Nhân bản gen, nhận dạng chức năng, phân tích cấu trúc và biểu hiện của Sucrose Synthase từ Cistanche Tubulosa

Tóm tắt:Sucrose synthase đóng một vai trò quan trọng trong quá trình chuyển hóa đường thực vật bằng cách xúc tác sản xuất uridine diphosphate (UDP)-glucose, chất này đóng vai trò là chất cung cấp glycosyl có hoạt tính sinh học cho các quá trình trao đổi chất khác nhau. Trong nghiên cứu này, gen tổng hợp sucrose có tên CtSus được nhân bản từCistanche tubulosa, một loại thuốc cổ truyền Trung Quốc được biết đến với công dụng phong phúhàm lượng glycoside đa dạng, dựa trên kết quả phân tích bảng điểm. Khung đọc mở của CtSus dài 2 418 bp mã hóa 805 axit amin. Phân tích trình tự cho thấy các miền được bảo tồn liên quan đến họ sucrose synthase thực vật ở cả vùng đầu N và đầu C của protein CtSus. Phân tích phát sinh chủng loại đã chứng minh rằng CtSus có mối quan hệ tiến hóa chặt chẽ vớitổng hợp sucrosetừ các cây khác theo cùng một thứ tự. Việc xác định chức năng của CtSus được thực hiện thông qua quá trình xúc tác toàn tế bào kết hợp với UGT71BD1, một loại enzyme glycosyltransferase đặc trưng. Kết quả cho thấy việc đưa CtSus vào đã nâng cao đáng kể tốc độ chuyển hóa quá trình glycosyl hóa được xúc tác bởi UGT71BD1. Sự biểu hiện hòa tan của CtSus trong Escherichia coli còn đạt được hơn nữa bằng cách sử dụng vectơ biểu hiện pCold™ TF. Thử nghiệm enzym in vitro đã chỉ ra hoạt tính của CtSus là xúc tác cho sự hình thành UDP-glucose khi có mặt sucrose và UDP. Kết quả phản ứng chuỗi polymerase định lượng theo thời gian thực cho thấy các kiểu biểu hiện của gen CtSus ở các phần khác nhau của C. tubulosa và nuôi cấy tế bào huyền phù của C. tubulosa dưới áp lực hạn hán tương quan với các kiểu tích lũy được quan sát thấy đối với phenylanol glycoside, tương ứng. Hơn nữa, các axit amin chính và sự tương tác của chúng giữa enzyme và cơ chất đã được khám phá dựa trên dự đoán cấu trúc protein và kết quả lắp ghép phân tử. Nhìn chung, các phát hiện của chúng tôi xác định CtSus tổng hợp sucrose chịu trách nhiệm cung cấp chất cho glycosyl hoạt động UDP-glucose trong quá trình sinh tổng hợp các sản phẩm glycoside ở C. tubulosa và cũng đã cung cấp một yếu tố gen có thể được sử dụng trong xây dựng chủng kỹ thuật để sản xuất các sản phẩm glycoside.

Từ khóa: Cistanche tubulosa; sucrose tổng hợp; glycoside; UDP-glucose; xúc tác enzym

DICHEN CISTANCHE TĂNG CƯỜNG CƠ SỞ TẠI YUTIAN, HOTAN, XINJIANG

Dịch vụ hỗ trợ của Wecistanche-Nhà xuất khẩu cistanche lớn nhất ở Trung Quốc:

Email:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/Điện thoại:+86 15292862950

