Tác dụng làm trắng da và chống nếp nhăn của các hợp chất hoạt tính sinh học được phân lập từ vỏ đậu phộng bằng cách sử dụng chiết xuất hỗ trợ bằng sóng siêu âm

Liên hệ: ali.ma@wecistanche.com

Da Hye Gam 1, Ji Woo Hong 1, Jun Hee Kim 1 và Jin Woo Kim 1,2,3, *

Trừu tượng:Phương pháp luận bề mặt đáp ứng được sử dụng để tối ưu hóa các điều kiện chiết xuất có sự hỗ trợ của sóng siêu âm (UAE) nhằm tối ưu hóa đồng thời các biến phụ thuộc, bao gồm hoạt động nhặt rác DPPHradical (RSA), ức chế hoạt động tyrosinase (TAI) và ức chế hoạt động collagenase (CAI) của chiết xuất vỏ đậu phộng. Ảnh hưởng của các biến chính bao gồm thời gian chiết (5. 0 ~ 55. 0 min, X1), nhiệt độ chiết (26. 0 ~ 94. 0 ◦C , X2) và nồng độ etanol (0. 0 phần trăm ~ 99,5 phần trăm, X3) đã được tối ưu hóa. Dựa trên các giá trị thực nghiệm từ mỗi điều kiện, mô hình hồi quy bậc hai được suy ra để dự đoán các điều kiện tối ưu. Hệ số xác định (R2) của biến phụ thuộc nằm trong khoảng 0. 89 ~ 0. 96, chứng tỏ rằng mô hình hồi quy phù hợp với dự đoán. Khi dự đoán các điều kiện tối ưu của UAE dựa trên phương pháp chồng chất, thời gian chiết 31,2 phút, nhiệt độ chiết 36,6 ◦C và nồng độ etanol 93,2% đã được xác định. Trong các điều kiện này, RSA là 74,9 phần trăm, TAI là 50,6 phần trăm và CAI là 86. 8 phần trăm được dự đoán, cho thấy sự đồng ý tốt với các giá trị thử nghiệm. Một phản ứng chuỗi polymerase phiên mã ngược cho thấy chiết xuất vỏ đậu phộng làm giảm mức mRNA củatyrosinase-protein liên quan -1 và gen ma trận metalloproteinase -3 trong tế bào B 16- F 0. Do đó, chúng tôi đã xác địnhLàm trắng davà tác dụng chống nhăn của chất chiết xuất từ ​​vỏ đậu phộng ở protein cũng như mức độ biểu hiện gen, và kết quả cho thấy rằng vỏ đậu phộng là một nguyên liệu mỹ phẩm hiệu quả choLàm trắng daandanti-hiệu ứng nếp nhăn. Dựa trên nghiên cứu này, vỏ đậu phộng, được coi là một sản phẩm phụ, có thể được sử dụng để phát triển các loại thực phẩm lành mạnh, thuốc và mỹ phẩm.

Từ khóa:vỏ lạc; tối ưu hóa;Làm trắng da; chống nhăn; chất chống oxy hóa;tyrosinase; ảnh ghép; protein liên quan đến tyrosinase ở người -1 (TRP -1); ma trận metalloproteinase (MMP)

Nhấp để không phải trả tiềnsản phẩm dưỡng trắng da cistanche.

