FOXO và/hoặc RELISH đã được sàng lọc trong mầm bệnh -tôm tự do và kết quả cho thấy biểu hiện của CrusI-3, Alf-B1 và Alf-C1 giảm đáng kể trong tế bào máu và ruột của tôm (Hình 3I và 3J). Cho rằng sự biểu hiện của Alf-B1 và Alf C1 được điều chỉnh bằng con đường IMD [36], những kết quả này cho thấy FOXO tham gia vào quá trình điều hòa cân bằng nội môi của tan máu và đường tiêu hóa trong điều kiện bình thường thông qua con đường IMD để thúc đẩy sự biểu hiện của AMP.
Hình 1. FOXO được điều chỉnh tăng cường ở tôm bị cảm nhiễm bởi V. anguillarum. (A) Biểu hiện tái tổ hợp miền FH của FOXO trong E. coli và phương pháp làm mờ phương Tây để phát hiện FOXO bằng cách sử dụng kháng thể đa dòng chống lại FOXO được điều chế ở thỏ. Ngõ 1, tổng số protein của E. coli với Foxo-pGEX4T-1. Ngõ 2, tổng số protein của vi khuẩn sau khi cảm ứng IPTG. Ngõ 3, FOXO tái tổ hợp đã được tinh chế. Ngõ 4, FOXO trong ruột tôm chưa được xử lý được phát hiện bằng phương pháp Western blot. M, Chất đánh dấu khối lượng phân tử protein. (B) Sự phân bố mô của Foxo ở mức độ mRNA (bảng trên) và protein (bảng dưới) tương ứng được phát hiện bằng RT-PCR và phương pháp làm mờ phương Tây. ACTB là tên viết tắt của -actin. (C, D) Các mẫu biểu hiện mRNA của Foxo trong tế bào máu (C) và ruột (D) đã được qPCR phân tích bằng cách sử dụng biểu hiện trung bình hình học của -actin và Ef-1 làm gen kiểm soát nội sinh. (E, F) Các mẫu biểu hiện protein của FOXO trong tế bào máu (E) và ruột (F) được phát hiện bằng phương pháp làm mờ phương Tây. Kết quả phân tích thống kê của ba lần lặp lại được hiển thị ở bảng bên dưới. Các dải trên blot phía tây được số hóa bằng phần mềm ImageJ bằng cách quét các dải từ ba lần lặp độc lập. Mức biểu hiện tương đối của FOXO/-actin được biểu thị bằng giá trị trung bình ± SD và giá trị của tôm đối chứng được đặt là 1. Các thanh lỗi trong hình biểu thị SD (ba lần lặp).
FOXO được kích hoạt ở tôm nhờ thử thách V. anguillarum và tham gia vào quá trình thanh thải mầm bệnh trong máu và ruột
Có báo cáo cho rằng FOXO có thể được kích hoạt bằng sự kích thích của vi khuẩn hoặc cytokine và được chuyển vào nhân để điều chỉnh sự biểu hiện của một số gen mục tiêu ở động vật có vú [17]. Để phát hiện xem FOXO có được kích hoạt ở tôm bị vi khuẩn tấn công hay không, sự phân bố FOXO dưới tế bào trong ruột tôm được phân tích bằng phương pháp Western blot. Kết quả cho thấy lượng FOXO trong tế bào chất của tế bào ruột giảm dần từ 2 đến 4 giờ sau thử thách V. anguillarum (Hình 4A). Ngược lại, lượng FOXO trong nhân tế bào ruột tăng lên đáng kể sau khi nhiễm V. anguillarum (Hình 4B). Để phân tích vai trò của FOXO đối với khả năng miễn dịch toàn thân, xét nghiệm hóa mô miễn dịch huỳnh quang đã được sử dụng để quan sát sự chuyển vị trí hạt nhân của FOXO trong tế bào máu của tôm sau 2 giờ sau khi kích thích larum hàng năm. Chúng tôi nhận thấy rằng sự chuyển dịch FOXO vào nhân do vi khuẩn gây ra đã tăng lên đáng kể nhưng không có sự thay đổi rõ ràng ở tôm bị nhiễm PBS (Hình 4C và 4C'). Để tìm hiểu xem FOXO được chuyển vị hạt nhân có liên quan đến việc làm sạch mầm bệnh hay không, chúng tôi đã phân tích lượng vi khuẩn trong bạch huyết và ruột ở tôm bị tiêu diệt Foxo vào lúc 6 giờ sau khi thử thách vi khuẩn. Chúng tôi nhận thấy rằng sau khi Foxo bị hạ gục, lượng vi khuẩn trong máu và ruột tăng lên đáng kể so với nhóm đối chứng (Hình 4D). Hơn nữa, tỷ lệ sống của tôm Foxo-knockdown bị nhiễm V. anguillarum giảm đáng kể so với đối chứng (Hình 4E). Những kết quả này chỉ ra rằng FOXO đã được kích hoạt trong tế bào ruột và tế bào máu, đồng thời cho thấy FOXO tham gia vào các phản ứng miễn dịch tại chỗ và toàn thân chống lại nhiễm trùng do vi khuẩn.
Hình 2. FOXO tham gia vào các phản ứng miễn dịch kháng khuẩn ở đường ruột (cục bộ) và toàn thân. (A, B) Hiệu quả của Foxo-RNAi trong tế bào máu (A) và ruột (B) của tôm, được xác định bằng cách sử dụng qPCR (A) và Western blotting (B). Phân tích ngày qPCR sử dụng biểu thức trung bình hình học của -actin và Ef-1 làm gen kiểm soát nội sinh. Thanh lỗi hiển thị SD. (C) Phát hiện vi khuẩn tan máu của tôm Foxo-knockdown bằng nuôi cấy LB rắn (ba lần lặp lại); tiêm DSGfp đã được sử dụng làm đối chứng. Tỷ lệ pha loãng là 1:10. (D). Số lượng vi khuẩn trong bạch huyết và ruột ở tôm hạ gục Foxo và tôm tiêm DSGfp mà không có thách thức vi khuẩn. (Đ). Tỷ lệ sống của tôm Foxo-RNAi không bị nhiễm khuẩn. tiêm DSGfp đã được sử dụng làm đối chứng. (F). Tỷ lệ sống của tôm Foxo-RNAi được điều trị bằng kháng sinh. tiêm DSGfp đã được sử dụng làm đối chứng. Bình thường: tôm loại hoang dã không được điều trị bằng kháng sinh.
Hình 3. Một lượng FOXO cơ bản chuyển vào nhân của tế bào máu và tế bào ruột thúc đẩy sự biểu hiện của Relish và sau đó kích hoạt con đường IMD để điều hòa tan máu và cân bằng nội môi hệ vi sinh vật đường ruột trong điều kiện bình thường. (A) Hóa mô miễn dịch được sử dụng để phát hiện sự phân bố FOXO dưới tế bào trong tế bào máu của tôm bình thường. Thanh tỷ lệ=20 μm. Cy: Tế bào chất; Nu: Hạt nhân. (B) Phương pháp Western blot được sử dụng để phát hiện sự phân bố FOXO dưới tế bào trong tế bào ruột của tôm bình thường và tôm bị nhiễm V. anguillarum. (C) Sự biểu hiện của Relish ở mức độ mRNA đã được phát hiện trong tế bào máu của tôm sau khi qPCR đánh bại Foxo bằng cách sử dụng biểu hiện trung bình hình học của -actin và Ef-1 làm gen kiểm soát nội sinh. (D) Biểu hiện của Relish ở cấp độ mRNA trong ruột tôm sau khi Foxo bị đánh bại đã được qPCR phát hiện bằng cách sử dụng biểu hiện trung bình hình học của -actin và Ef-1 làm gen kiểm soát nội sinh. (E) Mức độ RELISH được phát hiện bằng cách sử dụng phương pháp Western blot ở tôm sau khi Foxo bị đánh bại. (E') Ba bản sao của bảng E đã được số hóa bằng phần mềm ImageJ. (F) Tải lượng vi khuẩn gây tan máu và ruột ở tôm sau 24 giờ điều trị bằng kháng sinh. (G) FOXO trong nhân được phát hiện bằng phương pháp Western blot trong tế bào máu và ruột tôm sau 24 giờ xử lý bằng kháng sinh. (H) RELISH trong nhân được phát hiện bằng cách sử dụng phương pháp Western blot trong tế bào máu và ruột tôm vào lúc 24 giờ sau khi điều trị bằng kháng sinh. (I, J) Sự biểu hiện của Amps trong tế bào máu (I) và ruột (J) của tôm không mầm bệnh được xác định bằng qPCR bằng cách sử dụng -actin và Ef-1 làm gen tham chiếu nội bộ. Tôm bình thường (tiêm H2O) được sử dụng làm đối chứng.
