Graham-2023-Việc học tạo ra bảng điểm độc đáo

Trừu tượng:
Việc học có thể tạo ra sự dẻo dai sinh lý thần kinh ở vỏ não thính giác ở nhiều cấp độ. Những thay đổi lâu dài đối với chức năng vỏ não thính giác tồn tại qua nhiều ngày, nhiều tuần hoặc thậm chí cả đời, đòi hỏi phải có sự biểu hiện gen do học tập gây ra. Thật vậy, phiên mã de novo là yếu tố quyết định phân tử cho việc liệu những trải nghiệm nhất thời có chuyển thành ký ức dài hạn với tác động lâu dài đến hành vi hay không.

Với sự phát triển không ngừng của khoa học công nghệ, nhiều hiện tượng sống kỳ diệu đã xuất hiện trong quá trình sống của con người, trong đó giá trị nhất để nghiên cứu là trí nhớ. Trí nhớ là một phần quan trọng trong hoạt động thần kinh cao cấp của con người, đồng thời nó cũng là sự ghi lại và tích lũy nhiều sự kiện khác nhau đã xảy ra kể từ quá trình tiến hóa của loài người. Vậy liệu có mối liên hệ giữa biểu hiện gen và trí nhớ? Câu trả lời là có.

Đầu tiên, ảnh hưởng của gen đến trí nhớ là rõ ràng. Nó có thể điều chỉnh sự biểu hiện của nhiều loại phân tử và protein liên quan đến trí nhớ thông qua đa hình nucleotide đơn (SNP) và các phương pháp khác. Điều này có thể ảnh hưởng đến hiệu quả giao tiếp giữa các tế bào thần kinh, do đó ảnh hưởng đến các đặc điểm nhận thức, khái niệm, cảm xúc và các đặc điểm khác của một người, cho thấy chất lượng của trí nhớ.

Thứ hai, trí nhớ cũng có thể có tác động nhất định đến sự biểu hiện gen. Trong quá trình học tập, trí nhớ, tư duy của chúng ta không chỉ có sự thay đổi trong hoạt động thần kinh của não mà còn có sự điều hòa, can thiệp của nhiều gen, phân tử. Sự điều hòa của các gen và phân tử này sẽ ghi lại những dấu vết tương ứng với những cảm giác, trải nghiệm tồn tại trong trí nhớ dài hạn của chúng ta, và cuối cùng sẽ được lưu trữ trong gen.

Cuối cùng, có sự phụ thuộc lẫn nhau giữa thái độ tích cực và khả năng ghi nhớ dài hạn. Tâm trạng vui vẻ có thể giúp chúng ta tập trung và tập trung hơn trong quá trình học tập và suy nghĩ, từ đó giúp cải thiện khả năng ghi nhớ. Trí nhớ có chủ ý dài hạn cũng có thể thúc đẩy sự hình thành các kết nối và cấu trúc thần kinh mới trong não, điều này cũng rất hữu ích cho việc học tập và trí nhớ trong tương lai.

Vì vậy, chúng ta có thể kết luận rằng có mối tương quan giữa biểu hiện gen và trí nhớ. Chúng ta có thể phát huy và cải thiện khả năng ghi nhớ của mình thông qua trí nhớ có chủ ý, sự lạc quan và suy nghĩ tích cực, những điều này cũng có thể giúp chúng ta đạt được sức khỏe thể chất và tinh thần tốt hơn. Chỉ bằng cách này chúng ta mới có thể phục vụ xã hội và phát triển con người tốt hơn. Có thể thấy, chúng ta cần cải thiện trí nhớ, và Cistanche Deserticola có thể cải thiện trí nhớ đáng kể vì Cistanche Deserticola là một dược liệu cổ truyền của Trung Quốc có nhiều tác dụng độc đáo, một trong số đó là cải thiện trí nhớ. Hiệu quả của thịt băm đến từ các hoạt chất khác nhau có trong nó, bao gồm axit, polysacarit, flavonoid, v.v. Những thành phần này có thể tăng cường sức khỏe não bộ theo nhiều cách khác nhau.

Bấm biết bổ sung để cải thiện trí nhớ

Tuy nhiên, các gen vỏ thính giác hỗ trợ việc học tập thính giác, trí nhớ và hành vi đặc trưng về âm thanh thu được phần lớn vẫn chưa được biết đến. Báo cáo này là báo cáo đầu tiên xác định những thay đổi trên toàn bộ gen trong biểu hiện gen do học tập gây ra trong vỏ não thính giác được cho là nền tảng cho sự hình thành trí nhớ thính giác. Các phân tích tin sinh học về hồ sơ làm giàu gen từ trình tự RNA đã xác định các con đường sinh học bao gồm các khớp thần kinh cholinergic và tương tác thụ thể hoạt động thần kinh.

Các phát hiện này mô tả các tác nhân chính gây ra những thay đổi cơ bản trong chức năng vỏ não hỗ trợ sự hình thành trí nhớ thính giác dài hạn trong não người trưởng thành. Các phân tử và cơ chế được xác định là các mục tiêu điều trị tiềm năng nhằm tạo điều kiện cho những thay đổi lâu dài và đặc hiệu về âm thanh đối với chức năng thính giác ở tuổi trưởng thành và hiện đang là mục tiêu chính cho các nghiên cứu nhắm mục tiêu gen trong tương lai.

Bản thảo:

Một khái niệm được chấp nhận rộng rãi trong lĩnh vực học tập và trí nhớ là ký ức được lưu trữ tại nơi chúng được xử lý (Nadel & Hardt, 2011). Các sự kiện sinh học được gọi là củng cố trí nhớ có thể ổn định các biểu hiện thần kinh nhất thời được gợi lên bởi trải nghiệm giác quan (Lechner, Squire, & Byrne, 1999; McGaugh, 2000; Dudai, 2012). Các cơ chế bảo tồn cơ bản và tiến hóa khởi đầu quá trình củng cố trí nhớ là phiên mã và dịch mã, được định nghĩa là sự biểu hiện tích cực của gen và các sản phẩm protein tiếp theo của chúng (Alberini & Kandel, 2014; Costa-Mattioli và cộng sự, 2009).