1. Giới thiệu

Melanin là một sắc tố polyme có màu nâu hoặc đen được tổng hợp từ chúng của tế bào hắc tố trong lớp biểu bì. Chức năng chính của nó là ngăn chặn tia cực tím (UV) để bảo vệ da. Ngoài ra, sự sản sinh quá mức của nó có thể gây ra các đốm sắc tố, chẳng hạn như nám da, nốt ruồi và các đốm đồi mồi [1–3]. Tyrosinase là một enzym chính xúc tác phản ứng tự oxy hóa và phản ứng trùng hợp, qua đó tyrosine được chuyển hóa thành dopaquinone thông qua dihydroxyphenylalanine và tạo ra melanin thông qua quá trình sinh tổng hợp melanin dopachromeduring [4]. Do đó, nó được sử dụng rộng rãi để làm giảm hoặc làm giảm quá trình sản xuất melanin thông qua việc ức chếtyrosinasehoạt động để tăng cường hiệu quả làm trắng của mỹ phẩm [5]. Quá trình công nghiệp hóa nhanh chóng và việc gia tăng sử dụng chlorofluorocarbons đã phá hủy nghiêm trọng tầng ôzôn bảo vệ của trái đất, do đó dẫn đến một lượngUV lớn hơn xuống mặt đất và làm lộ da. Sự gia tăng bức xạ UV này dẫn đến việc tạo ra các loại oxy phản ứng (ROS) hoạt động trong cơ thể con người, các anion suchas superoxide, hydrogen peroxide và các gốc hydroxyl. Những loài như vậy đã thúc đẩy quá trình oxy hóa liên tục của tyrosine, dẫn đến tăng sản xuất ofmelanin. Về vấn đề này, các nghiên cứu đang được tiến hành tích cực về việc ức chếtyrosinasehoạt động cũng như loại bỏ ROS để phát triểnLàm trắng daCác tác nhân [6] .Collagen là một chất nền ngoại bào chính bao gồm 90% lớp hạ bì. Collagen bảo vệ và tạo độ đàn hồi cho da và tham gia vào độ cứng cơ học của da, sức đề kháng, liên kết của các mô liên kết, tăng sinh và các tế bào biệt hóa [7]. Protein tạo nên chất nền ngoại bào, chẳng hạn như collagen, bị phân hủy bởi collagenase, chẳng hạn như ma trận metalloproteinase (MMP), gây ra nếp nhăn, giảm độ đàn hồi và chảy xệ của da [8]. Các loại MMP khác nhau được biểu hiện bằng ROShydroly hóa chuỗi collagen, mô liên kết của da và tạo ra các liên kết chéo bất thường của nó để làm tăng sự phân hủy collagen và đẩy nhanh quá trình hình thành các nếp nhăn [9]. Vì lý do này, việc ức chế sản xuất melanin và phân hủy collagen thông qua việc giảm tạo ra ROS là trọng tâm chính để làm trắng da và ngăn ngừa nếp nhăn [10] .Arbutin, axit kojic và axit linolenic, như mỹ phẩm làm trắng và retinol, gallate, andadenosine, là chất chống - Mỹ phẩm làm mờ nếp nhăn, đã được sử dụng rộng rãi trong những năm gần đây. Tuy nhiên, việc sử dụng các vật liệu này bị hạn chế do tính không ổn định của chúng khi có ánh sáng và nhiệt độ cũng như các phản ứng có hại, bao gồm kích ứng da và viêm da tiếp xúc [11]. Với sự quan tâm ngày càng tăng đối với chất chống oxy hóa tự nhiên để khắc phục những thiếu sót của các thành phần làm trắng da và chống nhăn thông thường, các chất chiết xuất từ ​​thực vật đã được tích cực sử dụng để phát triển các hợp chất hoạt tính sinh học thân thiện và an toàn cho dalàm trắngvà chống nhăn [12,13].

Có nhiều phương pháp chiết xuất hiện đang được sử dụng để chiết xuất các hợp chất hoạt tính sinh học từ thực vật. Tuy nhiên, việc chiết xuất các hợp chất có hoạt tính sinh học từ các nguồn tự nhiên, đặc biệt là thực vật, chủ yếu được tiến hành thông qua các phương pháp chiết xuất dung môi, nước nóng và Soxhlet, đã cho thấy những hạn chế khác nhau, bao gồm hiệu quả ngoại vi thấp, phân hủy thành phần, độ ổn định thấp và chi phí vận hành cao. [14]. Do đó, các phương pháp chiết xuất gần đây đã được thử nghiệm, bao gồm chiết xuất có hỗ trợ siêu âm, vi sóng và siêu tới hạn [15]. Đặc biệt, sóng siêu âm là sóng âm có tần số khoảng 20 kHz trở lên, dẫn đến nén, tạo bọt và hóa lỏng chất lỏng, do đó tối đa hóa chuyển động của phân tử trong thời gian ngắn để thu được hiệu quả chiết xuất cao [16]. Hơn nữa, siêu âm có ưu điểm là thời gian rút ngắn văn bản của nó giảm thiểu sự phân hủy của các hợp chất hoạt tính sinh học và nó được đánh giá là một phương pháp hiệu quả để chiết xuất các thành phần tự nhiên với chất chống oxy hóa,làm trắng, và các đặc tính làm mờ nếp nhăn từ nhiều loại thực vật và thảo mộc [17]. Tối ưu hóa điều kiện chiết xuất là điều cần thiết để tăng hiệu quả của quá trình chiết xuất có sự hỗ trợ của sóng siêu âm (UAE) và quá trình tối ưu hóa có thể được thực hiện bằng phương pháp thực nghiệm hoặc phương pháp thống kê. chỉ một yếu tố tại một thời điểm, có những hạn chế trong việc xác định các hiệu ứng tương tác nếu nó là một thử nghiệm đa biến. Mặt khác, RSM cung cấp thông tin thống kê về mối tương quan giữa các biến trong các thử nghiệm đa biến, cùng với các thử nghiệm hiệu quả sử dụng số lượng mẫu tối thiểu, cũng như các kỹ thuật thống kê và toán học quan trọng để đánh giá tính hiệu quả và tính phù hợp của mô hình hồi quy. các thiết kế RSM khác nhau, chẳng hạn như thiết kế giai thừa đầy đủ, thiết kế Box-Behnken và thiết kế tổng hợp trung tâm (CCD), đã được sử dụng rộng rãi. Trong số đó, CCD rất hiệu quả và do đó cung cấp nhiều thông tin về ảnh hưởng của các biến thử nghiệm và sai số thử nghiệm tổng thể, với số lần chạy yêu cầu tối thiểu [18]. Do đó, trong nhiều nghiên cứu hiện có, CCD đã được sử dụng rộng rãi để phát triển, cải tiến và tối ưu hóa quá trình điều kiện để chiết xuất các chất chống oxy hóa khác nhau và các chất chuyển hóa khác từ các sản phẩm tự nhiên.