Các nghiên cứu trước đây chỉ ra rằng hoạt động phiên mã FOXO được điều chỉnh bằng sự biến đổi quá trình phosphoryl hóa và AKT serine/threonine kinase điều chỉnh hoạt động của các yếu tố phiên mã Forkhead bằng cách phosphoryl hóa chúng và ức chế sự chuyển vị không rõ ràng của chúng [9,37]. Để tìm hiểu xem liệu sự gia tăng FOXO trong nhân sau khi nhiễm vi khuẩn gây bệnh có bị ảnh hưởng bởi AKT hay không, trước tiên chúng tôi đã phát hiện hàm lượng FOXO trong tế bào chất và nhân bằng phương pháp làm mờ vết rạn da sau khi đánh bại Akt của tôm. Kết quả cho thấy lượng FOXO trong nhân tế bào máu và tế bào ruột tăng đáng kể sau khi giảm biểu hiện Akt (Hình 5A và 5B) ở tôm sau 2 giờ bị nhiễm V. anguillarum (Hình 5C và 5C'). Để xác minh kết quả thí nghiệm, chúng tôi cũng sử dụng xét nghiệm hóa mô miễn dịch để quan sát sự phân bố FOXO dưới tế bào trong tế bào máu của tôm sau khi Akt bị phân hủy. Kết quả cho thấy FOXO đã tăng lên đáng kể trong nhân tế bào máu khi Akt bị tiêu diệt 2 giờ sau khi nhiễm V. anguillarum (Hình 5D và 5D'). Để tìm hiểu xem việc nhiễm mầm bệnh có ảnh hưởng đến hoạt động của AKT hay không, chúng tôi đã phát hiện sự thay đổi phosphoryl hóa của AKT sau khi nhiễm mầm bệnh bằng cách sử dụng kháng thể p-AKT (Ser473) của người (vị trí Phosphoryl hóa của tôm AKT là Ser486) và nhận thấy rằng mức độ AKT phosphoryl hóa giảm đáng kể trong tế bào máu và ruột tôm sau 30 phút nhiễm V. anguillarum (Hình 5E và 5F). Những kết quả này cho thấy rằng việc nhiễm mầm bệnh có thể làm giảm mức độ AKT bị phosphoryl hóa, chất này ức chế hoạt động của enzyme và làm giảm khả năng AKT phosphoryl hóa FOXO. FOXO không bị phosphoryl hóa đi vào nhân và gây ra sự biểu hiện của gen mục tiêu. hình biểu thị SD.
chiết xuất cistanche
Nhiễm mầm bệnh làm giảm hoạt động của AKT và gây ra sự chuyển vị hạt nhân FOXO
FOXO phát huy khả năng phòng vệ miễn dịch chống lại vi khuẩn xâm nhập bằng cách điều chỉnh sự biểu hiện của peptide kháng khuẩn ở tôm bị nhiễm vi khuẩn
Để khám phá cơ chế mà FOXO ảnh hưởng đến phản ứng chống nhiễm trùng vi khuẩn ở tôm, trước tiên chúng tôi xác định các gen tác động miễn dịch do FOXO điều chỉnh. Sau khi tiêu diệt thành công Foxo trong tế bào máu và ruột tôm có hoặc không có thử thách V. anguillarum, mức độ biểu hiện của CrusI-3, Alf-B1, Alf-C1 và Alf-E1 đã giảm đáng kể ở tôm im lặng so với với những người trong nhóm đối chứng (Hình 6A và 6B). Để xác minh thêm kết quả, chúng tôi cũng đã phát hiện biểu hiện của bốn AMP sau khi Akt bị hạ gục. Kết quả cho thấy biểu hiện của bốn AMP tăng đáng kể sau 6 giờ nhiễm V. anguil larum so với biểu hiện ở nhóm đối chứng (Hình 6C và 6D). So với các AMP được điều hòa tăng (bao gồm Alf-B1 và Alf-C1) trong điều kiện bình thường (Hình 3I và 3J), gen bổ sung của AMP (CrusI-3, Alf-E1) cũng được điều hòa tăng ở tôm bị nhiễm V anguillarum (Hình 6A và 6B). Nghiên cứu trước đây của chúng tôi chỉ ra rằng RELISH đã thúc đẩy sự biểu hiện của Alf-B1 và Alf-C1 ở tôm [36]. Những kết quả này chỉ ra rằng FOXO có thể điều chỉnh trực tiếp biểu thức AMP, chẳng hạn như CrusI-3 và Alf-E1, độc lập với đường dẫn tín hiệu IMD. Để xác nhận giả thuyết, xét nghiệm ChIP đã được thực hiện để phát hiện xem FOXO có thể liên kết với chất kích thích Alf-E1 hay không. Trình tự khởi đầu của Alf-E1 đã thu được (Hình S4) và các vị trí gắn kết FOXO đã được dự đoán (Hình 6E). Kết quả ChIP cho thấy FOXO có thể liên kết với chất kích thích Alf-E1 (Hình 6F). Những kết quả này cho thấy FOXO cũng tham gia vào khả năng miễn dịch kháng khuẩn bằng cách điều chỉnh trực tiếp sự biểu hiện của AMP ở tôm.
Hình 4. FOXO chuyển vào nhân của tôm bị V. anguillarum gây cảm nhiễm. (A, B) Các kiểu phân bố FOXO trong tế bào chất (A) và nhân (B) của tế bào ruột tôm bị vi khuẩn tấn công, như được phân tích bằng phương pháp Western blot (tấm A và B phía dưới). Các dải vết phía tây được số hóa bằng phần mềm ImageJ bằng cách quét các dải từ ba lần lặp lại. Mức biểu hiện tương đối của FOXO/-actin hoặc FOXO/Histone 3 được biểu thị dưới dạng trung bình ± SD và giá trị của tôm đối chứng được đặt là một. (C) Sự chuyển vị trí hạt nhân của FOXO trong tế bào máu của tôm 2 giờ sau V. anguillarum được phát hiện bằng cách sử dụng xét nghiệm hóa mô miễn dịch huỳnh quang. Tiêm PBS đã được sử dụng như một biện pháp kiểm soát. Thanh tỷ lệ=20 μm. (C') Phân tích thống kê của bảng C Sự tập trung của các hạt nhân nhuộm FOXO và DAPI trong tế bào máu được phân tích bằng phần mềm WCIF ImageJ. (D) Số lượng vi khuẩn trong máu và ruột của tôm Foxo-knockdown sau khi tiêm V. anguillarum; Tiêm dsGfp vào tôm sau khi tiêm vi khuẩn được sử dụng làm đối chứng. (E) Tỷ lệ sống của tôm Foxo-RNAi bị nhiễm V. anguillarum. tiêm DSGfp đã được sử dụng làm đối chứng.