Chúng tôi đưa ra giả thuyết rằng việc học phân biệt âm thanh tạo ra biểu hiện gen mới trong vỏ não thính giác. Những biểu hiện cụ thể cao của tín hiệu âm thanh có thể tồn tại lâu hơn sự ngắn ngủi của trải nghiệm (giây và phút) bằng cách củng cố thành trí nhớ dài hạn (hàng giờ đến hàng ngày) mà sau này sẽ hướng dẫn hành vi được tín hiệu âm thanh. Trong khi các cấu hình phiên mã khu vực đặc biệt được cho là chịu trách nhiệm củng cố trí nhớ (Katzman và cộng sự, 2021), các sự kiện phiên mã do học tập gây ra nhằm hỗ trợ hình thành trí nhớ trong hệ thống thính giác trung tâm lại được mô tả rất ít.

Ngược lại, vỏ não thính giác được mô tả đặc biệt rõ ràng trong các nghiên cứu về khả năng học tập thính giác và trí nhớ ở mức độ thay đổi sinh lý thần kinh, đặc biệt là trong các trường tiếp nhận và bản đồ âm điệu (Schreiner & Polley, 2014; Weinberger NM, 2015; Pienkowski & Eggermont, 2011), vỏ não- Kết nối vỏ não và vỏ não-fugal (Souffi và cộng sự, 2021; Lesicko & Geffen, 2022; Schreiner & Polley, 2014; Liu và cộng sự, 2011; Xiong, Znamenskiy, & Zador, 2015), bao gồm ở nhiều thang thời gian (Froemke & Martins , 2011; Froemke & Schreiner, 2015; Fritz, Elhilali, David, & Shamma, 2007; Tchernichovski & Margoliash, 2013). Hơn nữa, những thay đổi sinh lý thần kinh có liên quan đến hành vi, ví dụ như đối với hành động theo hướng tín hiệu (Letzkus, Wolff, & Lüthi, 2015), sự chú ý (Fritz và cộng sự, 2007; Elhilali và cộng sự, 2007) và trí nhớ đối với tín hiệu âm thanh (Bieszczad & Weinberger 2010; Grosso và cộng sự, 2015; Aschauer & Rumpel, 2016; Concina, Renna, Grosso, & Sacchetti, 2019; Letzkus, Wolff, &Lüthi, 2015; Ghosh & Zador, 2021).

Bằng chứng hàng thập kỷ về tính linh hoạt sinh lý thần kinh do học tập gây ra ở vỏ não thính giác đã cho thấy các đặc điểm hành vi chung của trí nhớ thính giác (Weinberger 2007a; 2007b), khiến nó trở thành khu vực ứng cử viên hàng đầu cho việc củng cố trí nhớ thính giác. Bằng cách nghiên cứu vỏ não thính giác về mặt sinh học, chúng tôi cũng tận dụng cơ hội không thiên vị để khám phá những người gác cổng sinh học phổ biến hoặc khác biệt trên toàn bộ não về khả năng dẻo dai thần kinh làm cơ sở cho chức năng thính giác thích ứng. Từ góc độ rộng hơn, việc lập hồ sơ phiên mã khu vực có thể dẫn đến sự hiểu biết đầy đủ hơn về cách hệ thống cảm giác được sửa đổi bởi trải nghiệm phục vụ trí nhớ.

Hồ sơ phiên mã do học tập gây ra được xác định trong vỏ não thính giác có thể xác nhận, mở rộng hoặc dẫn đến các mô hình sinh học mới của các quá trình hỗ trợ hoặc làm suy yếu quá trình xử lý thính giác thích ứng. Sự củng cố trí nhớ thính giác có thể là sản phẩm của những thay đổi phụ thuộc vào trải nghiệm trong biểu hiện gen ảnh hưởng đến các chức năng tế bào trong vỏ não thính giác, từ đó thúc đẩy những thay đổi lâu dài đối với khả năng phản ứng sinh lý thần kinh do âm thanh gợi lên làm thay đổi hành vi tín hiệu âm thanh.

Để xác định các bản phiên mã do học tập gây ra, phân tích hồ sơ biểu hiện, sử dụng trình tự RNA (RNAseq) đã được thực hiện trên các mẫu vỏ não thính giác được xác định về mặt giải phẫu (Bregma -3.10 mm, Interaural 6,90 mm; Paxinos & Watson, 2007 ) từ những con chuột trưởng thành bị hạn chế uống nước được huấn luyện để ép thanh đến tông màu thuần khiết để nhận phần thưởng là nước. Các phản hồi đối với tần số âm thuần mục tiêu (5,0 kHz; 65 dB SPL) mang lại kết quả có thưởng, trong khi các phản hồi đối với tần số không phải mục tiêu (11,5 kHz;65 dB SPL) không được trao thưởng và bắt đầu một khoảng thời gian chờ kéo dài thời gian cho thử nghiệm tiếp theo.

Nhiệm vụ phân biệt hai tông màu (2TD) này không khó về mặt nhận thức; các tần số âm thanh cách nhau hơn một quãng tám và dễ dàng được phân biệt bởi loài gặm nhấm (Talwar & Gerstein, 1998). Đúng hơn, thử thách hành vi mang tính liên kết: hiệu suất 2TD đòi hỏi trí nhớ về giai điệu nào liên quan đến phần thưởng (so với không có phần thưởng). Những con chuột được huấn luyện (N=8) đã bị hy sinh sau ba buổi huấn luyện 2TD kéo dài 45-phút liên tiếp hàng ngày và được so sánh với một nhóm chuột chưa biết nghe (N=4). Đây là thời điểm sớm trong quá trình huấn luyện khi động vật vẫn đang tiếp thu nhiệm vụ 2TD. Việc thu nhận nhiệm vụ sớm được nhắm mục tiêu để nắm bắt các sự kiện phiên mã do học tập gây ra ban đầu, tạo tiền đề cho sự gia tăng sau này về hiệu suất 2TD được quan sát thấy trong hành vi qua nhiều tuần đào tạo.

