Gossypitrin, một Flavonoid xuất hiện tự nhiên, làm giảm tổn thương tế bào thần kinh và ty thể do sắt gây ra Phần 3

Xin vui lòng liên hệoscar.xiao@wecistanche.comđể biết thêm thông tin

4. Vật liệu và Phương pháp 4.1.

Tất cả các thuốc thử đều được lấy từ Sigma-Aldrich Corp. (St. Louis, MO, USA). Các dung dịch gốc của Gos được chuẩn bị trong DMSO và được thêm vào dịch nuôi cấy tế bào hoặc các chế phẩm ti thể ở độ pha loãng 1/1000 (o / o).

Vui lòng bấm vào đây để biết thêm

4.2 Vật liệu trồng trọt

Nguyên liệu thực vật (hoa) từ Talipariti elatum (Sw.) (Syn. Hisbiscus elatus Sw.) (Malvaceae) được thu thập vào tháng 3 năm 2020 từ các khu vực xung quanh tại Trung tâm Nghiên cứu và Đánh giá Sinh học, Viện Khoa học Dược phẩm và Thực phẩm, La Lisa , Havana, Cuba. Chúng đã được xác thực bởi các chuyên gia về herbaria của Đại học Camagüey "Ignacio Agramonte Loynaz", nơi các mẫu chứng từ được gửi: G. Pardo., HPC -12 520 (HIPC).

Cistanche có thể cải thiện khả năng miễn dịch

4.3. Trích xuất và chuẩn bị mẫu

Cácethanolicchiết xuất được chuẩn bị từ hoa đỏ của Telatum như đã báo cáo trước đây [29]. Sau khi biến đổi chất rắn, chất rắn được tinh chế bằng các quy trình tái kết tinh [29]. Các hợp chất phân lập được đặc trưng bởi 1D 'H (400 MHz) và 13C (100 MHz) NMR. Xử lý dữ liệu NMR được thực hiện với phần mềm MestReNova phiên bản 6.1. 0-6224 dành cho Windows (Tài liệu Bổ sung, Hình S 1- S3). Dữ liệu NMR thu thập từ Gos được so sánh với các kết quả trước đó [56].

4.4. Nghiên cứu quang phổ UV / Vis và IR

Phổ UV / Vis được thực hiện trong cuvet thạch anh có chiều dài đường quang học 10 mm và độ hấp thụ được ghi lại trong UV-Vismáy quang phổUltrospec 2100 Pro của Amersham BioSci (Little Chalfont, Vương quốc Anh) được kết hợp với một máy tính có Phần mềm quét sóng (SWIFT I, 1.2) ở nhiệt độ phòng. Sự tương tác giữa Gos và các ion sắt được đo bằng cách theo dõi những thay đổi trong phổ UV / Vis. Phương pháp của Job được sử dụng để xác định tỷ lệ cân bằng giữa Gos và ion Fe (II). Các dung dịch gốc của Gos và Fe (lI) được chuẩn bị hàng ngày trong metanol và đệm photphat, tương ứng. Phổ hồng ngoại được ghi lại trên máy đo phổ JASCO FI / IR -440 trên phạm vi 4000-400 cm-I, sử dụng các viên kali bromua để chuẩn bị mẫu.

4.5. Nuôi cấy tế bào

Con chuộthải mãTế bào HT -22 (ATCC) được nuôi cấy trong môi trường DMEM được bổ sung 10 phần trăm FCS, L-glutamine (1 mM) và penicillin / streptomycin (1 phần trăm) và duy trì ở 37 độ trong môi trường 5 phần trăm CO2 được làm ẩm máy ấp trứng. Các tế bào (2 × 104 tế bào / giếng) được cấy vào 96- đĩa giếng （Nunc, Roskilde, Đan Mạch）, trong 200 μL môi trường nuôi cấy trong 24 giờ ở 37C.

4.6.Giảm tổn thương và điều trị oxy hóa tế bào bằng Gos

Hoạt động bảo vệ thần kinh của Gos （0. 001-100 μM） đã được thử nghiệm trên HT -22 bằng phương pháp đồng ủ trong 24 giờ với Gos hoặc Trolox （500 μM）, FeCl2 （100μM） và citrate （1 mM）. Sau 24 giờ, phần nổi phía trên tế bào được loại bỏ và khả năng sống của tế bào được đo bằng [3- (4, 5-dimethylthiazolThử nghiệm so màu -2- yl) -2, 5- diphenyl tetrazolium bromide] (MTT).

4.7. Thử nghiệm khả năng tồn tại của tế bào

Sau khi xử lý, các tế bào (2 × 104) được ủ với 10 uM MTT trong 3 giờ ở 37C. Dẫn xuất MTT màu sau đó được hòa tan trong 50μL DMSO, và độ hấp thụ được đếm ở bước sóng 570 nm trên một đầu đọc vi tấm (FLUOstar Omega, BMG LABTECH, Ortenberg, Đức). Khả năng sống sót của tế bào được biểu thị bằng phần trăm chống lại sự kiểm soát của các tế bào không được điều trị.