FOXO thúc đẩy quá trình thực bào của tế bào máu chống lại vi khuẩn bằng cách thúc đẩy biểu hiện SRC
Các nghiên cứu trước đây đã báo cáo rằng FOXO tương tác trực tiếp với các vùng khởi động của CXCR2 và CD11b để điều chỉnh quá trình thực bào của bạch cầu trung tính ở động vật có vú [26]. Để kiểm tra xem FOXO có liên quan đến quá trình thực bào tế bào máu trong khả năng miễn dịch kháng khuẩn của tôm hay không, chúng tôi đã kiểm tra tỷ lệ thực bào sau khi can thiệp với Foxo bằng các phương pháp khác nhau. Sau khi Foxo bị tiêu diệt, tỷ lệ thực bào và chỉ số thực bào của nhóm tiêu diệt Foxo thấp hơn đáng kể so với nhóm đối chứng (dsGfp) (Hình 7A và 7A'). Chúng tôi cũng sử dụng phương pháp tế bào học dòng chảy để định lượng tốc độ thực bào của tế bào máu sau khi Foxo im lặng. Kết quả cho thấy tốc độ tế bào thực khuẩn của nhóm Foxo-RNAi cũng giảm đáng kể so với nhóm DSGfp (Hình 7B và 7B'). Để xác thực thêm những kết quả này, chúng tôi cũng đã kiểm tra tỷ lệ thực bào sau khi Akt bị hạ gục. Kết quả cho thấy so với nhóm đối chứng, tỷ lệ thực bào và chỉ số thực bào tăng lên đáng kể (Hình 7C và 7C'). Những kết quả này cho thấy FOXO thúc đẩy quá trình thực bào tế bào máu ở tôm. Để khám phá cách FOXO tăng cường khả năng thực bào tế bào máu ở tôm, chúng tôi đã phát hiện biểu hiện của các gen được báo cáo trước đây liên quan đến quá trình thực bào của tôm. Thụ thể nhặt rác loại B (SRB) và loại C (SRC) được báo cáo là có liên quan đến quá trình thực bào tế bào máu [38,39]. Chúng tôi thấy rằng mức độ biểu hiện mRNA của Src, chứ không phải Srb, giảm đáng kể sau khi Foxo im lặng trong tế bào máu và ruột (Hình 7D và 7E), trong khi biểu hiện của Src tăng đáng kể sau khi phân hủy Akt ở tôm (Hình 7F). Kết quả tương tự cũng thu được ở mức protein (Hình 7G và 7G'). Những kết quả này cho thấy FOXO thúc đẩy quá trình thực bào tế bào máu của mầm bệnh ở tôm bằng cách thúc đẩy biểu hiện SRC.
FOXO thúc đẩy sự biểu hiện RAB5 và RAB7 trong quá trình thực bào ở tôm
Các nghiên cứu trước đây đã chỉ ra rằng các GTPase nhỏ, RAB5 và RAB7, là những yếu tố điều chỉnh chính cho việc vận chuyển các túi mới được nội bào đến nội nhũ sớm và muộn [40]. RAB5 là yếu tố điều chỉnh chính của các sự kiện hợp nhất ban đầu và là dấu hiệu của các nội nhũ sớm [41,42]. RAB7 cần thiết cho phản ứng tổng hợp phagosome-lysosome muộn và là dấu hiệu của các nội nhũ muộn [43]. Để tìm hiểu xem RAB5 và RAB7 có liên quan đến việc loại bỏ mầm bệnh ở tôm hay không, trước tiên chúng tôi đã phân tích các kiểu biểu hiện của Rab5 và Rab7 và phát hiện ra rằng hai GTPase nhỏ đã được điều hòa ở tôm bị nhiễm vi khuẩn (S5A–S5D Fig). Chúng tôi đã phân tích thêm tỷ lệ sống sót của tôm Rab5-RNAi và Rab7-RNAi sau thử thách vi khuẩn và kết quả cho thấy tỷ lệ sống sót của tôm bị loại Rab5 và Rab7 giảm đáng kể so với đối chứng ( Hình S5E và S5F). Những kết quả này cho thấy RAB5 và RAB7 đóng vai trò quan trọng trong việc kháng lại mầm bệnh vi khuẩn. Để tìm hiểu xem RAB5 và RAB7 có liên quan đến quá trình thực bào qua trung gian FOXO hay không, chúng tôi đã kiểm tra mức độ biểu hiện mRNA của Rab5 và Rab7 sau khi can thiệp vào biểu hiện Foxo ở tôm. Kết quả cho thấy mức độ biểu hiện của Rab5 và Rab7 giảm đáng kể trong tế bào máu và ruột (Hình 8A và S6A). trong khi đó biểu hiện của Rab5 và Rab7 tăng lên đáng kể sau khi Akt bị loại bỏ ở tôm (Hình 8B). Để xác nhận thêm kết quả trên, hàm lượng protein RAB5 và RAB7 trong tôm phân loại Foxo hoặc Akt cũng được phát hiện. So với nhóm tiêm DSGfp, nồng độ RAB5 và RAB7 cũng giảm đáng kể trong tế bào máu và ruột ở tôm Foxo-knockdown nhưng tăng đáng kể ở tôm Akt-knockdown lúc 2 giờ sau khi bị V. anguillarum kích thích (Figs 8C–8D'; S6B và S6B'). Những kết quả này cho thấy RAB5 và RAB7 tham gia vào quá trình tế bào thực khuẩn qua trung gian FOXO của tế bào máu ở tôm. Chúng tôi còn phát hiện thêm rằng RAB5 và RAB7 cùng định vị với V. anguillarum trong tế bào máu của tôm (Hình 9). Kết hợp lại với nhau, các kết quả cho thấy RAB5 và RAB7 có liên quan đến quá trình thực bào qua trung gian FOXO ở tôm.
Hình 5. Nhiễm mầm bệnh làm giảm hoạt động của AKT, thúc đẩy sự chuyển vị hạt nhân FOXO trong tế bào máu và tế bào ruột của tôm. (A, B) Hiệu quả của Akt-RNAi trong tế bào máu và ruột của tôm, được xác định bằng qPCR bằng cách sử dụng biểu thức trung bình hình học của -actin và Ef-1 làm gen kiểm soát nội sinh (A) và vết rạn da phương Tây (B). (C) Lượng FOXO trong tế bào chất và nhân ruột của tôm Akt-knockdown được phân tích bằng phương pháp Western blot. dsGfp đã được sử dụng làm đối chứng. (C') Phân tích thống kê của bảng (C). Phần mềm ImageJ đã được sử dụng để số hóa các dải bằng cách quét các hình ảnh lặp lại ba lần. (D) Sự chuyển vị trí hạt nhân của FOXO trong tế bào máu của tôm Akt-knockdown được phát hiện 2 giờ sau thử thách V. anguillarum bằng cách sử dụng xét nghiệm hóa mô miễn dịch huỳnh quang. dsGfp đã được sử dụng làm đối chứng. Thanh tỷ lệ=20 μm. (D') Phân tích thống kê của (D). Phần mềm WCIF ImageJ đã được sử dụng để phân tích quá trình đồng địa hóa theo tỷ lệ cường độ huỳnh quang của hạt nhân chống FOXO (màu xanh lá cây) và hạt nhân nhuộm DAPI (màu xanh) trong tế bào máu sau khi sửa giá trị phơi nhiễm. (E, F) Sự thay đổi hàm lượng AKT phosphoryl hóa (p-AKT) trong tế bào máu (E) và ruột (F) của tôm bị nhiễm V. anguillarum. Các bảng phía dưới là các số liệu được số hóa của (E) và (F) dựa trên các dải phân tích thống kê và làm mờ phương Tây tương ứng.