Ví dụ: hiệu suất trung bình cao hơn cơ hội nhưng chỉ đạt 66±7,81% sau 3 ngày, so với Lớn hơn hoặc bằng 90% sau khi tập luyện kéo dài (Shang, Bylipudi, &Bieszczad, 2019). Để tận dụng cơ hội xác định biểu hiện của các gen liên quan đến trí nhớ liên kết đặc hiệu với âm thanh thành công, chúng tôi đã tận dụng chất ức chế HDAC nhằm mục tiêu điều hòa biểu hiện gen phụ thuộc vào hoạt động trong học tập và hình thành trí nhớ (McQuown, et al., 2011; Kwapis, et cộng sự, 2017; Malvaez và cộng sự, 2012). Điều quan trọng là, một thập kỷ nghiên cứu đã chỉ ra rằng việc ức chế HDAC có thể tạo điều kiện thuận lợi cho tính linh hoạt sinh lý thần kinh do học tập gây ra trong các phản ứng vỏ não thính giác do âm thanh gợi lên (so với phương tiện) và tăng cường các hành vi phân biệt thính giác (Bieszczad và cộng sự, 2015; Phan và cộng sự, 2017; Shang, Bylipudi, &Bieszczad, 2019; Rotondo & Bieszczad, 2020; Rotondo & Bieszczad 2021a; 2021b) bao gồm cả những kẻ vô nhân đạo (Gervain, et al., 2013).

Một nửa số động vật được huấn luyện đã được điều trị bằng chất ức chế HDAC, RGFP966 (N=4; 10 mg/kg, ApexBio, cat#A8803; sub. cu. tiêm) , trong khi nửa còn lại là giải pháp phương tiện được đào tạo nhưng được quản lý rõ ràng (N=4; khối lượng phù hợp, tiêm phụ; Hình 1a). Không có sự khác biệt về hiệu suất 2TD giữa các nhóm tại thời điểm thu thập ý kiến ​​(RGFP966: 61±5,0% so với Xe: 71±7,0%; t(5.9166)=-1.21, p=0.272 ; Thử nghiệm t của Welch). Não được thu thập ngay lập tức và đông lạnh nhanh tại một mốc thời gian phù hợp với nồng độ đỉnh của chất ức chế trong vỏ thính giác, một giờ sau khi tiêm chất ức chế HDAC hoặc chất dẫn (Bieszczad và cộng sự, 2015).

Những phát hiện ở đây là những phát hiện đầu tiên xác định hồ sơ phiên mã của việc học tập kết hợp trong vỏ não thính giác. Học về những thay đổi do nhiệm vụ phân biệt hai giai điệu gây ra ở mức độ phiên mã của hàng trăm gen (so với âm thanh ngây thơ) (Hình 1b). Thuật toán phân cụm theo cấp bậc cho thấy các gen được điều hòa hoặc điều hòa giảm duy nhất, cho thấy một mạng lưới phức tạp gồm các sự kiện biểu hiện gen vỏ não gây ra bởi quá trình học tập thính giác (Hình 2a).

Các phân tích làm giàu (iPathwayGuideTM; phương pháp phân tích tác động) đã xác định cholinergicsynapse (các gen biểu hiện khác biệt (DEG) / tất cả các gen (ALL): 22/101; p=0.004, Bonferroni Correction) là con đường sinh học hàng đầu (Bảng 1) . Kết quả này phù hợp với nghiên cứu từ những năm 1990 nhấn mạnh tính đầy đủ của tín hiệu cholinergic trong vỏ thính giác đối với tính linh hoạt sinh lý thần kinh và hành vi thính giác liên quan (Froemke & Martins, 2011; Weinberger, 2003; Bakin & Weinberger, 1996; Kilgard & Merzenich, 1998). Mức độ phiên mã gây ra bởi việc học dưới sự ức chế HDAC hoặc được khuếch đại theo cùng một hướng (tăng thêm hoặc giảm hơn nữa về mức độ phiên mã gen duy nhất) (Hình 2b) hoặc bị giảm sút so với việc học một mình (Hình 2c). Một con đường sinh học hàng đầu trong những điều kiện này là tương tác phối tử-thụ thể hoạt động thần kinh (DEG/ALL: 30/194; p=0.016; Bảng 1) liên quan đến các tác nhân quan trọng đối với hoạt hóa thần kinh.

Một con đường hàng đầu khác là tương tác với thụ thể ma trận ngoại bào (thụ thể ECM) (DEG/ALL: 14/69; p=0.04; Bảng 1). Các thành phần của ECM rất quan trọng đối với độ dẻo của vỏ não và củng cố trí nhớ (Happel, et al., 2014; Banerjee, et al., 2017; El-Tabbal, et al., 2021; Sonntag, et al., 2015). Những con đường này đưa ra những lựa chọn thay thế tiềm năng, có lẽ là bổ sung, cho tín hiệu cholinergic có thể tạo điều kiện cho những thay đổi lâu dài phụ thuộc vào kinh nghiệm trong chức năng thính giác (Ji, Gao, & SUGA, 2001; Luo & Yan, 2013; Metherate, 2011). Các gen khác có biểu hiện thay đổi khi học bằng thính giác nhưng không bị ức chế HDAC hơn nữa có khả năng liên quan đến các điều kiện quy trình của nhiệm vụ, hơn là liên quan đến trí nhớ kết hợp đặc trưng của âm thanh. Ví dụ: đường truyền tín hiệu apelin đã được xác định (DEG/ALL: 20/116; p=0.0005), đường này rất quan trọng trong não đối với việc điều hòa cân bằng nội môi lượng nước đưa vào (Hu, et al., 2021). Một so sánh trực tiếp về mức độ phiên mã giữa hai nhóm chuột được huấn luyện (học có hoặc không có sự ức chế HDAC) cho thấy rất ít gen được biểu hiện khác biệt (DEG).

Ngưỡng được sử dụng đáng kể để xác định các DEG có khả năng nhất (p =0.05) chỉ tìm thấy Adamts13, U6, Rexo4 và Cabin1 được biểu thị khác nhau (Hình 2d). Do đó, tác động chính của việc ức chế HDAC dường như điều chỉnh sự biểu hiện của các gen gây ra bởi việc học thính giác trong điều kiện bình thường, thay vì tuyển dụng các gen mới để duy trì trí nhớ đặc trưng về âm thanh. Cùng với nhau, những phát hiện này cho thấy những thay đổi phiên mã quy mô lớn xảy ra ở vỏ não thính giác ngay từ giai đoạn huấn luyện sớm khi động vật trưởng thành học cách phân biệt các mối quan hệ liên kết giữa các tín hiệu âm thanh. Cùng với các báo cáo hành vi và sinh lý thần kinh đã được xác lập về việc ức chế HDAC để thúc đẩy chức năng thính giác, những phát hiện này ủng hộ chiến thuật sử dụng chất ức chế HDAC để phân biệt các gen có biểu hiện quyết định sự thành công của việc hình thành trí nhớ thính giác.