4.8. Thử nghiệm tiềm năng màng tế bào (△ Y) trong tế bào HT -22

Ti thểđiện thế màng được đánh giá trên cơ sở lưu giữ tế bào của đầu dò cation huỳnh quang rhodamine 123 [57,58]. Sau 2 giờ bị tổn thương do sắt / ascorbate trong trường hợp không có sự kiểm soát （hoặc sự hiện diện của Gos （0. 001-100 μM） hoặc Trolox （5 0 0 μM）, các tế bào thần kinh （2 × 10 *） được ủ trong 10 phút với 1 μM rhodamine 123. Sau khi ly tâm và kích hoạt lại trong 1 mL 0,1% Triton X -100, nồng độ của mẫu dò được xác định trong phần nổi bằng cách sử dụng đầu đọc vi tấm (FLUOstar Omega, BMG LABTECH, Ortenberg, Đức) ở cặp bước sóng kích thích / phát xạ 505/535 nm. Dữ liệu được biểu thị bằng tỷ lệ phần trăm so với Kiểm soát các ô chưa được xử lý.

4.9. Thử nghiệmATP

ATP trong tế bào được xác định bởi hệ thống xét nghiệm luciferin / luciferase của đom đóm [59] trong điều kiện tương tự như AY. Sự phát quang sinh học được đo bằng bộ xét nghiệm Sigma-Aldrich theo hướng dẫn của nhà sản xuất, sử dụng tùy chọn phát quang của đầu đọc vi tấm (FLUOstar Omega, BMG LABTECH, Ortenberg, Đức).

4.10.

Chuột Wistar đực (200 g) được lấy từ Trung tâm Sản xuất Động vật thí nghiệm (CENPALAB theo tên viết tắt tiếng Tây Ban Nha, Havana, Cuba) và được nuôi trong cơ sở chăm sóc động vật 1 tuần trước khi thí nghiệm trong điều kiện nhiệt độ- môi trường được kiểm soát (22-24 độ), với chu kỳ sáng / tối 12- h và khả năng tiếp cận thức ăn và nước uống.

4.11 Cách ly vật lý

Ti thể não trước của chuột được phân lập bằng cách ly tâm vi phân như đã mô tả trước đây [6 0]. Digitonin 10%, được sử dụng để phá vỡ các synaptosom và tạo ra một hỗn hợp các ti thể không synaptosomal cộng với synaptosomal. Toàn bộ thủ tục được thực hiện ở 4 độ. Tỷ lệ kiểm soát hô hấp (tỷ lệ hô hấp trạng thái 3 / trạng thái 4) luôn nằm trong khoảng 4,5 đến 6,0, được đo bằng cách sử dụng 5 mM succinate làm chất nền.

4.12. Các thử nghiệm liên tục giám sát ty thể

Điện thế màng ty thể được xác định bằng phương pháp đo quang phổ bằng cách sử dụng 1 0 μM safranine O làm đầu dò 【58,61】 trong một đầu đọc vi tấm （FLUOstar Omega, BMG LABTECH, Ortenberg, Đức) ở bước sóng kích thích / phát xạ 495/586 nm; các xét nghiệm này được thực hiện với sự hiện diện của 0,1 mM EGTA và 2 mM K, HPOA. Sự phồng lên của ty thể được ước tính bằng phương pháp đo quang phổ từ sự giảm độ hấp thụ biểu kiến ​​ở bước sóng 540 nm. Đối với các thử nghiệm, ty thể được cung cấp năng lượng với 5 mM kali succinat (cộng với 2,5 uM rotenone) trong môi trường tiêu chuẩn bao gồm 125 mM sucrose, 65 mM KC và 10 mM HEPES-KOH, pH 7,4, ở 30 độ.

4.13 Thử nghiệm peroxy hóa chất lỏng

Quá trình peroxy hóa lipid được ước tính từ quá trình tạo malondialdehyde (MDA) [28,62]. Ti thể (1 mg / mL) đã tiếp xúc với 4 mM tert-butylhydroperoxit hoặc 50uM Fe (II) cộng với 1 mM natri xitrat ở 37 độ C. Nồng độ MDA được tính bằng cách sử dụng hệ số tắt của nó (c =1. 56 × 105 M -1. Cm -1).

4,14. Xác định nồng độ Fe (II)

Nồng độ Fe (ⅡI) được xác định trong dung dịch đệm phosphat 10 mM pH 6,5 (2 mL) bằng cách tạo phức màu đỏ với 1, 10- phenanthroline (5 mM), như đã mô tả trước đây [24,28].