Trà Cistanche
Cuộc thảo luận
FOXO, với tư cách là một yếu tố phiên mã rất quan trọng, tham gia vào nhiều chức năng sinh lý và trao đổi chất [44,45]. Trong nghiên cứu hiện tại, chúng tôi đã xác định được FOXO từ tôm (M. japonicus) và phát hiện ra rằng nó tham gia vào quá trình điều hòa cân bằng nội môi của hệ vi sinh vật đường ruột và tan máu bằng cách điều chỉnh biểu hiện AMP trong điều kiện bình thường. FOXO có thể được kích hoạt do nhiễm vi khuẩn ở tôm và di chuyển vào nhân, nơi nó điều chỉnh trực tiếp và gián tiếp (bằng con đường IMD) sự biểu hiện của AMP. FOXO điều chỉnh tăng biểu hiện của các gen liên quan đến quá trình thực bào, chẳng hạn như SRC và GTPase nhỏ, RAB5 và RAB7, để thúc đẩy quá trình thực bào tế bào máu chống lại mầm bệnh. Do đó, FOXO của tôm đóng các vai trò khác nhau trong các phản ứng miễn dịch toàn thân và cục bộ (đường ruột) chống lại mầm bệnh (Hình 10). So với FOXO của con người, FOXO của tôm có trình tự axit amin và vị trí phosphoryl hóa AKT tương đối được bảo tồn; tuy nhiên, vị trí phosphoryl hóa AKT thứ hai của tôm FOXO là threonine thay vì serine. Sự phosphoryl hóa AKT của FOXO kiểm soát sự vận chuyển FOXO trong hạt nhân và tế bào chất [9]. Trong nghiên cứu này, chúng tôi thấy rằng AKT có liên quan đến việc kiểm soát sự xâm nhập hạt nhân của FOXO. Sau khi nhiễm V. anguillarum, mức AKT phosphoryl hóa giảm đáng kể, điều này cho thấy hoạt động AKT đã giảm ở tôm bị nhiễm mầm bệnh, do đó làm tăng khả năng lưu giữ hạt nhân hoặc chuyển vị hạt nhân của FOXO, và sau đó tạo ra sự biểu hiện của gen mục tiêu, chẳng hạn như Relish và Amp, để chống lại sự lây nhiễm mầm bệnh. Các nghiên cứu trước đây đã phát hiện ra rằng FOXO tham gia vào quá trình cân bằng nội môi của hệ vi sinh vật đường ruột Drosophila bằng cách ức chế sự biểu hiện của protein nhận biết peptidoglycan SC2 (chất điều hòa âm tính của con đường IMD) để kích hoạt con đường biểu hiện AMP [14]. RELISH đã được báo cáo là gen mục tiêu chính của FOXO trong việc kiểm soát khả năng chịu đựng tình trạng thiếu oxy ở Drosophila [46]. Giống như các động vật khác, đường tiêu hóa của tôm chứa hệ vi sinh vật tương đối cao và ổn định. Bằng chứng ngày càng tăng cũng tiết lộ rằng bạch huyết của một số động vật không xương sống khỏe mạnh dưới nước, bao gồm cả tôm cũng chứa một lượng vi khuẩn ổn định [47]. Nghiên cứu trước đây của chúng tôi cho thấy rằng lectin loại C tham gia vào quá trình điều hòa cân bằng nội môi của hệ vi sinh vật tan máu bằng cách duy trì sự biểu hiện của AMP [34], nhưng chúng tôi không biết đường dẫn tín hiệu nào liên quan đến việc điều chỉnh biểu hiện AMP. Ở đây, kết quả của chúng tôi cho thấy FOXO có liên quan đến việc điều hòa quá trình cân bằng nội môi và tan máu của hệ vi sinh vật đường ruột thông qua tín hiệu IMD trong điều kiện bình thường. Ở tôm không bị nhiễm bệnh, việc tiêu diệt Foxo dẫn đến biểu hiện Relish giảm đáng kể và tỷ lệ sống của tôm giảm đáng kể, ngay cả khi không bị nhiễm vi khuẩn. Chúng tôi cũng tìm thấy một lượng nhỏ FOXO trong nhân tế bào tôm bình thường. Do đó, chúng tôi nghĩ rằng FOXO tham gia vào quá trình điều hòa cân bằng nội môi của bệnh tan máu và hệ thực vật đường ruột trong điều kiện bình thường bằng cách thúc đẩy biểu hiện Relish và sau đó tăng cường biểu hiện AMP bằng con đường IMD. Những kết quả này cho thấy FOXO tham gia vào quá trình miễn dịch tại chỗ và toàn thân để thúc đẩy cân bằng nội môi hệ vi sinh vật của bệnh tan máu và đường tiêu hóa ở tôm. Miễn dịch dịch thể đóng một vai trò quan trọng trong khả năng chống lại sự lây nhiễm mầm bệnh với tỷ lệ nghịch đảo thông qua việc sản xuất pin AMP [21,48]. Phản ứng dịch thể bao gồm sự tổng hợp và bài tiết cảm ứng của AMP, được giải phóng vào bạch cầu dưới dạng phản ứng hệ thống hoặc giải phóng lên bề mặt biểu bì hoặc khoang của đường tiêu hóa như một phản ứng cục bộ [19]. Biểu hiện AMP chủ yếu được điều chỉnh bởi các đường truyền tín hiệu Toll/Dif và IMD/Relish ở ruồi giấm [49]. Hiện tại, một số họ AMP đã được xác định ở tôm, bao gồm lớp vỏ, các yếu tố kháng lipopolysaccharide (Alfs) và penaeidin [50]. Nghiên cứu hiện tại cho thấy FOXO có thể trực tiếp hoặc gián tiếp (thông qua tín hiệu IMD/Relish) điều chỉnh biểu hiện của AMP, bao gồm CrusI-3, Alf-B1, Alf-C1 và Alf-E1. Chúng tôi nghĩ rằng mức độ kích hoạt thấp FOXO trong tế bào máu và ruột của tôm trong điều kiện bình thường có thể điều chỉnh gen mục tiêu chính của Foxo, tức là Relish, để duy trì cân bằng nội môi của hệ vi sinh vật in vivo. Trong quá trình lây nhiễm, mầm bệnh xâm nhập sẽ kích hoạt FOXO, hầu hết chúng được chuyển vào nhân, nơi nó điều hòa nhiều gen mục tiêu hơn, bao gồm một số AMP, chẳng hạn như Alf-E1 và CrusI-3, ngoài Relish. Khi kết hợp với nhau, FOXO tham gia vào việc điều hòa quá trình cân bằng nội môi của hệ vi sinh vật đường ruột và tan máu ở tôm khỏe mạnh thông qua việc kích hoạt tín hiệu IMD ở mức cơ bản trong hệ thống tan máu và đường tiêu hóa. Nhiễm mầm bệnh kích hoạt FOXO bằng cách giảm hoạt động AKT và thúc đẩy sự biểu hiện của AMP trực tiếp và gián tiếp trong khả năng miễn dịch hệ thống và miễn dịch tại chỗ (ruột). Thực bào là một hiện tượng qua trung gian thụ thể, phụ thuộc vào Actin và ATP, được kích hoạt bởi sự liên kết của các hạt hoặc mầm bệnh với các thụ thể màng tế bào cụ thể và thể hiện một quá trình miễn dịch quan trọng mà qua đó vật chủ có thể tự bảo vệ mình khỏi mầm bệnh [24]. Các GTPase nhỏ, chẳng hạn như RAB5 và RAB7, có liên quan đến việc tiếp tục tái cấu trúc màng và lưu thông túi tinh trong quá trình thực bào. Nghiên cứu trước đây của chúng tôi đã báo cáo rằng các thụ thể nhặt rác SRB và SRC có liên quan đến quá trình thực bào tế bào máu như các thụ thể ở tôm [38,39]. Trong nghiên cứu hiện tại, chúng tôi nhận thấy rằng sau khi Foxo bị đánh bại, biểu hiện Src giảm rõ rệt và tỷ lệ thực bào tế bào máu giảm đáng kể, cho thấy Src là gen mục tiêu của FOXO và FOXO có liên quan đến quá trình thực bào qua trung gian SRC của vi khuẩn gây bệnh. FOXO cũng có thể thúc đẩy sự biểu hiện của hai GTPase nhỏ là RAB5 và RAB7. Những GTPase nhỏ này tham gia vào quá trình vận chuyển tuần tự và là yếu tố chính quyết định các phagosome sớm và muộn [51]. Các phagosome di chuyển từ ngoại vi tế bào đến vùng nội bào, với RAB5 được thay thế bằng RAB7 trong quá trình vận chuyển và hàng hóa cuối cùng được vận chuyển đến lysosome để phân hủy [52,53]. Chúng tôi cũng phát hiện ra rằng RAB5 và RAB7 có thể cùng định vị với các mầm bệnh trong tế bào máu, điều này cho thấy rằng các mầm bệnh đã bị thực bào bởi các tế bào máu ở tôm bằng cách đi qua các phagosome sớm và muộn trước khi bị phân hủy trong lysosome. Do đó, FOXO tham gia vào phản ứng miễn dịch tế bào bằng cách thúc đẩy quá trình thực bào của tế bào máu. Tóm lại, kết quả của chúng tôi chỉ ra rằng FOXO không chỉ tham gia vào quá trình điều hòa cân bằng nội môi của hệ vi sinh vật trong điều kiện bình thường mà còn tham gia vào việc loại bỏ vi khuẩn gây bệnh ở tôm bị nhiễm bệnh bằng cách thúc đẩy sự biểu hiện của AMP và quá trình thực bào của tế bào máu.