Lạc (Arachis hypogaea) là cây hàng năm thuộc họ đậu. Nó được trồng ở hơn 50 quốc gia trên thế giới, bao gồm Hàn Quốc, Ấn Độ, Trung Quốc và Hoa Kỳ [19]. Đậu phộng là nguồn giàu protein (25 phần trăm), lipid (47 phần trăm) và carbohydrate (16 phần trăm), cũng như khoáng chất, vitamin, niacin, axit béo không bão hòa và axit andoleic [20]. Chúng được tiêu thụ dưới dạng các sản phẩm chưa qua chế biến hoặc đã qua chế biến, bao gồm hạt dẻ, bơ và dầu ăn. Người ta ước tính rằng sản lượng đậu phộng hàng năm của thế giới lên tới 4,1 triệu tấn và vỏ của đậu phộng chiếm 35% ~ 40% tổng trọng lượng của đậu phộng [21]. Người ta ước tính rằng hơn 1,5 triệu tấn vỏ đậu phộng bị loại bỏ hàng năm dưới dạng phụ phẩm. Tuy nhiên, do chỉ một phần vỏ đậu phộng được sử dụng làm thức ăn gia súc và hầu hết chúng được đốt hoặc chôn lấp, gây ra chi phí tiêu hủy và các vấn đề môi trường, nên cần phải sản xuất nguyên liệu có giá trị gia tăng cao bằng cách sử dụng vỏ đậu phộng để khắc phục vấn đề phụ phẩm [22 ]. Các nghiên cứu trước đây về chất chống oxy hóa đã chỉ ra rằng các hoạt động chống viêm và chống béo phì của chiết xuất vỏ đậu phộng đã được báo cáo [23,24]. Tuy nhiên, cho đến nay vẫn chưa có nghiên cứu nào sản xuất các nguyên liệu mỹ phẩm chức năng để cải thiệnlàm trắngvà tác dụng chống nếp nhăn nhờ sử dụng các hợp chất hoạt tính sinh học từ vỏ đậu phộng. Do đó, nghiên cứu này đã tách các hợp chất có hoạt tính sinh học từ vỏ đậu phộng bằng cách sử dụng phân tích siêu âm hỗ trợ (UAE) để xác nhận tác dụng chống oxy hóa, làm trắng và chống nhăn của chúng, đồng thời đưa ra một điều kiện tối ưu của UAE bằng cách sử dụng phương pháp bề mặt phản ứng (RSM) và tăng chức năng của chất chiết xuất để xác nhận khả năng sử dụng nó làm thực phẩm, mỹ phẩm và thành phần y tế.

2. Kết quả và thảo luận

2.1. Phù hợp với các mô hình RSM

Trong nghiên cứu này, nhiệt độ chiết, thời gian chiết và nồng độ etanol được chọn làm các biến chính của CCD bằng cách sử dụng kinh nghiệm sơ bộ một nhân tố tại một thời điểm để xác định các biến có ý nghĩa ảnh hưởng đến UAE (Bảng 1).

Sau đó, 17 lần chạy thử nghiệm đã được xây dựng, bao gồm 3 lần lặp lại ở điểm trung tâm bằng cách sử dụng các biến 3- và 5 CCD cấp. Các sai số thử nghiệm được giảm thiểu bằng cách ngẫu nhiên hóa thứ tự thử nghiệm để giảm thiểu tác động của sự biến thiên không giải thích được.tyrosinaseức chế hoạt động (TAI), và ức chế hoạt động collagenase (CAI) là bảng 2.

Để xác định mối tương quan giữa 17 lần chạy thử nghiệm của các điều kiện thực nghiệm CCD và kết quả thực nghiệm, nhiều mô hình hồi quy đã được đề xuất để dự đoán mức tối ưu của 3 biến này. Bằng cách áp dụng nhiều phân tích hồi quy vào dữ liệu thực nghiệm, các biến phụ thuộc (Y) và các biến được kiểm tra có liên quan với nhau bằng các phương trình hồi quy bậc hai sau đây (Bảng 3).

Phân tích phương sai (ANOVA) là một bài kiểm tra thống kê để phân tích dữ liệu thực nghiệm. Nó chia tổng biến động trong tập dữ liệu thành các phần thành phần có liên quan đến các nguồn biến đổi cụ thể để kiểm tra giả thuyết về các biến của trình mô hình để ước tính các thành phần phương sai [25]. Phân tích bề mặt phản ứng và ANOVA đã được triển khai để xác định các hệ số, đánh giá ý nghĩa thống kê của các thuật ngữ mô hình và phù hợp với các mô hình toán học của dữ liệu thử nghiệm nhằm tối ưu hóa vùng tổng thể cho các biến phản hồi [26]. Như được thiết lập bởi mô hình, các hệ số tương quan (R2) được sử dụng để xác định mối quan hệ giữa các phản hồi thử nghiệm và dự đoán bằng mô hình hồi quy nằm trong khoảng 0. 8862 ~ 0. 9622. Điều này cho thấy rằng các biến quá trình được phân tích giải thích hơn 88,6% các biến độc lập. Phần mềm Design-Expert được sử dụng để tính toán các hệ số của phương trình hồi quy bậc hai và tính phù hợp của mô hình đã được ANOVA kiểm tra. Theo hệ số đơn thức, giá trị của các phương trình hồi quy bậc hai được liệt kê trong Bảng 4 và thứ tự ưu tiên giữa ảnh hưởng chính của các biến độc lập là nồng độ etanol (X3)> nhiệt độ chiết (X2)> thời gian chiết (X1).