Một số gen quan tâm (GOI) đã được chọn từ quá trình phân tích làm giàu các con đường sinh học để xác nhận trình tự toàn bộ bộ gen bằng cách tiếp cận nhắm mục tiêu vào gen. Các mẫu được thu thập từ các đoàn hệ riêng biệt sao chép hai nhóm động vật được huấn luyện và điều trị ở cùng một giai đoạn đầu mốc thời gian đào tạo (tức là một giờ sau buổi đào tạo 2TD thứ ba) để sử dụng trong phân tích biểu hiện gen bằng cách sử dụng phản ứng chuỗi polymerase thời gian thực định lượng (qRT-PCR). Không có sự khác biệt về hiệu suất 2TD trong các nhóm tái tạo(RGFP9661: 61±5.0% so với RGFP9662: 67±6.0%; t(8.441)=-0.834, p {{2{25}}}.4274; và Xe1:71±6.0% so với Xe2: 74±3,0%; t(4.0809)=-0.444, p {{ 34}}.6796; bài kiểm tra t của Welch).

GOI đầu tiên là Egr1, một "gen sớm ngay lập tức" phụ thuộc vào hoạt động đã được nghiên cứu kỹ lưỡng, được biết là đạt cực đại trong những giờ học đầu tiên và rất quan trọng cho việc hình thành trí nhớ (Duclot & Kabbaj, 2017). Đó là một gen do toplearning gây ra với biểu hiện gia tăng đã được xác nhận cũng được khuếch đại tương tự với sự ức chế HDAC trong một nhóm động vật riêng biệt trong nghiên cứu nhắm vào gen (Hình 3). Điều tương tự cũng đúng với Per2, một gen liên quan đến việc điều hòa nhịp sinh học và con đường serotoninergic trong não (Bae, et al., 2001; Albrecht, et al., 2001; Cuesta, et al., 2009; Reh, et al. ,2020). Per2 là một phần của họ "gen đồng hồ" có liên quan đến sự điều biến HDAC ở các vùng não khác (Kwapis, et al., 2018) và cũng có thể có vai trò trong chức năng thính giác (Reh et al., 2020). Ngược lại, một số GOI được xác định trên toàn bộ bộ gen chỉ được xác nhận một phần.

Chrna7 mã hóa một tiểu đơn vị của thụ thể acetylcholine nicotinic động (nAChR) được phát hiện là có khả năng điều hòa kém với hoạt động học tập thính giác, phù hợp với bằng chứng sinh lý thần kinh (Takesian, et al., 2018; Kuchibhotla, et al., 2017). Do đó, chúng tôi mong đợi nghiên cứu nhắm mục tiêu vào gen sẽ xác nhận sự điều hòa giảm Chrna7 ở tất cả các động vật được huấn luyện 2TD, nhưng sự điều chỉnh giảm rõ ràng chỉ là những động vật được điều trị bằng phương tiện học được 2TD mà không bị ức chế HDAC. Các GOI được chọn bổ sung là từ họ thụ thể hạt nhân mồ côi Nr4a, Nr4a1 và Nr4a2, là những gen ngay lập tức được báo cáo là cần thiết để truyền bá các tác động hạ lưu của mục tiêu HDAC chọn lọc của RGFP966 ở các vùng não khác (McQuown và cộng sự, 2011; Kwapis, et al. ., 2019).

Phù hợp với các báo cáo trước đây về sự khác biệt khu vực phụ thuộc vào nhiệm vụ trong biểu hiện gen họ Nr4a (McNulty và cộng sự, 2012), Nr4a1 chứ không phải Nr4a2 được điều chỉnh tăng trong vỏ não thính giác sau khi học thính giác. Các DEG khác, Htr1a hoặc Adamts13, không được xác nhận bởi nghiên cứu nhắm mục tiêu gen có thể do sự khác biệt trong các biến thể phiên mã đã biết không được phát hiện bởi các đầu dò nhắm mục tiêu gen được thiết kế tùy chỉnh của chúng tôi hoặc do lỗi loại I hoặc do sự khác biệt tinh tế về hành vi giữa các nhóm động vật được huấn luyện mà không bị phát hiện trong các thước đo hiệu suất 2TD. Chúng tôi cũng đã nghiên cứu Lynx1, một gen có lịch sử lâu dài về chức năng mở lại tính dẻo giống như "giai đoạn quan trọng" ở vỏ não cảm giác (Morishita và cộng sự, 2010), có thể là do tác động của nó đối với sự điều chế cholinergic và serotonergic (Takesian, et al. , 2018). Tuy nhiên, phù hợp với các báo cáo trên toàn bộ gen trước đây không phát hiện được nó (Kalish và cộng sự, 2020), nó không được phát hiện trong tập dữ liệu RNAseq của chúng tôi cũng như nghiên cứu nhắm mục tiêu vào gen.

Mặc dù vẫn còn một thách thức để xác định liệu sự khác biệt có thể được giải thích bằng sự biến đổi sinh học hoặc cá thể thực sự giữa các động vật hay do tính biến đổi kỹ thuật với độ phong phú thấp hoặc bảng điểm biểu hiện cụ thể của loại tế bào, chúng tôi báo cáo kết quả đặc biệt nhất quán đối với một số GOI. Vì sự biểu hiện do học tập của Chrna7, Egr1 và Per2 nhất quán giữa các cách tiếp cận nhắm mục tiêu gen và toàn bộ bộ gen, và giữa các nhóm động vật được huấn luyện khác nhau, nên có lý do rằng những gen này có thể là nhân tố cơ bản nhất cho những thay đổi lâu dài đối với chức năng thính giác và trí nhớ và hiện nay là cơ sở quan trọng cho việc nghiên cứu trong tương lai.

Khi xem xét cùng nhau, các phát hiện này cho thấy bối cảnh phiên mã năng động trong vỏ não thính giác của người trưởng thành có thể hỗ trợ chức năng thính giác nổi bật trong sinh lý thần kinh và hành vi. Với bằng chứng ngày càng tăng về các biện pháp kiểm soát biểu sinh đối với chức năng hệ thống cảm giác (cf, Shang &Bieszczad, 2022), thật thú vị khi xem xét các cơ chế biểu sinh đóng vai trò như thế nào trong việc cân bằng sự ổn định với tính linh hoạt phụ thuộc vào kinh nghiệm của các mạch vỏ não thính giác. Ví dụ, bộ dữ liệu toàn bộ bộ gen hiện tại cũng xác định sự giảm biểu hiện do học tập gây ra của histone deacetylase gây ức chế, Hdac9, không có khi ức chế HDAC.