Hình 6. FOXO thực hiện vai trò kháng khuẩn ở tôm bằng cách điều chỉnh sự biểu hiện của AMP. (A, B) Sự biểu hiện của Amps trong tế bào máu (A) và ruột (B) của tôm Foxo-knockdown, được xác định bởi qPCR bằng cách sử dụng biểu hiện trung bình hình học của -actin và Ef-1 làm gen kiểm soát nội sinh; tiêm dsGfp vào tôm được sử dụng làm đối chứng. Dữ liệu được phân tích thống kê bằng thử nghiệm Mann-Whiteny U. (C, D) Sự biểu hiện của Amps trong tế bào máu (C) và ruột (D) của tôm hạ gục Akt được phân tích bằng qPCR bằng cách sử dụng biểu hiện trung bình hình học của -actin và Ef-1 làm gen kiểm soát nội sinh; tiêm dsGfp vào tôm được sử dụng làm đối chứng. Sự khác biệt đáng kể đã được phân tích bằng ANOVA một chiều. ( E ) Sơ đồ các vị trí liên kết được dự đoán của FOXO trên bộ khởi động Alf-E1. (F) ChIP và RT-PCR được sử dụng để phát hiện liên kết FOXO với trình tự khởi động Alf-E1 bằng cách sử dụng các đoạn mồi (Alf-E{14}}F và Alf-E1-R, Bảng 1). RT-PCR cũng được sử dụng để khuếch đại vùng mã hóa của Alf-E1 bằng các đoạn mồi RT-PCR (Alf-E1-RT-F và Alf-E1-RT-R. Bảng 1) bằng ChIP thu được DNA làm khuôn mẫu. Kháng thể IgG được sử dụng làm đối chứng và đoạn khuếch đại DNA bộ gen bình thường được sử dụng để xác nhận dải mục tiêu.
Hình 7. FOXO tăng cường quá trình thực bào tế bào máu của mầm bệnh ở tôm bằng cách thúc đẩy biểu hiện SRC. (A) Quá trình thực bào tế bào máu của V. anguillarum được quan sát bằng xét nghiệm hóa mô miễn dịch huỳnh quang dưới kính hiển vi huỳnh quang. V. anguillarum được dán nhãn FITC (màu xanh lá cây) và nhân tế bào được nhuộm bằng DAPI (màu xanh). Mũi tên màu đỏ chỉ các tế bào máu thực bào. Thanh tỷ lệ=20 μm. (A') Phân tích thống kê về tỷ lệ thực bào và chỉ số thực bào ở tôm Foxo-knockdown. Nhóm tiêm DSGfp được sử dụng làm đối chứng. Năm trăm tế bào máu được đếm dưới kính hiển vi huỳnh quang trong mỗi thí nghiệm. Dữ liệu được phân tích thống kê bằng cách sử dụng bài kiểm tra t của Sinh viên. (B) Quá trình thực bào vi khuẩn bằng tế bào máu được phân tích bằng phương pháp tế bào học dòng chảy. Các tế bào máu chứa vi khuẩn được thực bào (R2) được tách khỏi các tế bào máu không được thực bào (R3) dựa trên tín hiệu huỳnh quang của vi khuẩn được đánh dấu trong tế bào máu bằng phần mềm IDEAS Application v6.0. (B') Tốc độ thực bào của tế bào máu dựa trên dữ liệu tế bào học dòng chảy. Ba nghìn tế bào máu được tính cho mỗi phân tích và ba lần lặp lại được thực hiện. Nhóm DSGfp được sử dụng làm đối chứng. (C) Quan sát quá trình thực bào tế bào máu của V. anguillarum ở tôm sú Akt dưới kính hiển vi huỳnh quang. Thanh tỷ lệ=10 μm. (C') Phân tích thống kê về tỷ lệ thực bào và chỉ số thực bào dựa trên dữ liệu trong bảng (C). (D) Mức độ biểu hiện mRNA của Srb và Src trong tế bào máu từ tôm phân hủy Foxo được phân tích bằng qPCR bằng cách sử dụng biểu hiện trung bình hình học của -actin và Ef-1 làm gen kiểm soát nội sinh. tiêm DSGfp đã được sử dụng làm đối chứng. (E) Biểu hiện mRNA của Srb và Src trong ruột của tôm Foxo-RNAi được phân tích bằng qPCR bằng cách sử dụng biểu hiện trung bình hình học của -actin và Ef-1 làm gen kiểm soát nội sinh. (F) Biểu hiện mRNA của Src trong tế bào máu của tôm Akt-RNAi được phân tích bằng qPCR bằng cách sử dụng biểu hiện trung bình hình học của -actin và Ef-1 làm gen kiểm soát nội sinh. (G) Mức protein của SRC trong tế bào máu của tôm Foxo-RNAi hoặc Akt-RNAi, được phân tích bằng phương pháp Western blot. tiêm DSGfp được sử dụng làm đối chứng. (G') Phân tích thống kê dựa trên dữ liệu của ba lần lặp lại bảng (G).
Nguyên liệu và phương pháp
Chuẩn mực đạo đức
Tất cả các thí nghiệm trên động vật được thực hiện tuân thủ Chỉ thị Quốc gia Trung Quốc (GB 14922.2–2011 và GB 14925–2010). Các thí nghiệm trên thỏ để điều chế kháng thể trong nghiên cứu được thực hiện theo các quy trình đã được phê duyệt bởi Ủy ban Chăm sóc & Phúc lợi Động vật tại Trường Khoa học Đời sống thuộc Đại học Sơn Đông (SYDWLL-2021-54). Việc phê duyệt theo quy định về sử dụng tôm trong nghiên cứu của chúng tôi là không cần thiết vì nghiên cứu của chúng tôi sử dụng một số lượng hạn chế tôm thông thường được cộng đồng rộng rãi tiêu thụ.
Động vật
Tôm khỏe mạnh (Marsupenaeus japonicus), nặng khoảng 6–10 g mỗi con, được mua từ chợ thủy sản ở Thanh Đảo, tỉnh Sơn Đông, Trung Quốc. Trước khi thí nghiệm, tôm được nuôi ít nhất 1 ngày trong hệ thống nuôi tôm với nước biển có ga ở 23–25˚C để thích nghi với môi trường mới.