Cistanche tubulosa (Schenk) R. Wightlà một loại cây thân thảo sống ký sinh lâu năm thuộc chi Cistanche thuộc họ Orobanchaceae. Nó là một loại dược liệu quý hiếm truyền thống của Trung Quốc, có nguồn gốc từ Tân Cương và Nội Mông. Nó có vị ngọt, mặn và tính ấm, có tác dụng thanh nhiệtbổ thận dương, lợi ích tinh và máu, và làm ẩm ruột vàgiảm táo bón. Nó được biết đến với cái tên "nhân sâm sa mạc" [1]. Nghiên cứu hiện đại đã phát hiện ra rằngCistanche tubulosachứanhiều thành phần hóa học khác nhauchẳng hạn nhưglycoside phenylethanoid, iridoid ether terpenvà các glycosid, lignan và glycosid của chúng, este oligosacarit, polysacarit, polyol, oligosacarit, sterol và glycosid của chúng, glycosid monoterpenoid, đường, axit amin và dầu dễ bay hơi [2,3], đặc biệt hợp chất glycoside là hoạt chất quan trọng nhất. Trong số đó, hợp chất phenylethanoid glycoside có hàm lượng cao nhất trong dược liệu gốc và có nhiều tác dụng dược lý như bảo vệ thần kinh và chống lão hóa [4]. Quá trình sinh tổng hợp các hợp chất glycoside nêu trên bao gồm nhiều bước phản ứng glycosyl hóa, được xúc tác bởiglycosyltransferase ở thực vật, vàcung cấp các nhà tài trợ glycosyl hoạt độnglà điều cần thiết trong quá trình này. Các chất cho đường hoạt động phổ biến trong sinh vật bao gồm uridine diphosphate (UDP), thymidine diphosphate (TDP) và guanosine diphosphate (GDP). Trong số đó, UDP-glucose là chất cho glycosyl hoạt động phổ biến nhất ở thực vật. Nó không chỉ có thể được glucosyltransferase nhận biết trực tiếp để xúc tác cho phản ứng chuyển glucosyl mà còn có thể được sử dụng làm tiền chất để tham gia vào quá trình tổng hợp các loại chất cho glycosyl khác. Ví dụ: UDP-glucose có thể được sử dụng làm chất nền để tạo ra UDP-rhamnose dưới sự xúc tác của 4,6-dehydratase, 3,5-isomerase và 4-reductase[5]; UDP-glucose có thể được sử dụng làm chất nền để xúc tác quá trình tổng hợp UDP-xyloza thông qua UDP-glucose dehydrogenase và UDP-xyloza synthase; UDP-xyloza có thể được xúc tác thêm bởi UDP-xyloza epimerase để tạo ra UDP-arabinose[6]; UDP-glucose và UDP-galactose là các chất đồng phân không đối quang và có thể chuyển hóa lẫn nhau thông qua epimerase [7,8]. Do đó, quá trình tổng hợp UDP-glucose có ảnh hưởng quan trọng đến việc cung cấp các chất cho glycosyl hoạt động ở thực vật và sự biến đổi glycosyl hóa của các chất chuyển hóa thứ cấp.

Sự tổng hợp UDP-glucose ở thực vật có thể đạt được thông qua con đường tổng hợp, con đường phosphorylase và con đường kinase. Trong số đó, sucrose synthase có thể xúc tác trực tiếp cho phản ứng giữa UDP và sucrose để tạo ra UDP-glucose và fructose, cũng như phản ứng ngược [9]. Theo nghĩa rộng, sucrose synthase thuộc phân họ glycosyltransferase-4, bao gồm nhiều loại glycosyltransferase khác nhau, chẳng hạn như phosphatase tổng hợp sucrose, trehalose synthase và trehalose phosphorylase [10]. Sucrose synthase lần đầu tiên được xác định ở mầm lúa mì [11]. Kể từ đó, các nhà nghiên cứu đã xác định được hàng trăm gen tổng hợp sucrose từ nhiều loại thực vật như đậu xanh (Vigna radiata), lúa (Oryza sativa), ngô (Zea mays), đậu tương (Glycine max) và đào (Amygdalus persica). Chúng tham gia vào nhiều quá trình trao đổi chất ở thực vật, bao gồm vận chuyển và phân phối sucrose, tổng hợp tinh bột, tổng hợp cellulose và thành phần thành tế bào, stress sinh học và phi sinh học, v.v., và đóng vai trò điều tiết quan trọng trong việc phân bổ nguồn carbon thực vật [12]. Ngoài ra, dựa trên nghiên cứu về chức năng sinh lý, các nhà nghiên cứu còn sử dụng sucrose synthase thu được làm yếu tố gen để tổng hợp enzyme các hợp chất glycoside và đạt được kết quả lý tưởng. Ví dụ, Masada và cộng sự. [13] cùng biểu hiện gen sucrose synthase AtSus-1 từ Arabidopsis thaliana và gen glycosyltransferase CaUGT2 từ Catharanthus roseus trong ống nghiệm và sử dụng hệ thống enzyme kép một nồi để xúc tác phản ứng glycosyl hóa của chất curcumin, làm tăng năng suất curcumin glycoside tăng gấp 7 lần. Đồng thời, lượng nhà tài trợ UDP-glucose được sử dụng chỉ bằng 1/10 lượng ban đầu.