Thật hấp dẫn khi so sánh tác động của việc giảm biểu hiện HDAC9 với tác dụng ức chế HDAC về mặt dược lý để thúc đẩy quá trình phiên mã do học tập gây ra. Một loại chất điều hòa biểu sinh quan trọng khác làm thay đổi DNA chứ không phải histone. Các ví dụ là Tet1 và Gadd45b đều tác động đến quá trình methyl hóa DNA (Bayraktar & Kreutz, 2018) và được phát hiện là có mức độ điều chỉnh tăng và giảm tương ứng với quá trình học tập, dưới sự ức chế HDAC. Hơn nữa, một loại microRNA xuất hiện như là con đường sinh học hàng đầu được tạo ra bằng cách học với chất ức chế HDAC (xem Bảng 1), đã thu hút được sự chú ý trong lĩnh vực này với tư cách là bộ điều chỉnh biểu sinh quan trọng trong kiểm soát phiên mã thần kinh (Saab & Mansuy, 2014). Tương tác phân tử bậc cao giữa các tác nhân biểu sinh và sản phẩm protein của các gen biểu hiện cũng có thể xảy ra. Ví dụ: Egr1 được điều chỉnh tăng đã xác định có thể tuyển dụng Tet1 để loại bỏ các dấu hiệu methyl hóa kìm hãm nhằm kích hoạt các gen hạ lưu (Sun và cộng sự, 2019). Sẽ cần có những nghiên cứu phân tử sâu hơn để phân tích tầm quan trọng của sự tương tác giữa các cơ quan điều chỉnh biểu sinh trong hệ thống thính giác trong quá trình học tập. Hơn nữa, báo cáo này mang đến cơ hội ngay lập tức để thiết lập mối liên kết giữa các gen vỏ não thính giác chọn lọc và các tác nhân tác động ở hạ lưu của chúng.

Việc thu hẹp khoảng cách giữa các gen và phân tử này với ảnh hưởng của chúng đối với các sự kiện sinh lý thần kinh do âm thanh gợi lên là điều cần thiết để hiểu cách hệ thống thính giác của người trưởng thành thích nghi với trải nghiệm để thay đổi hành vi. Thật vậy, việc dịch mã phiên mã de novo cần thiết cho những thay đổi lâu dài đối với chức năng hành vi vì chúng tạo ra những thay đổi lâu dài đối với chức năng tế bào. Ví dụ: các tác nhân mục tiêu chính của quá trình phiên mã do học tập gây ra có thể làm thay đổi tính khả dụng của các kênh hoặc thụ thể (Metherate, Intskirveli, & Kawai, 2012; Brown & Kaczmarek, 2011; Henton, Zhao, & Tzounopoulos, 2023) trong các mạch xác định âm thanh- ngưỡng gợi lên, khả năng phản hồi và cấu trúc trường tiếp nhận trong hệ thống thính giác. Thật hợp lý khi cho rằng các nhiệm vụ thính giác khác nhau sẽ tuyển dụng các mạng gen duy nhất cho các con đường sinh học liên quan đến các chức năng tế bào cụ thể sẽ hỗ trợ việc học về tính năng âm thanh hoặc cấu trúc nhiệm vụ liên quan đến nhiệm vụ.

Nhìn chung, báo cáo này đóng vai trò là điểm khởi đầu để cung cấp các bộ dữ liệu RNAseq từ vỏ não học tập, người lớn và thính giác (xem Kho lưu trữ dữ liệu). Một nỗ lực nhằm thu hẹp khoảng cách kiến ​​thức trở nên trầm trọng hơn do thiếu nghiêm trọng các nghiên cứu tập trung vào các quá trình di truyền phân tử trong vỏ não thính giác của người trưởng thành hiện đang được hoan nghênh. Chúng tôi khuyến khích nghiên cứu vượt ra ngoài giới hạn không gian-thời gian của việc giải trình tự RNA số lượng lớn mà độ nhạy bị giới hạn về mặt kỹ thuật cũng như độ sâu đọc (Li& Wang, 2021), đặc biệt là vì các công nghệ Omics hiện đại đang phát triển và cải tiến nhanh chóng.

Trong khi nghiên cứu về vỏ não thính giác đã đạt được một số bước tiến ban đầu trong di truyền phân tử đã xác định được các tầng phân tử thiết yếu (Schicknick, et al., 2008), các cấu hình IEG dễ dãi (Mello, Velho, & Pinaud, 2006; de Hoz, et al., 2018) ; Peter, và cộng sự, 2011) và thậm chí cả động lực học sắc tố (Peter, và cộng sự, 2021), đã có tiền lệ ở vùng ngoại vi thính giác nơi động lực phiên mã được nghiên cứu rất kỹ (Kwan, 2016; Barta, và cộng sự, 2018; Li, et al. cộng sự, 2020; Ebeid và cộng sự, 2017). Các công cụ phân tử hiện có như giải trình tự RNA đơn bào (RNA-Seq) và lai huỳnh quang phân tử nhỏ tại chỗ (smFISH) sẽ hữu ích để cung cấp những hiểu biết sâu sắc về sự biến đổi giữa các tế bào phụ thuộc vào kinh nghiệm và các tương tác phân tử trong các tế bào và mạch vỏ não thính giác. Không giống như RNAseq số lượng lớn, các phương pháp này tôn vinh sự đa dạng sâu sắc của tế bào và tổ chức bậc cao trong vỏ thính giác, chẳng hạn như vi mạch theo lớp cụ thể và địa hình dải não.
Các cách tiếp cận thông minh để gắn thẻ và phiên mã trình tự chỉ từ các tế bào vỏ não thính giác mới hoạt động gần đây (Cho, Huang, & Gray, 2016) có thể tăng độ nhạy đủ để thu được các bộ gen phù hợp nhất về chức năng từ các loại tế bào và quần thể tế bào phù hợp nhất về chức năng. Các phương pháp tiếp cận tương tự cũng có thể được sử dụng dưới vỏ não để nắm bắt và đối chiếu các hồ sơ phiên mã khu vực phụ thuộc vào hoạt động ở vỏ não nhằm tôn vinh sự tích hợp đáng kinh ngạc của vỏ não với chức năng dưới vỏ não của hệ thống thính giác trong các điều kiện nghe hoặc nhu cầu hành vi khác nhau. Việc mô tả đầy đủ các khác biệt của tế bào và khu vực trong các cơ chế di truyền và phân tử làm cơ sở cho việc học tập thính giác ở não người trưởng thành là điều tối quan trọng để phát triển các phương pháp trị liệu chính xác nhắm mục tiêu vào phân tử và chọn lọc tại địa điểm, cho phép thay đổi chức năng mạnh mẽ và liên tục để hỗ trợ khả năng nghe và nghe cụ thể trong suốt tuổi thọ.