Hình 8. RAB5 và RAB7 tham gia vào quá trình thực bào tế bào máu qua trung gian FOXO ở tôm. (A, B) qPCR được sử dụng để phân tích mức độ biểu hiện mRNA của Rab5 và Rab7 trong tế bào máu của tôm Foxo-knockdown (A) và tôm Akt-knockdown (B) có và không bị nhiễm vi khuẩn. QPCR sử dụng biểu hiện trung bình hình học của -actin và Ef-1 làm gen kiểm soát nội sinh. (C) Nồng độ protein của RAB5 và RAB7 trong tế bào máu của tôm Foxo-knockdown lúc 2 giờ sau thử thách V. anguillarum được xác định bằng phương pháp Western blot. (C') Phân tích thống kê dựa trên dữ liệu của ba lần lặp lại bảng (C). (D) Nồng độ protein của RAB5 và RAB7 trong tế bào máu của tôm Akt-knockdown lúc 2 giờ sau thử thách V. anguillarum được xác định bằng phương pháp Western blot. (D') Phân tích thống kê dựa trên dữ liệu của ba lần lặp lại bảng (D).
Phân tích tin sinh học
Trình tự cDNA có độ dài đầy đủ của Foxo được lấy từ trình tự tome phiên mã tế bào máu và ruột của M. japonicus (BGI, Thâm Quyến, Trung Quốc). Khung đọc mở (ORF) của Foxo được khuếch đại bằng cách sử dụng cặp mồi (Foxo-EX-F và Foxo-EX-R; Bảng 1) để xác nhận trình tự. CDNA tương ứng đã được dịch về mặt khái niệm để thu được chuỗi protein được suy ra bằng công cụ ExPASy-Translation (//cn.Exasy.org/). Phân tích độ tương tự được thực hiện bằng BLAST (//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi/) và dự đoán kiến trúc miền được thực hiện bằng SMART (//smart.emblheidelberg.de). Cây phát sinh loài của FOXO từ các loài khác nhau đã được xây dựng bằng chương trình MEGA 6.0 [54].
Hình 9. RAB5 và RAB7 cùng định vị với V. anguillarum. Sự đồng địa hóa của RAB5 và RAB7 với FITC được dán nhãn-V. anguillarum trong tế bào máu của tôm, được phân tích bằng xét nghiệm hóa mô miễn dịch huỳnh quang. Vi khuẩn được dán nhãn FITC (màu xanh lá cây) và tiêm vào tôm. Tế bào máu được thu thập từ năm con tôm lúc 30 phút và 1 giờ sau khi tiêm vi khuẩn và ủ với kháng thể kháng RAB5 hoặc kháng RAB7. Kháng thể thứ cấp là kháng thể IgG Alexa-546 (màu đỏ). Hạt nhân được nhuộm bằng DAPI (màu xanh). Đồng địa hóa trong tế bào máu được biểu thị bằng mũi tên trắng. Thanh tỷ lệ=10 μm.
Hình 10. Sơ đồ biểu diễn sự tham gia của FOXO vào khả năng miễn dịch bẩm sinh cục bộ và toàn thân ở tôm. (A) Trong điều kiện không bị nhiễm trùng, FOXO duy trì sự cân bằng nội môi của tan máu và hệ vi sinh vật đường ruột bằng cách thúc đẩy Relish và sau đó biểu hiện AMP. (B) Trong điều kiện bị nhiễm bệnh, quá trình phosphoryl hóa AKT bị giảm do nhiễm mầm bệnh, dẫn đến hàm lượng FOXO trong nhân tăng lên. FOXO trực tiếp thúc đẩy sự biểu hiện của Relish và AMP để loại bỏ mầm bệnh xâm lấn; mặt khác, FOXO thúc đẩy quá trình thực bào của mầm bệnh thông qua con đường thực bào qua trung gian SRC.
Thử thách vi khuẩn và thu thập mẫu
Vibrio anguillarum (ATCC 43305) lấy từ Marine College, Đại học Sơn Đông (Wei hai, Trung Quốc) và hiện được bảo quản trong phòng thí nghiệm của chúng tôi. V. anguillarum được nuôi cấy qua đêm ở 37˚C trong môi trường LB và nuôi cấy lại trong 4 giờ với tỷ lệ cấy 1:100 vào ngày thứ hai. Vi khuẩn trong giai đoạn tăng trưởng logarit được thu thập bằng cách ly tâm ở tốc độ 5000 × g trong 5 phút ở 4˚C và rửa hai lần bằng dung dịch muối đệm phốt phát (PBS: 10 mM Na2HPO4, 140 mM NaCl, 2,7 mM KCl và 1,8 mM KH2PO4, pH 7,4). V. anguillarum được tái huyền phù trong dung dịch muối đệm phốt phát để thử thách tôm. Khoảng 2×107 đơn vị hình thành khuẩn lạc (CFU)/tôm được tiêm vào bụng mỗi con tôm bằng ống tiêm siêu nhỏ. Nhóm đối chứng được tiêm cùng một thể tích PBS. Các tế bào máu, tim, gan tụy, mang, dạ dày và ruột được thu thập từ ít nhất ba con tôm để chiết xuất RNA và protein. Để thu thập tế bào máu, bạch huyết được chiết xuất từ xoang bụng bằng cách sử dụng một ống tiêm được nạp sẵn 0,8 ml dung dịch đệm chống đông máu (10% natri citrat), sau đó ly tâm nhanh ở tốc độ 700 × g trong 8 phút ở 4˚C để phân lập tế bào máu.
Chiết xuất RNA và protein và tổng hợp cDNA
Tổng RNA được chiết xuất từ tế bào máu và các cơ quan khác nhau của tôm bằng TRIzol (ET101, Transgen, Bắc Kinh, Trung Quốc). Protein từ các cơ quan khác nhau được chiết xuất bằng cách sử dụng Bộ đệm ly giải xét nghiệm tăng cường miễn dịch phóng xạ (RIPA) (P0013B, Beyotime, Giang Tô, Trung Quốc). Quá trình tổng hợp cDNA chuỗi đầu tiên được thực hiện bằng cách sử dụng Bộ tổng hợp cDNA (5x All-in-One RT MasterMix; Vật liệu sinh học ứng dụng-abm, Vancouver, Canada), theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
Bảng 1. Trình tự mồi được sử dụng trong nghiên cứu này.
MasterMix; Vật liệu sinh học ứng dụng-abm, Vancouver, Canada), theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
Biểu hiện tái tổ hợp và chuẩn bị kháng thể
Trình tự cDNA của Foxo được khuếch đại bằng phản ứng chuỗi polymerase phiên mã ngược (RT-PCR) bằng cách sử dụng các đoạn mồi Foxo-EX-F và Foxo-EX-R (Bảng 1). Các sản phẩm PCR tinh khiết sau đó được tiêu hóa bằng cách sử dụng enzyme giới hạn và đưa vào plasmid pGEX-4T-1 (GE Healthcare, Piscataway, NJ, USA). và các plasmid được tạo ra sẽ được biến nạp vào tế bào Escher ichia coli Rosseta (DE3). Sự biểu hiện protein được tạo ra bằng cách sử dụng 1 mM isopropyl- - D-thio galactopyranoside ở 37˚C. Các protein tái tổ hợp được tiến hành sắc ký ái lực bằng nhựa glutathione (GST) (C600031, BBI, Thượng Hải, Trung Quốc), theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Kháng huyết thanh thỏ chống lại FOXO được điều chế theo phương pháp được mô tả trước đây [55].