Bungaruang và cộng sự. [14] đã xây dựng một hệ thống xúc tác kết hợp sử dụng sucrose synthase GmSuSy từ đậu nành và glycosyltransferase OsUGT từ gạo. Họ đã đạt được sự biến đổi glycosyl hóa nothofagin bằng cách chỉ thêm một lượng nhỏ UDP (1.0 mmol·L-1) và sucrose. So với xúc tác enzyme đơn của OsUGT, việc sản xuất các sản phẩm glycosyl hóa đã tăng gấp ba bậc độ lớn, từ μmol·L-1 đến mol·L-1.

Sự phong phú và đa dạng của các hợp chất glycoside trong Cistanche tubulosa cho thấy rằng nó phải chứa một sucrose synthase mạnh liên quan đến sự biến đổi glycosyl hóa của các chất chuyển hóa thứ cấp, nhưng enzyme này chưa được báo cáo ở thực vật thuộc chi Cistanche. Trong bài báo này, Cistanche tubulosa, một dược liệu có trong dược điển, được sử dụng làm nguyên liệu. Thông qua phân tích hệ phiên mã và phân tích hệ phiên mã so sánh của các phần khác nhau, các kỹ thuật sinh học phân tử đã được sử dụng để khai thác và xác định gen CtSus tổng hợp sucrose. Phân tích tin sinh học, biến đổi sinh học toàn tế bào, biểu hiện và tinh chế sinh vật nhân sơ, phân tích hoạt động xúc tác enzyme in vitro và phân tích biểu hiện gen ở các phần khác nhau của Cistanche tubulosa và hệ thống nuôi cấy mô thực vật dưới áp lực hạn hán đã được thực hiện để khám phá chức năng của CtSus và mối tương quan của nó với sinh tổng hợp các hợp chất glycoside ở Cistanche tubulosa, đặt nền móng cho việc nghiên cứu con đường sinh tổng hợp các hợp chất glycoside ở Cistanche tubulosa.

Vật liệu và phương pháp

Vật liệu Cây Cistanche tubulosa tươi được thu thập từ thành phố Hotan, Tân Cương, Trung Quốc và việc nhận dạng sinh học được thực hiện bởi Giáo sư Tu Pengfei của Đại học Bắc Kinh; hệ thống nuôi cấy tế bào huyền phù Cistanche tubulosa được nhóm nghiên cứu của chúng tôi thành lập ở giai đoạn đầu [15]; E. coliFast-T1 được mua từ Công ty TNHH Công nghệ sinh học Novozymes Nam Kinh; E. coli BL21 (DE3) được mua từ Công ty TNHH Công nghệ sinh học Quanshijin Bắc Kinh; Các vectơ pCold™ I và pCold™ TF được mua từ Bio-Tech (Bắc Kinh) Co., Ltd.; Kiểm soát UDP-glucose được mua từ Công ty TNHH Công nghệ sinh học Tây An Qiyue, và chất nền aesculin và resveratrol được mua từ Công ty TNHH Công nghệ sinh học Yuanye Thượng Hải.

DICHEN CISTANCHE NUÔI CƠ SỞ TẠI HOTAN, TÂN GIANG

Tách RNA và tổng hợp cDNA RNA được chiết xuất theo hướng dẫn của Bộ công cụ thực vật OMEGA RNA (Cat R6827-01, Omega Bio-Tek). Điện di trên gel agarose và máy quang phổ Nanodrop 2000 được sử dụng để phát hiện độ tinh khiết, nồng độ và tính toàn vẹn của RNA. Các mẫu RNA đủ điều kiện được sao chép ngược bằng cách sử dụng bộ phiên mã ngược TransScript® OneStep gDNA Removal và cDNA Synt tổng hợp SuperMix (Cat AT311-02, Beijing Quanshijin Biotechnology Co., Ltd.) để tổng hợp chuỗi cDNA đầu tiên.