phương pháp

Đối tượng: Tổng cộng 24 con chuột đực Sprague-Dawley trưởng thành (250 – 300 g khi đến nơi; Charles RiverLaboratories, Wilmington, MA) đã được sử dụng trong các thí nghiệm hành vi và phân tử. Tất cả động vật đều được nhốt riêng trong phòng thuộc địa được kiểm soát nhiệt độ (24 ˚C) trong chu kỳ sáng/tối 12-giờ. Các đối tượng được tiếp cận tự do với thức ăn và nước uống trước khi huấn luyện hành vi. Tất cả các thủ tục đã được phê duyệt và thực hiện theo hướng dẫn của Ủy ban Chăm sóc và Sử dụng Động vật Thể chế (IACUC) tại Rutgers, Đại học Bang New Jersey (Nghị định thư số: 999900026 (KMB)).

Bộ máy hành vi và kích thích âm thanh: Tất cả các phiên hành vi được tiến hành trong hai buồng điều hòa nhạc cụ giống hệt nhau (H{0}}TC-NSF; Coulbourn Instruments, Holliston, MA) trong một hộp giảm âm. Các buổi huấn luyện hàng ngày được cân bằng để đảm bảo khả năng tiếp xúc bình đẳng cho cả hai phòng. Mỗi buồng (12" W x 10" D x 12" H; sàn lưới thép được lắp cần phản hồi (H21-03R), đèn trong nhà (H11-01R), loa (H{ {8}}R) và hệ thống phân phối nước (H14-05R). Trong giai đoạn huấn luyện, động vật có thể nhấn cần phản ứng ("barpress"), điều này sẽ kích hoạt việc xuất hiện cốc nước (~0,02cc) trong cổng phần thưởng (1,25"W x 1,625" H). Một công tắc tay (H21-01) đã được sử dụng trong phiên đầu tiên để định hình phản ứng nhấn thanh của con vật nhằm kích hoạt phần trình bày về cốc nước cho phép truy cập vào phần thưởng nước. Các phản hồi hành vi được ghi lại bằng phần mềm Graphic State 4 (CoulbournInstruments, Holliston MA) để phân tích ngoại tuyến.

Tất cả các kích thích thính giác được tạo ra bằng phần mềm Tucker-Davis Technologies (TDT, Alachua, FL) vàRPvdsEx và được trình bày qua loa treo tường của buồng vận hành. Tiếng ồn trắng (trong quá trình đào tạo theo thủ tục; Hình 1a) được hiển thị trong thời lượng 7 hoặc 9 giây (75 dB SPL). Âm thanh thuần túy (trong quá trình đào tạo phân biệt hai tông màu; Hình 1a) luôn được hiển thị trong 8 giây (70dB SPL). Mức âm thanh được hiệu chỉnh hàng ngày bằng máy đo âm thanh kỹ thuật số (Larson DavisSoundTrack LxT1).

Huấn luyện hành vi và ức chế dược lý của HDAC3: Sau một ngày làm quen với thevivarium, chuột được xử lý hàng ngày trong tối thiểu 3 ngày. Trước khi bắt đầu huấn luyện hành vi, chuột được đưa vào lịch uống nước hạn chế cho đến khi chúng đạt 85% trọng lượng không hạn chế của động vật đối chứng cùng lứa tuổi. Sau đó, những con chuột bị hạn chế sử dụng nước được tạo hình bên trong các buồng giảm âm để ngăn cản phần thưởng nước (Hình 1a). Việc tạo hình máy ép và huấn luyện âm thanh tiếp theo đã được mô tả trước đây (Shang, Bylipudi, & Bieszczad, 2019). Tóm lại, tất cả các động vật đều được tạo hình để ép máy trong 5 ngày và sau đó được huấn luyện trong một nhiệm vụ quy trình để học cách nhấn máy để phát ra âm thanh, trong giai đoạn này là một kích thích tiếng ồn Gaussian băng rộng (1-12.5 kHz tiếng ồn trắng được lọc thông dải; 75 dB SPL), để nhận được phần thưởng là nước. Tất cả các loài động vật đã học thành công cách liên kết âm thanh này với phần thưởng trước khi tiếp tục giai đoạn huấn luyện tiếp theo. Quá trình huấn luyện theo quy trình cho thấy sự khác biệt của từng cá nhân về tốc độ mà động vật có thể học được nhiệm vụ để đạt được hiệu suất cao. Tuy nhiên, tất cả các loài động vật đều có thể đạt được mức hiệu suất Lớn hơn hoặc bằng 90% trong hai ngày liên tiếp (trung bình là=92,85%, sem =0,01%) sau trung bình 12,67 ngày ( sd=2,85 ngày). Hiệu suất được tính bằng 100%.

Giai đoạn huấn luyện tiếp theo là nhiệm vụ phân biệt hai tông màu (2TD) (Hình 1a), trong đó chuột được huấn luyện để phân biệt giữa hai tần số âm thanh khác biệt về mặt quang phổ. Nhấn nút vào âm S+ (5.0 kHz; 70 dB SPL) sẽ dẫn đến phần thưởng nước, trong khi nhấn nút vào Đá (11,5 kHz; 70 dB SPL) sẽ dẫn đến tín hiệu lỗi (nhà nhấp nháy sáng) và "hết thời gian" (đợi thêm 6 giây để bắt đầu thử nghiệm tiếp theo). Các thử nghiệm S+ và S-S được chọn ngẫu nhiên và kéo dài trong 8 giây. Khoảng thời gian giữa các lần thử nghiệm (ITI) trung bình là 15 giây (phạm vi: 5-25 giây, ngẫu nhiên). Máy ép bar trong ITI im lặng không có tác dụng gì (không hết thời gian chờ, không có tín hiệu lỗi cũng như không có phần thưởng nước). Các buổi học hàng ngày có thời lượng 45 phút. Tất cả các động vật thực hiện nhiệm vụ 2TD trong tổng cộng ba ngày liên tiếp. Những con chuột được ghép đôi bởi một người quan sát đã được đào tạo để những con vật có tỷ lệ đạt được nhiệm vụ quy trình tương tự nhau sẽ được chỉ định các điều kiện điều trị khác nhau trong giai đoạn 2TD. Các cặp phù hợp với hiệu suất đã được tiêm toàn thân chất ức chế HDAC3 loại I RGFP966 (Abcam Inc., ab144819; 10 mg/kg;sc; N=12) hoặc dung dịch tá dược (N=9) ngay sau mỗi cặp Phiên 2TD. Hiệu suất của nhiệm vụ2TD được tính toán như mô tả trước đây: 100% (Shang,Bylipudi, & Bieszczad, 20).