Phương Tây thấm
Các protein được chiết xuất từ các cơ quan hoặc tế bào máu khác nhau được phân tách bằng phương pháp điện di trên gel polyacrylamide natri dodecyl sulfate 10% (SDS-PAGE). Các protein trong gel SDS-PAGE được chuyển sang màng cellulose nitrat bằng dung dịch đệm chuyển (25 mM Tris–HCl, 20 mM glycine, 0.037% mM SDS và 20% ethanol) và ủ trong sữa gầy 5% hoặc albumin huyết thanh bò 3% (BSA) trong dung dịch muối Tris-buffered (TBS: 150 mM NaCl, 10 mM Tris HCl, pH 8,0) trong 1 giờ với lắc nhẹ ở nhiệt độ phòng. Sau đó, các màng này được ủ với kháng huyết thanh sơ cấp: Anti-FOXO ở độ pha loãng 1:100, anti-RAB5 lúc 1:25, anti Rab7 lúc 1:25, anti-beta actin (ACTB) lúc 1:250 (được điều chế trong phòng thí nghiệm của chúng tôi ); kháng thể đa dòng histone-3 (A2348, ABclonal, Vũ Hán, Trung Quốc, 1:2500); Kháng thể đa dòng kháng phosphoryl hóa (p)-AKT (WLP001a, Wanleibio, Thẩm Dương, Trung Quốc, 1:500) và lắc nhẹ qua đêm ở 4˚C. Sau khi rửa ba lần bằng TBST (0,1% Tween-20 được thêm vào TBS), các màng màng được ủ với kháng thể thứ cấp (ZB2308 ZSGB-Bio, Bắc Kinh, Trung Quốc, 1:5,000) hoặc ( ZB2301 ZSGB-Bio, Bắc Kinh, Trung Quốc, 1:5,000) trong 3 giờ ở nhiệt độ phòng kèm theo lắc nhẹ. Các dải protein có khả năng miễn dịch được phát triển bằng cách sử dụng dung dịch clorua xanh nitrotetrazolium (A610379, BBI) và muối P-toluidine (A610072, BBI) trong điều kiện tối hoặc sử dụng phương pháp phát quang hóa nâng cao (ECL). -actin hoặc Histone-3 đã được sử dụng làm tài liệu tham khảos.
Mô hình phân bố và biểu hiện mô ở tôm bị vi khuẩn tấn công
Sự phân bố mô của Foxo/FOXO trong tế bào máu, tim, mang, đờm, dạ dày và ruột được phân tích bằng RT-PCR với mồi Foxo-F và Foxo-R (Bảng 1) và bằng phương pháp làm mờ phương Tây bằng kháng thể kháng FOXO, tương ứng. Quy trình PCR bao gồm ủ ban đầu ở 94˚C trong 3 phút; tiếp theo là 35 chu kỳ 94˚C trong 30 giây, 50˚C trong 30 giây và 72˚C trong 30 giây; tiếp theo là 72˚C trong 10 phút. Các sản phẩm PCR được phân tích bằng phương pháp điện di trên gel agarose (1,5% agarose). Gen -actin ( -actin-F và -actin-R; Bảng 1) được sử dụng làm đối chứng nội bộ. Các kiểu biểu hiện theo thời gian của Foxo/FOXO ở mức RNA và protein ở tôm thử thách với V. anguillarum đã được phân tích bằng phương pháp PCR định lượng thời gian thực (qPCR) trong máy quay vòng nhiệt (qTOWER3, ANALYTIK JENA AG, Jena, Đức) và bằng Western ern blotting, tương ứng. Quy trình qPCR bao gồm: 95˚C trong 10 phút; 40 chu kỳ ở 95˚C trong 10 giây và 60˚C trong 50 giây; và sau đó là thời kỳ nóng chảy từ 65˚C đến 95˚C. Các tệp chuyên nghiệp biểu thức của Foxo được tạo ra bằng cách sử dụng 2-ΔΔCT [56] sử dụng giá trị trung bình hình học của hai gen kiểm soát nội bộ của -actin và Ef-1 để chuẩn hóa. Hiệu suất của cặp mồi trong qPCR được phân tích theo phương pháp MIQE [57] với độ pha loãng logarit 10-của hỗn hợp cDNA để tạo ra đường cong chuẩn tuyến tính.
Phân lập protein hạt nhân và tế bào chất
Mô ruột được tách ra từ tôm và rửa trong PBS ba lần. Việc chiết xuất protein được thực hiện bằng cách sử dụng bộ chiết protein hạt nhân và tế bào chất (R0050, Solarbio, Bắc Kinh, Trung Quốc) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Ít nhất ba con tôm đã được sử dụng để chiết xuất protein nhằm loại bỏ sự khác biệt của từng cá thể.
Xét nghiệm can thiệp RNA
Để phân tích chức năng gen, chúng tôi đã thực hiện xét nghiệm can thiệp RNA (RNAi). Một số cặp mồi chứa trình tự khởi động T7 (Foxo-RI-F và Foxo-RI-R; Rab5-RI-F và Rab5 -RI-R; Rab7-RI- F và Rab7 -RI-R; Akt-RI-F và Akt-RI-R. Bảng 1) được thiết kế để khuếch đại các mẫu để tổng hợp dsRNA. Sử dụng mẫu T7 RNA polymerase (EP0111, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) và mẫu cDNA, chúng tôi đã tổng hợp các đoạn DSRNA. Protein huỳnh quang sợi đôi màu xanh lá cây DSGfp RNA đóng vai trò kiểm soát, được khuếch đại bằng cách sử dụng Gfp-RI-F và Gfp -RI-R (Bảng 1) làm mồi cho quá trình tổng hợp DSGfp. Sau đó, các đoạn DSRNA (50 ug/mỗi đoạn) được tiêm vào phần bụng của M. japonicus bằng cách sử dụng ống tiêm siêu nhỏ và mũi tiêm thứ hai được thực hiện 12 giờ sau đó với cùng liều lượng. Hiệu quả can thiệp RNA được phân tích bằng phương pháp PCR sao chép ngược thời gian thực định lượng (qRT-PCR, bao gồm sao chép ngược RNA để tạo thành cDNA, sau đó được sử dụng làm khuôn mẫu trong xét nghiệm qPCR) hoặc phương pháp làm mờ phương Tây sau 24 giờ tiêm thứ hai. -actin đã được sử dụng làm tài liệu tham khảo nội bộ.
Người giới thiệu
1. Calnan DR, Brunet A. Mã FoxO. gen gây ung thư. 2008; 27(16):2276–2288. https://doi.org/10.1038/ onc.2008.21 PMID: 18391970.
2. Trần H, Brunet A, Grenier JM, Datta SR, Fornace AJ, DiStefano PS, et al. Con đường sửa chữa DNA được kích thích bởi yếu tố phiên mã đầu não FOXO3a thông qua protein Gadd45. Khoa học. 2002; 296 (5567):530–534. https://doi.org/10.1126/science.1068712 PMID: 11964479.
3. Martins R, Lithgow GJ, Link W. FOXO tồn tại lâu dài: làm sáng tỏ vai trò của protein FOXO đối với sự lão hóa và tuổi thọ. Tế bào lão hóa 2016; 15(2):196–207. https://doi.org/10.1111/acel.12427 PMID: 26643314.
4. Vogt PK, Jiang H, Aoki M. Kiểm soát ba lớp-phosphoryl hóa, acetyl hóa và phổ biến hóa protein FOXO. Chu kỳ tế bào. 2005; 4(7):908–913. https://doi.org/10.4161/cc.4.7.1796 PMID: 15917664. 5. Daitoku H, Sakamaki J, Fukamizu A. Điều hòa các yếu tố phiên mã FoxO bằng cách acetyl hóa và tương tác pro tein-protein. Res tế bào Bba-Mol. 2011; 1813(11):1954–1960. https://doi.org/10.1016/j. bbamcr.2011.03.001 PMID: 21396404.
6. Vương Y, Chu YM, Graves DT. Các yếu tố phiên mã FOXO: ý nghĩa và quy định lâm sàng của chúng. Biomed Res Int. 2014; 2014:1–13. https://doi.org/10.1155/2014/925350 PMID: 24864265.
7. Murphy CT, McCarroll SA, Bargmann CI, Fraser A, Kamath RS, Ahringer J, và cộng sự. Các gen tác động theo dòng DAF-16 để ảnh hưởng đến tuổi thọ của Caenorhabditis elegans. Thiên nhiên. 2003; 424(6946):277– 284. https://doi.org/10.1038/nature01789 PMID: 12845331. 8. Sergi C, Shen F, Liu SM. Các con đường Insulin/IGF{12}}R, SIRT1 và FOXO - một dạng nền tảng tương tác hấp dẫn dành cho xương và ung thư xương. Nội tiết phía trước (Lausanne). 2019; 10:93–103. https://doi.org/10. 3389/fendo.2019.00093 PMID: 30881341.