Khai thác gen sucrose synthase và nhân bản gen CtSus Trình tự axit amin của Arabidopsis thaliana sucrose synthase AtSus1 đã được xác định chức năng (số gia nhập GenBank: AED92894.1) [16] đã được sử dụng làm mẫu. Các gen tổng hợp Sucrose được sàng lọc từ dữ liệu phiên mã của C. tubulosa bằng cách căn chỉnh trình tự Blastp cục bộ, kết hợp với chú thích gen phiên mã, phân tích FPKM (sự phong phú biểu hiện gen) và phân tích dữ liệu phiên mã so sánh. Các đoạn mồi cụ thể được thiết kế dựa trên thông tin trình tự gen ứng cử viên được cung cấp bởi dữ liệu phiên mã thế hệ thứ hai của C. tubulosa (Bảng 1). C. tubulosa cDNA đã được sử dụng làm khuôn mẫu và quá trình khuếch đại PCR gen mục tiêu được thực hiện bằng cách sử dụng enzyme PCR có độ chính xác cao (Cat P505-d1, Nanjing Novozymes Biotech Co., Ltd.). Sản phẩm khuếch đại PCR được tinh chế bằng Bộ kit mini tách chiết DNA FastPure Gel (Cat DC201-01, Nanjing Novozymes Biotech Co., Ltd.) và sau đó được nhân bản theo bộ nhân bản nhanh (Cat C112-01, Nanjing Novogene Biotech Co., Ltd.) đã được kết nối với vectơ nhân bản pCE2 TA/Blunt-Zero theo hướng dẫn vận hành, được chuyển vào các tế bào khả biến Fast-T1 và nuôi cấy qua đêm ở 37 độ. Plasmid được chiết xuất và gửi đến Công ty TNHH Genomics Liuhe BGI Bắc Kinh để xác định trình tự.

Bảng 1. Trình tự nucleotide của các mồi được sử dụng trong nghiên cứu này. qPCR: Phản ứng chuỗi polymerase định lượng theo thời gian thực

Phân tích tin sinh học của sucrose synthase CtSus từ Cistanche tubulosa

Phần mềm trực tuyến ProtParam (//web.Exasy.org/protparam/) đã được sử dụng để phân tích các tính chất hóa lý của protein; phần mềm trực tuyến TMHMM (//services.healthtech.dtu.dk/services/TMHMM{{0}}.0/) đã được sử dụng để dự đoán cấu trúc xuyên màng của protein; phần mềm trực tuyến SOPMA (https://npsa-rabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html) đã được sử dụng để dự đoán cấu trúc bậc hai của protein; phần mềm trực tuyến SMART (//smart.embl.de/) đã được sử dụng để dự đoán miền được bảo tồn của chuỗi axit amin protein; phần mềm DANMAN được sử dụng để so sánh trình tự axit amin của CtSus với trình tự tổng hợp sucrose từ các loài khác; Cây phát sinh chủng loại được xây dựng bằng cách phân tích cụm bằng phương pháp nối lân cận bằng phần mềm MEGA11, với độ lặp lại khởi động là 1,000 lần.

Phân tích biểu hiện của CtSus ở các phần khác nhau của Cistanche tubulosa và dưới áp lực hạn hán

Các mồi PCR định lượng huỳnh quang thời gian thực cho CtSus và gen tham chiếu bên trong DNAj được thiết kế bằng phần mềm DNAMAN [17] (Bảng 1). Mức độ biểu hiện tương đối của gen CtSus trong các tế bào huyền phù của Cistanche tubulosa ở các phần khác nhau của Cistanche tubulosa và dưới áp lực hạn hán được phân tích bằng phương pháp PCR định lượng huỳnh quang thời gian thực. Phân tích PCR định lượng huỳnh quang thời gian thực được thực hiện bằng cách sử dụng TransStart® Top Green qPCR SuperMix Kit (Cat AQ131-01, Công ty TNHH Công nghệ sinh học Quanshijin Bắc Kinh). Chương trình khuếch đại áp dụng phương pháp hai bước: 94 độ trong 30 giây; 94 độ trong 5 giây, 60 độ trong 30 giây, lặp lại trong 40 chu kỳ; nó được chạy trên Hệ thống phát hiện PCR thời gian thực Bio-Rad CFX Connect™ (Phòng thí nghiệm Bio-Rad, Hercules, CA, Hoa Kỳ). Phương pháp 2–ΔΔCT được sử dụng để phân tích biểu hiện tương đối của gen CtSus trong các nhóm thử nghiệm khác nhau. GraphPadPrism 9 được sử dụng để phân tích ý nghĩa và vẽ biểu đồ thanh.