2.2. Ảnh hưởng của các điều kiện chiết xuất đối với RSA

Bảng 2 cho thấy dữ liệu thực nghiệm của RSA theo các điều kiện khác nhau của UAE. RSA của chiết xuất vỏ đậu phộng được xác định trong khoảng 7,6% ~ 89,9%. RSA cao nhất được xác định trong các điều kiện chiết xuất sau: thời gian chiết là 55. 0 phút, nhiệt độ chiết là 6 0. {{1 0}} ◦C và nồng độ etanol là 5 0. 0 phần trăm (Chạy số 1 0). RSA thấp nhất là 7,6 phần trăm, trong thời gian chiết 3 0. 0 phút, nhiệt độ chiết 60,0 ◦C và nồng độ etanol là 0,0 phần trăm, được xác định là giá trị thử nghiệm (Chạy # 13) . Bằng cách áp dụng phân tích hồi quy bội, dữ liệu thử nghiệm và phản hồi có liên quan với nhau theo phương trình hồi quy bậc hai (Bảng 3). Phân tích thống kê cho thấy R2 của mô hình phạm vi là 0,9308 (p=0. 0027), điều này chỉ ra rằng phương trình này có thể giải thích 93,0 phần trăm kết quả điều kiện thực nghiệm, ngụ ý rằng mô hình có ý nghĩa cao và có thể được sử dụng để dự đoán chính xác chức năng phản hồi.

Ảnh hưởng của một biến UAE riêng lẻ ở các mức cố định của các biến khác đối với RSA được dự đoán và thể hiện trong Hình 1a. RSA có xu hướng tăng và sau đó giảm khi tất cả các biến UAE đều tăng. Nồng độ ethanol có ảnh hưởng lớn nhất đến RSA trong số ba biến UAE, trong khi thời gian chiết xuất và nhiệt độ chiết xuất có ảnh hưởng ít nhất đến RSA. Kết quả này phù hợp với kết quả ANOVA trong đó nồng độ etanol cho thấy ảnh hưởng đáng kể hơn (p=0. 0 002) trên RSA như được thể hiện trong Bảng 4. Ảnh hưởng tương hỗ giữa các biến độc lập trên RSA được hiển thị bằng 3D bề mặt phản hồi. Nhiệt độ chiết và thời gian chiết được thay đổi đồng thời ở mức cố định của nồng độ etanol (Hình 2A). Khi hai biến số (nhiệt độ bên ngoài và thời gian) tăng lên, RSA tăng đến mức tối đa và sau đó giảm độ bền. RSA cao nhất thu được ở nhiệt độ chiết 56,1 ◦C, do đó gợi ý việc chiết xuất các hợp chất hoạt tính sinh học có tiềm năng chống oxy hóa, suchas polyphenol, tăng lên khi phá hủy các thành phần của thành thực vật, chẳng hạn như lignin, ở nhiệt độ lên đến 56,1 ◦C; tuy nhiên, ở nhiệt độ cao hơn, RSA bị giảm song song với sự phân hủy hoặc trùng hợp của các thành phần chống oxy hóa. Hình 2B, C cho thấy rằng RSA không bị ảnh hưởng đáng kể bởi thời gian hoặc nhiệt độ chiết, trong khi RSA bị ảnh hưởng đáng kể bởi nồng độ etanol, cao nhất ở nồng độ etanol 61,0% và nó cũng giảm trở lại. Kết quả này phù hợp với kết quả của thí nghiệm chiết xuất trong nước nóng của Lespedeza cuneata của Kim et al. trong đó RSA bị ảnh hưởng bởi nồng độ etanol nhiều hơn là nhiệt độ chiết, và RSA là tối đa ở khoảng nồng độ etanol 60% ~ 70% [27]. Những kết quả này cho thấy rằng hiệu quả chiết xuất của dung môi nhị phân (nước và etanol) là hiệu quả hơn khi chiết xuất bằng dung môi đơn lẻ ở UAE đối với vỏ đậu phộng.