4.15 Giám sát tiêu thụ oxy

Mức tiêu thụ O, liên quan đến quá trình oxy hóa Fe (ⅡI) được đo bằng điện cực loại Clark (Hansatech Instruments, Pentney, King's Lynn, Vương quốc Anh) trong một buồng thủy tinh 1. 3- ml được trang bị máy khuấy từ, tại 30 độ. Tốc độ tiêu thụ oxy (ROC) được biểu thị bằng nmol O2 / mL mỗi phút.

4.16. 2- Hỗ trợ quá trình oxy hóa deoxyribose

Sự hình thành các gốc hydroxyl ("OH) được ước tính bằng cách theo sau sự phân hủy deoxyribose 2- thành MDA, được tính từ hệ số tắt của nó (e =1. 56 × 10 độ M -1 · cm-) như đã báo cáo trước đây [26,27].

4.17. Phát hiện phức hợp Gos-Fe (II)

Fe （ⅡI） （FeCl, 0. 4-1. 6 μM） được thêm vào 2 mL 10 mM） đệm phosphat （pH 6,5） chứa 2 mM xitrat và 1,6 μM Gos. Quá trình quét bước sóng từ 200-600 nm được thực hiện trong máy quang phổ Hitachi 2001 (Hitachi, Tokyo), ở 28 độ.

4.18. Phân tích thống kê

GraphPad Prism 5. 0 (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA, USA) đã được sử dụng. Phân tích thống kê được thực hiện bằng cách sử dụng ANOVA một chiều, sau đó là bài kiểm tra posthoc của Student-Newman-Keuls để so sánh theo từng cặp. Kết quả với p<0.05 were="" considered="" statistically="" significant.="" the="" half-effective="" or="" inhibitory="" concentrations="" were="" estimated="" following="" a="" non-linear="" regression="">

Tài liệu bổ sung: Các tài liệu sau đây có sẵn trực tuyến. Hình S1: Phổ lH-NMR (400 MHz) của gossypitrin trong DMSO-do, Hình S2: Phổ 13C-NMR (101 MHz) của gossypitrin trong DMSO-d, Hình S3: HSQCspectrum của gossypitrin trong DMSO-dg. Bảng S1: Dữ liệu 'H (400 MHz) và 13C (100 MHz) của gossypitrin so với báo cáo trước đó.

Sự đóng góp của tác giả:Khái niệm hóa, G.LP.-A.; phương pháp luận, MAB-V., RFD, YM-P. và GLP-A.; xác thực, MAB-V., JM-P., YM-P và RFD; phân tích chính thức, YM-P, JM-P, RF-A. và GLP-A.; điều tra, MAB-V, AA-L., DA-A., YM-P., RFD và GLP-A.; Kiểm duyệt dữ liệu, MAB-V.YM.-PJM-P. và RF-A.; viết — chuẩn bị bản nháp ban đầu, MAB-V; viết — đánh giá và chỉnh sửa, IM.-P, RF-A., YM-P và GLP-A.; visualization, YM-P., và GLP-A.; giám sát, GLP-A.; xin tài trợ, GLP-A.Tất cả các tác giả đã đọc và đồng ý với phiên bản xuất bản của bản thảo.

Kinh phí: Nghiên cứu này được tài trợ bởi VLIR (Bỉ); số cấp CU2018TEA457A103, và bởi Ministerio de Ciencia Tecnologia y Medio Ambiente (Cuba); cấp số PN223LH 010-035. APC do VLIR (Bỉ) tài trợ; số cấp CU2018TEA457A103.

Tuyên bố của Hội đồng Rà soát Thể chế:Nghiên cứu được thực hiện theo hướng dẫn của Tuyên bố Helsinki và được sự chấp thuận của Ủy ban Đạo đức Thể chế từ Viện Khoa học Dược phẩm và Thực phẩm, Đại học Havana, Cuba (Mã giao thức IFAL-CEI 087-2019, tháng 10 năm 2019) .

Tuyên bố đồng ý được thông báo: Không áp dụng. Tuyên bố về tính khả dụng của dữ liệu: Không áp dụng.

Sự nhìn nhận:Công việc này được hỗ trợ một phần bởi Vlaamse Interuniversitaire Raad (VLIR) -Belgium / Ministerio de Educacion Superior (MES) -Cuba Project CU2018TEA457A103, cũng bao gồm phí xử lý bài báo và bởi dự án PN223LH 010-035 từ "Ministerio de Ciencia Tecnologia y Medio Ambiente (Cuba), Programa de Ciencias Basicas y Naturales ”. Xung đột lợi ích: Các tác giả tuyên bố không có xung đột lợi ích.

Tính sẵn có của mẫu: Các mẫu của các hợp chất có sẵn từ tác giả tương ứng.