).Thu thập mô và phân lập RNA: Một giờ sau khi động vật được tiêm RGFP966 lần thứ ba và cũng là lần cuối cùng sau đợt 2TD thứ ba, não nhanh chóng được mổ xẻ và đông lạnh nhanh trong cốc chứa 2-methylbutane đặt trên đá khô. Sau đó, bộ não đông lạnh nhanh được bảo quản ở nhiệt độ -80˚ C cho đến khi xử lý trong tương lai. Để chuẩn bị cho việc cắt lạnh não, não được bọc trong hợp chất nhiệt độ cắt (OCT) không tối ưu và được bảo quản ở nhiệt độ -20˚ C trong 12-24 giờ để đảm bảo mô não sẽ đạt đến -20˚ C để cắt. Các bộ não được bọc trong OCT sau đó sẽ được cắt theo chiều ngang trong một bộ điều hòa nhiệt độ (Leica CM 3050S) ở độ dày 250 µm. Sử dụng một cú đấm siêu nhỏ mô tròn 1 mm, 2 mm3 mô vỏ thính giác từ mỗi bán cầu (được kết hợp thành một mẫu với tổng số 4 mm3 trên mỗi vùng não) đã được lấy mẫu để chiết RNA. Định vị vỏ não thính giác được xác định bằng cách sử dụng The Rat Brain in Stereotaxic Tọa độ của Paxinos và Watson (ấn bản thứ 6) làm tài liệu tham khảo (khoảng A/P=-3.6 đến -5.8 mm, M/L {{20} } ±6,4 mm D/V=-4.2 đến -5.8 mm; và sử dụng hồi hải mã làm mốc

Tổng số RNA từ mỗi mẫu được phân lập bằng PureLinkTM RNA Mini Kit (ThermoFisher) theo giao thức của nhà sản xuất. Sau đó, các mẫu RNA được tinh chế bằng Bộ công cụ RNA Clean andConcentrator™ -25 (Zymo Research).

Gene expression analysis, Gene Ontology (GO) biological process analysis, and gene set enrichment analysis (GSEA): RNA-seq analysis was conducted by the Iowa Institute of Human Genetics (IIHG; Iowa City, IA, USA). Briefly, using 500 ng total RNA (all RIN values >8), các thư viện giải trình tự đã được tạo bằng cách sử dụng Illumina TruSeq® Stranded mRNA Library Prepkit theo các giao thức được đề xuất của nhà sản xuất. Các thư viện đã được gộp lại và trình tự được thực hiện trên Illumina NovaSeq 6000 chạy 100 bp SBSchemistry kết thúc theo cặp. Các lần đọc được xử lý bằng quy trình tin học nguồn mở 'bcbio-nextgen.py' được phát triển chủ yếu tại Tin sinh học Harvard Chan (v.1.2.4) chạy trên Argon HPCresource tại Đại học Iowa. Quy trình này bao gồm các phương pháp 'thực hành tốt nhất' để kiểm soát chất lượng đọc, căn chỉnh đọc và định lượng. Quy trình 'bcbio-nextgen.py' đã được chạy ở chế độ "RNA-seq" với khóa 'rn6' làm bản dựng bộ gen đã chọn (tham chiếu nội bộ tập hợp Ensembl và bản dựng gen 'Rnor_6.0'). Quy trình được căn chỉnh đọc tới bộ gen Rnor_6.0 bằng cách sử dụng bộ căn chỉnh hisat2 cực nhanh, nhận biết mối nối (2.2.1) và đồng thời định lượng các lần đọc vào bộ phiên mã bằng cách sử dụng bộ căn chỉnh 'cá hồi' (1.4.0). Qualimap (2.2.2), một công cụ tính toán kiểm tra các tệp căn chỉnh BAM hisat2, được sử dụng để kiểm tra dữ liệu đã đọc để kiểm soát chất lượng. Điểm chất lượng trình tự đã vượt qua các bước kiểm tra cơ bản và tỷ lệ sao chép trình tự nằm trong giới hạn chấp nhận được. Tất cả các mẫu đã vượt qua QC để căn chỉnh đọc đến các vùng exonic. Định lượng bản phiên mã có nguồn gốc từ cá hồi (TPM hoặc "bản phiên mã trên một triệu") đã được nhập và tóm tắt theo số lượng ước tính ở cấp độ gen bằng cách sử dụng tximport (1.12.3) trong Rstudio, như được mô tả trong phần tốt nhất- thực hành họa tiết DESeq2(https://bioconductor.org/packages/release/bioc/vignettes/DESeq2/inst/doc/DESeq2.html).

Các gen có số lượng ước tính ít hơn 5 trên tất cả các mẫu đã được lọc trước từ phân tích xuôi dòng, theo quy trình được đề xuất. Phân tích biểu hiện gen khác biệt được tiến hành với DESeq2 (v.1.24.0) trên số lượng cấp độ gen ước tính. FDR là 5% và X< abs(logFC) < 10 was set as a cutoff for differential expression (DEGs). Heatmaps, line graphs, and volcano plots were generated using clusterProfiler packages in R/Bioconductor. Gene level, pathway, and DEG analyses were generated using iPathwayGuide (Advaita Bioinformatics, https://www.advaitabio.com/ipathwayguide; last accessed November 15, 2022). iPathwayGuide scores pathways using the Impact Analysis method (Draghici et al., 2007); Tarca et al., 2009, Khatri et al., 2007). The underlying pathway topologies, comprised of genes and their directional interactions, are obtained from the KEGG database (Kanehisa et al., 2000; Kanehisa et al., 2010; Kanehisa et al., 2012; Kanehisa et al., 2014).