2.3. Ảnh hưởng của các điều kiện khai thác đến TAI

Tyrosinaselà một loại enzyme thúc đẩy sản xuất melanin bằng cách oxy hóa tyrosinein ở lớp đáy của biểu bì và sự ức chế của enzyme này là cần thiết cho sự phát triển củaLàm trắng da [28]. The TAI of peanut shell extracted via UAE, according to 17 extraction conditions, ranged from 0.34% to 51.8% (Table 2). Based on experimental values, the relationship between independent variables (X1, X2, X3) and the dependent variable (TAI) was modeled using quadratic regression equations as shown in Table 3. To evaluate the agreement between the experimental and predicted values derived by the quadratic regression models, the goodness-of-fit of the model was evaluated based on ANOVA. The R2 was 0.9622, which is close to 1 and indicates a high degree of correlation between the experimental and predicted values. p-value is used as a tool to evaluate the significance of each coefficient and interactions between each independent variable. The UAE variables will be more significant if the p-value becomes smaller and significance was confirmed at the level of p < 0.05 [29,30]. In evaluating the effects of independent variables, the significance was determined in the order of ethanol concentration (p < 0.0001) >nhiệt độ chiết (p <{{0}}. 0598)> thời gian chiết (p <0,4329), xác nhận rằng ảnh hưởng của nồng độ etanol là đáng kể nhất trong TAI.

Để so sánh ảnh hưởng của các điều kiện UAE lên TAI, biểu đồ nhiễu loạn đã được sử dụng để đánh giá tác động của các biến riêng lẻ lên TAI bằng cách cố định hai biến tại điểm trung tâm. Như trong Hình 1b, TAI cho thấy một mẫu khác so với RSAexperiment trước đó; nó tăng lên khi nồng độ etanol tăng lên, trong khi thời gian chiết xuất không ảnh hưởng đáng kể đến TAI. Sự gia tăng tỷ lệ đáng kể của TAI với nồng độ etanol có thể được giải thích bằng kết quả ANOVA. TAI bị ảnh hưởng đáng kể bởi thuật ngữ chính của nồng độ etanol (X3) và (p <0. 0="" 5)="" thuật="" ngữ="" bậc="" hai="" không="" có="" ý="" nghĩa="" thống="" kê,="" do="" đó,="" cho="" thấy="" mối="" quan="" hệ="" tỷ="" lệ="" thuận="" giữa="" nồng="" độ="" tai="" và="" etanol.="" đường="" cong="" bề="" mặt="" phản="" ứng="" 3d="" là="" biểu="" diễn="" đồ="" họa="" của="" phương="" trình="" hồi="" quy="" bậc="" hai="" và="" kết="" quả="" của="" tai,="" bị="" ảnh="" hưởng="" bởi="" nhiệt="" độ="" chiết="" (x1),="" thời="" gian="" chiết="" (x2)="" và="" nồng="" độ="" etanol="" (x3).="" hình="" 3a="" mô="" tả="" ảnh="" hưởng="" tương="" tác="" của="" thời="" gian="" chiết="" và="" nồng="" độ="" etanol="" đối="" với="" tai.="" kết="" quả="" xác="" nhận="" rằng="" thời="" gian="" chiết="" xuất="" không="" có="" ảnh="" hưởng="" đáng="" kể="" đến="" tai,="" trong="" khi="" nồng="" độ="" ethanol="" có="" mối="" quan="" hệ="" tỷ="" lệ="" thuận="" với="" tai.="" tương="" tự,="" như="" trong="" hình="" 3b,="" tai="" phụ="" thuộc="" nhiều="" vào="" nồng="" độ="" etanol="" hơn="" là="" nhiệt="" độ="" chiết="" và="" tai="" cao="" nhất="" đạt="" được="" khi="" nồng="" độ="" etanol="" tăng="" lên="" 99,5%.="" khi="" khám="" phá="" các="" điều="" kiện="" tối="" đa="" của="" uae,="" giá="" trị="" điều="" kiện="" tai="" tối="" đa="" được="" dự="" đoán="" là="" 3="" {{2="" 0}}.="" 0="" min,="" 26,3="" ◦c="" và="" 99,5="" phần="" trăm.="" kết="" quả="" này="" tương="" tự="" với="" kết="" quả="" được="" báo="" cáo="" bởi="" nakamura="" et="" al.="" [31]="" trong="" một="" nghiên="" cứu="" về="" hoạt="" tính="" sinh="" học="" của="" lá="" citron,="" khi="" 20,0="" phần="" trăm="" ~="" 80,0="" phần="" trăm="" etanol="" được="" sử="" dụng="" như="" một="" chất="" chiết="" xuất,="" thì="" tai="" đã="" tăng="" lên="" tương="" ứng="" với="" sự="" gia="" tăng="" nồng="" độ="" etanol="" và="" cho="" thấy="" giá="" trị="" tối="" đa="" trong="" quá="" trình="" chiết="" xuất="" bằng="" cách="" sử="" dụng="" 80="" phần="" trăm="" etanol.="" điều="" này="" cho="" thấy="" rằng="" sử="" dụng="" nồng="" độ="" etanol="" cao="" hơn="" sẽ="" có="" lợi="" trong="" việc="" chiết="" xuất="" các="" hợp="" chất="" có="" hoạt="" tính="" sinh="" học="">Làm trắng datác dụng từ vỏ đậu phộng hoặc các loại cây khác.