9. Brunet A, Bonni A, Zigmond MJ, Lin MZ, Juo P, Hu LS, và cộng sự. Akt thúc đẩy sự sống sót của tế bào bằng cách phosphoryl hóa và ức chế yếu tố phiên mã đầu não. Tế bào. 1999; 96(6):857–868. https://doi.org/10.1016/ s0092-8674(00)80595-4 PMID: 10102273.
10. Huang H, Regan KM, Wang F, Wang DP, Smith DI, van Deursen JMA, et al. Skp2 ức chế FOX01 trong việc ức chế khối u thông qua sự thoái hóa qua trung gian ubiquitin. P Natl Acad Khoa học Hoa Kỳ. 2005; 102(5):1649– 1654. https://doi.org/10.1073/pnas.0406789102 PMID: 15668399.
11. Ogg S, Paradis S, Gottlieb S, Patterson GI, Lee L, Tissenbaum HA, và những người khác. Yếu tố phiên mã đầu Fork DAF-16 truyền các tín hiệu trao đổi chất và tuổi thọ giống insulin ở C. Elegans. Thiên nhiên. 1997; 389 (6654):994–999. https://doi.org/10.1038/40194 PMID: 9353126.
12. Fink C, Hoffmann J, Knop M, Li Y, Isermann K, Roeder T. Cần có tín hiệu FoxO trong ruột để sống sót sau nhiễm trùng miệng ở Drosophila. Chất miễn dịch niêm mạc. 2016; 9(4):927–936. https://doi.org/10.1038/mi. 2015.112 PMID: 26627459.
13. Spellberg MJ, Marr MT. FOXO điều chỉnh sự can thiệp RNA ở Drosophila và bảo vệ khỏi bị nhiễm virus RNA. P Natl Acad Khoa học Hoa Kỳ. 2015; 112(47):14587–14592. https://doi.org/10.1073/pnas. 1517124112 PMID: 26553999.
14. Guo LL, Karpac J, Tran SL, Jasper H. PGRP-SC2 thúc đẩy cân bằng nội môi miễn dịch đường ruột để hạn chế rối loạn sinh lý hội sinh và kéo dài tuổi thọ. Tế bào. 2014; 156(1–2):109–122. https://doi.org/10.1016/j.cell.2013.12. 018 PMID: 24439372.
15. Becker T, Loch G, Beyer M, Zinke I, Aschenbrenner AC, Carrera P, và những người khác. Sự điều hòa phụ thuộc FOXO của cân bằng nội môi miễn dịch bẩm sinh. Thiên nhiên. 2010; 463(7279):369–373. https://doi.org/10.1038/ Nature08698 PMID: 20090753.
16. Seiler F, Hellberg J, Lepper PM, Kamyschnikow A, Herr C, Bischoff M, et al. Các yếu tố phiên mã FOXO điều chỉnh cơ chế miễn dịch bẩm sinh trong tế bào biểu mô đường hô hấp. J Miễn dịch. 2013; 190(4):1603– 1613. https://doi.org/10.4049/jimmunol.1200596 PMID: 23315071.
17. Graves DT, Milovanova TN. Miễn dịch niêm mạc và các yếu tố phiên mã FOXO1. Miễn dịch phía trước. 2019; 10:2530–2541. https://doi.org/10.3389/fimmu.2019.02530 PMID: 31849924.
18. Bulet P, Stocklin R, Menin L. Peptide kháng khuẩn: từ động vật không xương sống đến động vật có xương sống. Thuốc miễn dịch Rev. 2004; 198: 169–184. https://doi.org/10.1111/j.0105-2896.2004.0124.x PMID: 15199962.
19. Buchon N, Silverman N, Cherry S. Khả năng miễn dịch ở Drosophila melanogaster—từ nhận dạng vi sinh vật đến sinh lý toàn bộ sinh vật. Nat Rev Miễn dịch. 2014; 14(12):796–810. https://doi.org/10.1038/nri3763 PMID: 25421701.
20. Hoffmann JA, Reichhart JM. Khả năng miễn dịch bẩm sinh của Drosophila: một quan điểm tiến hóa. Nat miễn dịch. 2002; 3(2):121–126. https://doi.org/10.1038/ni0202-121 PMID: 11812988.
21. Hultmark D. Khả năng miễn dịch của Drosophila: đường dẫn và mô hình. Curr Opin Immunol. 2003; 15(1):12–19. https:// doi.org/10.1016/s0952-7915(02)00005-5 PMID: 12495727.
22. Li FH, Xiang JH. Những tiến bộ gần đây trong nghiên cứu về khả năng miễn dịch bẩm sinh của tôm ở Trung Quốc. Dev Comp miễn dịch. 2013; 39(1–2):11–26. https://doi.org/10.1016/j.dci.2012.03.016 PMID: 22484214.
23. Sun JJ, Lan JF, Zhao XF, Vasta GR, Wang JX. Việc liên kết miền cuộn dây của lectin loại C với thụ thể Domeless sẽ kích hoạt trực tiếp con đường JAK/STAT trong phản ứng miễn dịch của tôm đối với nhiễm vi khuẩn rial. PLoS Pathog. 2017; 13(9):e1006626. https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1006626 PMID: 28931061.
24. Gordon S. Thực bào: một quá trình sinh học miễn dịch. Miễn dịch. 2016; 44(3):463–475. https://doi.org/ 10.1016/j.immuni.2016.02.026 PMID: 26982354.
25. Wang S, Xia PY, Huang GL, Zhu PP, Liu J, Ye BQ, et al. Cần có quá trình tự thực qua trung gian FoxO1- để phát triển tế bào NK và khả năng miễn dịch bẩm sinh. Xã Nat. 2016; 7:11023–11037. https://doi.org/10.1038/ ncomms11023 PMID: 27010363.
26. Dong G, Song L, Tian C, Wang Y, Miao F, Zheng J, et al. FOXO1 điều chỉnh hoạt động bạch cầu trung tính do vi khuẩn gây ra. Miễn dịch phía trước. 2017; 8:1088–1102. https://doi.org/10.3389/fimmu.2017.01088 PMID: 28928749.
27. Vương XW, Triệu XF, Vương JX. Lectin loại C liên kết với beta-Integrin để thúc đẩy quá trình thực bào máu ở động vật không xương sống. J Biol Chem. 2014; 289(4):2405–2414. https://doi.org/10.1074/jbc.M113.528885 PMID: 24324258.
28. Norouzitallab P, Baruah K, Vanrompay D, Bossier P. Dạy tôm tự vệ để chống nhiễm trùng. Xu hướng công nghệ sinh học. 2019; 37(1):16–19. https://doi.org/10.1016/j.tibtech.2018.05.007 PMID: 29914649.
29. Flegel TW. Lịch sử xuất hiện, tác động và hiện trạng của mầm bệnh tôm ở châu Á. J Động vật không xương sống Pathol. 2012; 110(2):166–173. https://doi.org/10.1016/j.jip.2012.03.004 PMID: 22429834.
30. Wang PH, Huang TZ, Zhang XB, He JG. Phòng chống virus ở tôm: Từ khả năng miễn dịch bẩm sinh đến nhiễm virus. Thuốc kháng vi-rút Res. 2014; 108:129–141. https://doi.org/10.1016/j.antivirus.2014.05.013 PMID: 24886688.
31. Obsil T, Obsilova V. Mối quan hệ cấu trúc/chức năng làm nền tảng cho sự điều hòa của các yếu tố phiên mã FOXO. gen gây ung thư. 2008; 27(16):2263–2275. https://doi.org/10.1038/onc.2008.20 PMID: 18391969.