Xây dựng vectơ biểu hiện ở sinh vật nhân sơ và biểu hiện dị loại của gen CtSus Dựa trên kết quả giải trình tự gen, các đoạn mồi cụ thể chứa nhánh tương đồng của vectơ và vị trí hạn chế (Bảng 1) được thiết kế để khuếch đại PCR. Gen mục tiêu CtSus được xây dựng thành các vectơ biểu hiện pET-28a, pET-24b, pCold™ I và pCold™ TF bằng cách sử dụng công nghệ nhân bản liền mạch bằng cách sử dụng Bộ công cụ nhân bản một bước ClonExpress Ultra (CatC115-01 , Công ty TNHH Công nghệ sinh học Novogene Nam Kinh). Các plasmid của các vectơ biểu hiện tái tổ hợp được tạo thành công đã được tách chiết và biến nạp vào tế bào có khả năng biểu hiện Escherichia coli Transetta (DE3). Các tế bào được nuôi cấy trong môi trường lỏng LB chứa 50 µg·mL-1 kanamycin sulfate (với pET-28a và pET-24b làm vectơ biểu hiện) hoặc 1{{ 22}}0 µg·mL-1 ampicillin (với pCold™ I và pCold™ TF là vectơ biểu hiện) và 50 ug·mL-1 chloramphenicol, tương ứng, ở 37 độ và 200 vòng/phút{{ 15}} kèm theo lắc cho đến khi giá trị A600 của dung dịch vi khuẩn đạt 0.4-0.6. Thêm isopropyl-beta-Dthiogalactopyranoside (IPTG) ở nồng độ cuối cùng là 0,5 mmol·L-1 để tạo ra biểu hiện protein. Ủ trong máy lắc nhiệt độ không đổi ở 23 độ (với pET{26}}a và pET{27}}b làm vectơ biểu thức) hoặc 15 độ (với pCold™ I và pCold™ TF làm vectơ biểu thức), 180 r· phút-1 trong 16 giờ (với pET28a và pET-24b làm vectơ biểu hiện) hoặc 24 giờ (với pCold™ I và pCold™ TF làm vectơ biểu hiện), sau đó thu thập vi khuẩn bằng cách ly tâm.

Dung dịch đệm ly giải (20 mmol·L-1 NaH2PO4-Na2HPO4, 0.5 mol·L-1 NaCl, 20 mmol·L{{10} } imidazole, 3% glycerol, 100 mmol·L-1 phenylmethylsulfonyl fluoride, 1 mg·mL-1 lysozyme, pH 7,4) được thêm vào, phá vỡ tế bào trong 8 phút và ly tâm. Lấy phần nổi phía trên và kết tủa lần lượt. Chất nổi phía trên được hấp phụ bởi cột ái lực HisTrap FF (Cat 17531901, Cytiva) chứa đầy chất độn Ni Sepharose 6 Fast Flow để hấp phụ protein mục tiêu có chứa thẻ His. Sau khi rửa giải với các nồng độ imidazole khác nhau, mỗi phần được lấy để phát hiện SDS-PAGE (điện di trên gel natri dodecyl sulfate-polyacrylamide). Các phần chứa protein mục tiêu được kết hợp, cô đặc bằng cách ly tâm và khử muối bằng ống siêu lọc (Millipore), và được bảo quản trong dung dịch đệm [chứa 50 mmol·L-1 Tris-HCl (pH 7,5), 0,2 mol·L{{ 30}}NaCl, 1 mmol·L-1 dithiothreitol, 3% glycerol] cho các phản ứng xúc tác enzyme trong ống nghiệm tiếp theo.