2.4. Ảnh hưởng của các điều kiện chiết xuất đến CAI

Collagen is the most abundant protein in mammals and the main structural component of the extracellular matrix with gly-pro-hyp repeating units longer than 1400 amino acids. Collagenase is an enzyme that breaks down peptide bonds of collagen that form skin, bones, tendons, and ligaments. The collagen present in the dermis is decomposed by collagenase, which causes skin wrinkles and reduces skin elasticity; therefore, it is necessary to reduce the activity of collagenase to prevent skin wrinkles [32,33]. The optimization of the UAE condition was performed to maximize the CAI of peanut shell extract. A total of 17 runs were needed for optimizing the three individual variables and the experimental data of CAI obtained under experimental sets were 25.2%~92.3% (Table 2). Based on the 17 experimental runs, by applying multiple regression analysis on the experimental data, response and independent variables were related by the following quadratic regression equation in terms of the coded parameters given in Table 3. Then, ANOVA was applied to determine the regression coefficients, statistical significance, and to fit the mathematical models. The mean-square values were calculated by dividing the sum of the squares of each variation source by their degrees of freedom, and a 95% confidence level (α = 0.05) was applied to determine the statistical significance in the analysis of the quadratic model. The ANOVA results confirmed that R2 of the quadratic regression equation was 0.8862 and that the p-value was 0.0134, which is less than the significance level (p < 0.05), thus indicating a good model of fit and statistical significance for predicting CAI values. In the primary term, the X2 and X3 showed significant effects and the interaction effect terms were significant in the X1X2 and X2X3 (p < 0.05). The effect of UAE conditions on CAI production was confirmed to be in the order of: extraction temperature (p = 0.0236) >nồng độ etanol (p=0. 0240)> thời gian chiết (p=0. 8505), do đó cho thấy ảnh hưởng của nhiệt độ chiết và nồng độ etanol có ý nghĩa đối với CAI.

Hình 1c cho thấy một biểu đồ nhiễu loạn trong đó hai biến được cố định và nó trực quan hóa tác động của một biến duy nhất lên CAI. Ảnh hưởng của cả ba biến lên CAI là tương tự nhau, và ba biến cho thấy tác động đáng kể và CAI tăng và sau đó giảm khi mỗi biến độc lập tăng lên. Trong nghiên cứu của chúng tôi, các đường cong phản ứng bề mặt 3D được phát triển để hình dung sự tương tác của hai biến độc lập trong CAI bằng cách sử dụng phương trình hồi quy bậc hai (Hình 4). Khi nồng độ etanol được cố định tại điểm trung tâm, ảnh hưởng của thời gian và nhiệt độ chiết đến CAI được đánh giá trong Hình 4A. Khi hai biến thay đổi đồng thời, CAI tăng lên 33,4 phút và 76,8 ◦C và giảm lại sau khi CAI tối đa là 92,8 phần trăm. Như được thể hiện trong Hình 4B, C, CAI có giá trị cao nhất ở nồng độ etanol là 64,3%, cho thấy xu hướng giảm dần sau đó, điều này cho thấy rằng dung môi nhị phân bao gồm 64,3% etanol thích hợp hơn làm dung môi chiết. Kết quả này phù hợp với nghiên cứu trước đó đã báo cáo rằng dung môi kép của nước và etanol cho thấy CAI cao hơn nước trong quá trình chiết xuất các hợp chất hoạt tính sinh học từ Orostachys japonica, điều này khẳng định rằng etanol 50% sẽ có lợi hơn trong chiết xuấtLàm trắng dathành phần [34]. CAI tối đa của dịch chiết vỏ đậu phộng được dự đoán bởi mô hình vi phạm bậc hai là 94,5%, thu được trong điều kiện thời gian chiết là 45,1 phút, nhiệt độ chiết là 93,6 ◦C và nồng độ etanol là 42,3%. CAIobtained trong nghiên cứu của chúng tôi là 94,5 phần trăm, cao hơn gấp đôi so với 39,4 phần trăm và 40,3 phần trăm giá trị CAI của chiết xuất trà xanh được báo cáo bởi Oh et al. [35].

2.5. Điều kiện chiết xuất tối ưu

Chất chống oxy hóa,Làm trắng davà tác dụng chống nhăn đều là những chức năng quan trọng đối với các chất làm đẹp và cần phải tìm ra các điều kiện để có thể tối đa hóa đồng thời ba chức năng này trong việc tối ưu hóa các điều kiện của UAE. Hình 5 cho thấy một quy trình tối ưu hóa có thể đồng thời tối đa hóa RSA (Y1), TAI (Y2) và CAI (Y3) bằng cách chồng chéo điều kiện tối ưu của một đồ thị đường bao được suy ra thông qua một phương trình hồi quy bậc hai. Biên độ của các biến độc lập để tối ưu hóa ba biến được giới hạn ở thời gian trích xuất là 5. 0 ~ 55. 0 min, nhiệt độ trích xuất là 26. {{1 0}} ~ 94 . 0 ◦C và nồng độ etanol là 0. 0 phần trăm ~ 99,5 phần trăm (Bảng 5). Theo các điều kiện chiết xuất tối ưu riêng lẻ, các điều kiện tối ưu của UAE là 31,2 phút thời gian chiết xuất, 36,6 ◦C nhiệt độ ngoại môi, 93,2% nồng độ etanol, và trong các điều kiện trên, RSA là 74,9%, TAI là 50,6% và CAI là 86. 8% đã được dự đoán. Khi các giá trị RSA, TAI và CAI được dự đoán được so sánh với các giá trị thu được từ thử nghiệm để xác thực, các giá trị từ thử nghiệm xác nhận tương tự như các giá trị được dự đoán, trong đó các giá trị tương ứng là 78,2%, 52,3% và 87,7%.