Xác thực dữ liệu RNA-seq bằng qRT-PCR: Dữ liệu RNA-seq được xác thực bằng qRT-PCR trên mRNA được chiết xuất từ ​​các nhóm chuột khác nhau. Năm bản ghi đã được chọn từ danh sách DEG mới được tìm thấy ở từng khu vực ở mức cơ bản. Ba trong số các gen được dựa trên giả thuyết dựa trên tài liệu về hành vi và sinh lý vỏ não thính giác, trong khi ba gen khác là các gen mới được xác định từ cấp độ gen và phân tích DEG khi so sánh giữa Nhóm Thuốc và Nhóm Xe. Tất cả các trình tự mồi đều được chọn từ tài liệu trước đây về mô não ở chuột (các trình tự được cung cấp trong bảng bên dưới) hoặc được thiết kế bằng NCBI Primer Blast và được xác nhận tính đặc hiệu của mục tiêu bằng cách đánh giá trình tự sản phẩm khuếch đại PCR và đường cong tan chảy. Các phân tích qRT-PCR được thực hiện trong QuantStudio 3 (Hệ thống sinh học ứng dụng) với SsoAdvancedTMUniversal SYBR Green Supermix (Bio-Rad). Đối với mỗi mẫu, 500 ng cDNA được khuếch đại bằng cách sử dụng Bộ tổng hợp iScriptTM cDNA (Bio-Rad).

Sự nhìn nhận

Các tác giả xin cảm ơn Tiến sĩ Andrea Shang, Sean Tsaur và Sooraz Bylipudi vì sự hỗ trợ của họ trong các quy trình và phân tích hành vi; Tiến sĩ Mimi L. Phan đã hỗ trợ cô về quy trình chiết RNA và thu thập mẫu; Tiến sĩ Troy A. Roepke, Ali Yasrebi và ChristopherO'Brien đã hỗ trợ phân tích tinh chế mẫu RNA; và Alisa Ray để được hỗ trợ kỹ thuật. Chúng tôi xin cảm ơn tất cả nhân viên hiện tại và trước đây của CLEF Lab vì sự giúp đỡ và hỗ trợ của họ.

Công trình này được hỗ trợ bởi Viện Y tế Quốc gia, Viện Điếc và Rối loạn Giao tiếp Quốc gia [R01-DC014753 tới KMB]; Trường Nghệ thuật và Khoa học tại Đại học Rutgers; Quỹ Aresty tại Đại học Rutgers với nguồn tài trợ nhỏ cho nghiên cứu bậc đại học; và chương trình Project SUPER tại Đại học Rutgers với nguồn tài trợ nhỏ cho nghiên cứu ở bậc đại học.

Người giới thiệu:

Alberini, CM, & Kandel, ER (2014). Quy định phiên mã trong củng cố bộ nhớ. Quan điểm của ColdSpring Harbor trong Sinh học, 7(1), a021741.doi:https://doi.org/10.1101/cshperspect.a021741

Albrecht, U., Zheng, B., Larkin, D., Sun, Z., & Lee, C. (2001). MPer1 và mper2 rất cần thiết cho việc thiết lập lại đồng hồ sinh học bình thường. J Biol Nhịp điệu, 16, 100-104. doi:10.1177/074873001129001791.

Aschauer, D., & Rumpel, S. (2016). Vỏ não cảm giác và trí nhớ liên kết. Khoa học thần kinh hành vi về học tập và trí nhớ, 37, 177-211.doi:https://doi.org/10.1007/7854_2016_453

Bae, K., Jin, X., Maywood, ES, Hastings, MH, Reppert, SM, & Weaver, DR (2001). Chức năng vi phân của mPer1, mPer2 và mPer3 trong đồng hồ sinh học SCN. Neuron, 30, 525-536.doi:10.1016/S0896-6273(01)00302-6.

Bakin, JS, & Weinberger, NM (1996). Tạo ra trí nhớ sinh lý ở vỏ não bằng cách kích thích nhân nền. Kỷ yếu của Viện Hàn lâm Khoa học Quốc gia Hoa Kỳ, 93(20), 11219-11224. doi:https://doi.org/10.1073/pnas.93.20.11219

Banerjee, SB, Gutzeit, VA, Baman, J., Aoued, HS, Doshi, NK, Liu, RC, & Ressler, KJ (2017). Mạng lưới quanh dây thần kinh ở vỏ não cảm giác của người trưởng thành là cần thiết cho việc học về nỗi sợ hãi. Tế bào thần kinh, 95(1), 169-179. doi:10.1016/j.neuron.2017.06.007

Barta, CL, Liu, H., Chen, L., Giffen, KP, Li, Y., Kramer, KL, . . . Anh ấy, DZ (2018). Phân tích phiên mã RNA-seq của tế bào lông tai trong của cá ngựa vằn trưởng thành. Dữ liệu khoa học, 5, 180005.doi:https://doi.org/10.1038/sdata.2018.5

Bayraktar, G., & Kreutz, MR (2018). Vai trò của việc khử bằng DNA phụ thuộc vào hoạt động trong các rối loạn thần kinh và não người lớn. Biên giới trong khoa học thần kinh phân tử, 11, 169.doi:10.3389/fnmol.2018.00169

Bieszczad, KM, Bechay, K., Rusche, JR, Jacques, V., Kudugunti, S., Miao, W., . . . Wood, MA (2015). Sự ức chế histone Deacetylase thông qua RGFP966 giải phóng độ dẻo của vỏ não cảm giác và tính đặc hiệu của sự hình thành trí nhớ. J Neurosci, 35(38), 13124-13132.doi:https://doi.org/10.1523/JNEUROSCI.0914-15.2015

Brown, MR, & Kaczmarek, LK (2011). Điều chế kênh kali và xử lý thính giác. Nghiên cứu thính giác, 279(1-2), 32-42. doi:https://doi.org/10.1016/j.heares.2011.03.004

Bychkov, ML, Vasilyeva, NA, Shulepko, MA, Balaban, PM, Kirpichnikov, MP, & Lyukmanova, EN(2018). Lynx1 ngăn chặn sự phong tỏa tiềm năng lâu dài và giảm biểu hiện bộ điều biến thần kinh do kích hoạt A 1-42 và JNK gây ra. Acta Naturae, 10(3), 57-61.

Reference:1950477648n@gmail.com