Xúc tác toàn tế bào CtSus Plasmid pCold™ I-CtSus và plasmid biểu hiện pET-28a-UGT71BD1[18] của glycosyltransferase UGT71BD1, đã được nhóm nghiên cứu xác định trước đó, đồng thời được chuyển thành biểu hiện có khả năng E. coli Transetta (DE3). Vi khuẩn tái tổ hợp dương tính chứa cả hai gen CtSus và UGT71BD1 đã được chọn lọc và cấy vào môi trường LB (môi trường tăng trưởng) chứa 50 ug·mL-1 kanamycin sulfate, 100 ug ·mL-1 ampicillin và 50 ug·mL-1 chloramphenicol theo tỷ lệ 1:100 (V/V). Môi trường nuôi cấy được nuôi cấy ở 37 độ cho đến khi giá trị A600 của dung dịch vi khuẩn là 0.4-0.6, sau đó IPTG được thêm vào ở nồng độ cuối cùng là 1 mmol·L{26}}. Quá trình nuôi cấy được tiếp tục ở nhiệt độ 15 độ và 180 vòng/phút{29}} trong 24 giờ. Môi trường nuôi cấy được ly tâm ở 4 độ và 4 000 r·min-1. Thu thập các tế bào. Cấy tế bào thu được vào môi trường M9 (môi trường lên men) với tỷ lệ 40 mL môi trường nuôi cấy trên mỗi gam vi khuẩn và thêm 75 μmol·L-1 sucrose và 25 μmol·L-1 aesculetin (1) hoặc chất nền resveratrol (2) cho các nhóm phản ứng. Tiếp tục lắc nuôi cấy trong 24 giờ, ly tâm ở 4000 × g, 4 độ trong 30 phút, thêm metanol để siêu âm phá vỡ kết tủa, thêm 2 lần thể tích metanol vào phần nổi phía trên, ly tâm ở 4000 × g, 4 độ trong 30 phút, Lấy phần nổi phía trên và kết hợp, làm bay hơi dung môi dưới áp suất giảm, hòa tan lại trong metanol, lọc qua màng lọc 0,22 μm và phát hiện sản phẩm phản ứng bằng máy sắc ký lỏng hiệu năng cao Agilent 1260. CAPCELL PAK C18 COLUMN (250 mm×4,6 mm, 5 µm) được sử dụng làm cột phân tích, nước axit formic 0,1% (A) và metanol (B) được sử dụng làm pha động và gradient rửa giải là: {{61 }} phút, 30%-90% B; 25-27 phút, 90%-100% B; 27-33 phút, 100% B. Các thông số khối phổ là chế độ ion dương và âm và quét toàn bộ MS1, MS2 và MS3 nhiều giai đoạn tự động.

Phát hiện hoạt tính xúc tác của enzyme CtSus in vitro Protein tái tổ hợp thu được bằng sắc ký ái lực cột HisTrap FF nêu trên được loại bỏ phần đuôi bằng cách sử dụng Yếu tố Xa. Hệ thống tiêu hóa enzyme như sau: protein tái tổ hợp được điều chỉnh đến nồng độ 1 mg·mL-1, và 1 μL Yếu tố Xa được thêm vào 50 μL protein tái tổ hợp trong dung dịch đệm 20 mmol·L-1 Tris-HCl (pH 8,0), 100 mmol·L-1 NaCl và 2 mmol·L-1

CaCl2 ở 23 độ trong 6 giờ. Hệ thống phản ứng là 1{14}}0 μL. Sản phẩm của hệ thống tiêu hóa enzym được tách protein thứ cấp bằng sắc ký ái lực HisTrap FF để thu được protein mục tiêu có loại bỏ thẻ cho các phản ứng xúc tác enzym in vitro tiếp theo. Hệ thống phản ứng enzyme như sau: 10 mmol·L-1 UDP, 100 mmol·L-1 sucrose, 50 mmol·L-1 MgCl2, 60 ug CtSus protein, Tris-HCl (pH 7.0) được bổ sung đến 100 µL, phản ứng trong bể nước ở nhiệt độ 30 độ trong 6 giờ, và phương pháp xử lý sau và phân tích HPLC được thực hiện như mô tả trong tài liệu tham khảo [19].

Dự đoán cấu trúc ba chiều và phân tích lắp ghép phân tử của protein CtSus AlphaFold2 đã được sử dụng để dự đoán cấu trúc ba chiều của protein CtSus [20]. Phân tử phối tử được hydro hóa và tích điện bằng phần mềm AutoDock Tools 1.5.6. Túi liên kết cơ chất thu được bằng cách liên kết với protein mẫu AtSus1 (PDBID 3S28). Chuỗi bên của các gốc axit amin xung quanh khoang được thiết lập ở mức linh hoạt.

Hộp lưới được đặt thành 40 × 40 × 40 Å3 và khoảng cách lưới là 0,375 Å. Việc ghép nối phân tử được thực hiện trong AutoDock Vina [21]. Phần mềm PyMOL 2.0 được sử dụng để trực quan hóa mô hình có ái lực tốt nhất (kcat·mol-1

).

Phân tích thống kê GraphPad Prism 9 được sử dụng để phân tích thống kê. Dữ liệu thực nghiệm được biểu thị dưới dạng trung bình ± độ lệch chuẩn. Thử nghiệm t được sử dụng để so sánh giữa hai nhóm và phân tích phương sai một chiều được sử dụng để so sánh giữa nhiều nhóm. Sự khác biệt được coi là có ý nghĩa thống kê khi P < 0.05.