2.6. So sánh SE và UAE

Để xác nhận hiệu quả chiết xuất của UAE, chúng tôi so sánh RSA, TAI và CAI chiết xuất vỏ đậu phộng được sản xuất bằng kỹ thuật chiết xuất UAE và Soxhlet (SE). Whenthe SE được tiến hành trong các điều kiện SE chung bằng cách sử dụng 99,5 phần trăm etanol ở 7 0 ◦C trong 4 giờ thời gian chiết xuất, RSA, TAI và CAI được tìm thấy là 75,5 phần trăm, 60,2 phần trăm và 74,4 phần trăm, không khác nhiều so với kết quả thu được trong điều kiện tối ưu của UAE. so với UAE trong điều kiện tối ưu. Ưu điểm của sóng siêu âm trong sản xuất nguyên liệu hữu ích từ vỏ đậu phộng được đánh giá là quy trình phù hợp với năng suất cao và công nghiệp hóa do tiêu thụ ít dung môi và thời gian chiết xuất ngắn.

2.7. mRNA Biểu hiện của MMP -3 và TRP -1

Ở các tế bào hắc tố của động vật có vú, sự hình thành hắc tố và sự thủy phân collagen được kiểm soát tương ứng bởi các gen TRP và MMP, và TRP {0}} và MMP -3 được gọi là maingenes để điều hòa sự hình thành hắc tố và thủy phân collagen; do đó, phân tích RT-PCR trên các ly giải nguyên bào của tế bào B 16- F 0 đã được thực hiện và hiệu quả của chiết xuất vỏ đậu phộng được sản xuất từ ​​UAE trong điều kiện tối ưu (31,2 phút, 36,6 độ, 93,2 phần trăm) về biểu hiện mRNA của MMP -3 và TRP -1 đã được nghiên cứu. Như Hình 6 cho thấy, chiết xuất vỏ đậu phộng đã điều chỉnh giảm đáng kể sự biểu hiện của MMP -3 và TRP -1 trong các tế bào B 16- F 0 khi các thí nghiệm biểu hiện gen được thực hiện với đậu phộng khoảng nồng độ chiết xuất từ ​​vỏ 0 ~ 1 mg / mL. Chiết xuất vỏ đậu phộng đã làm giảm đáng kể sự biểu hiện MMP -3 và TRP -1 xuống 6. 1- lần và 8. 7- lần, tương ứng, ở mức 1. 0 mg / mL. Những kết quả này cho thấy chiết xuất vỏ đậu phộng ức chế sự phân hủy collagen trong tế bào B16F0 bằng cách bất hoạt MMP 3 đến bất hoạt MMP -1 và cản trở sự hợp tác của MMP -9 [36]. Các nghiên cứu hiện tại đã chỉ ra rằng điều trị bằng chiết xuất thực vật ức chế sự biểu hiện của yếu tố phiên mã liên quan đến vi phẫu (MITF) bằng cách phosphoryl hóa protein kinase điều hòa tín hiệu ngoại bào (ERK). Do đó, tác dụng ức chế sản xuất melanin của chiết xuất vỏ đậu phộng được cho là do ức chếtyrosinasehoạt động thông qua sự ức chế biểu hiện của ERK và MITF [37]. Do đó, chất chiết xuất từ ​​vỏ đậu phộng làm giảm mức độ biểu hiện mRNA của TRP -1 và MMP -3, điều này cho thấy rằng chiết xuất vỏ đậu phộng có các hoạt động ức chế mạnh mẽ đối với quá trình cắt dán và hình thành hắc tố khiến nó trở thành một nguyên liệu mỹ phẩm tuyệt vời vớiLàm trắng davà tác dụng chống nếp nhăn.

3. Vật liệu và Phương pháp

3.1. Vật liệu và Thuốc thử

Vỏ đậu phộng được mua từ Nonghyup mart (Gochang, Jeonbuk, Hàn Quốc) vào tháng 3 0 19 và vỏ được sấy ở 60 ◦C bằng tủ sấy khô (FC 49, Lab House, Seoul, Korea) trong 24 giờ cho đến khi khối lượng khô không đổi. Vỏ đậu phộng khô được nghiền thành bột trong máy xử lý thực phẩm (Hanil HMF -3800, Seoul, Hàn Quốc) và sau đó được đưa qua máy nghiền 600 µms. Ethanol được mua từ Samchun Chemical (95,0% v / v, Seoul, Hàn Quốc). Thuốc thử Folin – Ciocalteu, axit gallic (97%), và quercetin được mua từ Merck (Kenilworth, NJ, Hoa Kỳ). 2, 2- Diphenyl -1- picrylhydrazyl (DPPH), axit ascorbic và 3, 4- dihydroxy-L-phenylalanine (L-DOPA) đã được mua từ Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, Hoa Kỳ). Tất cả các hóa chất khác được sử dụng trong thí nghiệm này là loại phân tích và được mua từ Sigma-Aldrich. Tất cả các dung dịch gốc đều được chuẩn bị bằng nước tinh khiết khử ion bằng hệ thống lọc aMilli-Q (Millipore, Burlington, VT, USA).

3.2. Chiết xuất hỗ trợ bằng sóng siêu âm và chiết xuất Soxhlet

Vỏ đậu phộng dạng bột (1 g) được cho vào bình chiết, mỗi bình chứa 1 0 mL dung môi và được trộn bằng máy trộn xoáy (VM -10, Daihan Scientific Co., Ltd., Wonju, Hàn Quốc) để 1 phút. Quá trình chiết xuất được thực hiện bằng cách tuần hoàn nước trong máy chiết siêu âm (250 W, SD-D250H, Daihan Scientific Co., Ltd., Wonju, Hàn Quốc) sử dụng máy tuần hoàn lạnh bên ngoài (CDRC8, Daihan Scientific Co., Ltd., Wonju, Hàn Quốc ) với bộ đếm thời gian kỹ thuật số và bộ điều khiển nhiệt độ. Việc chiết xuất được thực hiện với thiết bị siêu âm được trang bị bộ đếm thời gian kỹ thuật số và bộ điều khiển nhiệt độ. Mẫu được đo âm trong thời gian và nhiệt độ khác nhau ở tần số làm việc 40 kHz. Sau đó, phần chiết tách được ly tâm ở tốc độ 10, 000 vòng / phút trong 10 phút (236R, Labogene, Seoul, Korea). Sau khi ly tâm, các thể tích mẫu được tạo thành 5 mL và được lọc qua màng lọc 0,2 µm trước khi phân tích. Đối với chiết xuất Soxhlet, vỏ đậu phộng dạng bột (5 g) được chiết liên tục với 100 mL sử dụng etanol 99,5% trong 4 h (8 chu kỳ) ở nhiệt độ amaximum là 70 ◦C trong thiết bị Soxhlet. Phương pháp ngoại vi hỗ trợ siêu âm đã được chứng minh là rất hiệu quả trong việc chiết xuất dầu từ hạt nho, nhược điểm của sóng siêu âm, so với các phương pháp chiết xuất thông thường cho cả dầu và polyphenol, là tương tự vì sản lượng dầu / polyphenol thu được khi tiêu thụ dung môi thấp hơn và thời gian ngắn hơn thời gian chiết xuất.

3.3. Thiết kế thử nghiệm

Thiết kế thử nghiệm được thực hiện bằng CCD, một loại RSM để giảm thiểu số lần chạy thử nghiệm và nghiên cứu sự tương tác giữa các yếu tố. Phần mềm TheDesign-Expert® 8. 0 (State-Ease, City, MN, USA) được sử dụng để thiết kế các thử nghiệm, phân tích dữ liệu và tối ưu hóa các điều kiện chiết xuất nhằm tối đa hóa việc chiết xuất các hợp chất hoạt tính sinh học có chất chống oxy hóa,Làm trắng da, và tác dụng chống nhăn da từ vỏ đậu phộng. Các thí nghiệm được thiết kế theo CCD, giá trị dải và điểm trung tâm của ba biến độc lập được trình bày dựa trên kết quả của các thí nghiệm sơ bộ (Bảng 1). CCD đã được áp dụng để dự đoán các điều kiện tối ưu của UAE để tối đa hóa các phản ứng bao gồm RSA, TAI và CAI từ vỏ đậu phộng. Là các biến độc lập, ba biến được chọn là thời gian ngoại lai (X1), nhiệt độ chiết (X2) và nồng độ etanol (X3). Tổng cộng 17 lần chạy thử nghiệm đã được tạo ra với ba lần lặp lại ở các điểm trung tâm để ước tính khả năng tái lập. Mô hình hồi quy bậc hai được sử dụng để phù hợp với dữ liệu thực nghiệm và được áp dụng để dự đoán các biến phản ứng, như được thể hiện trong Công thức (1):

Y= 0 cộng 1X1 cộng 2X2 cộng 3X3 cộng 11X12 cộng 22X22 cộng 33X32 cộng 12X1X2 cộng 13X1X3 cộng 23X2X3 (1)

trong đó Y là phản ứng dự đoán; 0 là hằng số (chặn); 1, 2 và 3 là các hệ số hồi quy cho các số hạng hiệu ứng tuyến tính; 11, 22 và 33 là các thuật ngữ ảnh hưởng tứ giác; và 12, 13 và 23 lần lượt là các thuật ngữ hiệu ứng tương tác. Phân tích bề mặt phản hồi và ANOVA đã được sử dụng để xác định hệ số hồi quy và ý nghĩa thống kê của các thuật ngữ mô hình và để phù hợp với các mô hình toán học của kinh nghiệm [38].

3.4. Hoạt động nhặt rác triệt để của DPPH (RSA)

RSA của chiết xuất vỏ đậu phộng được mô tả bởi Pereira-Caro et al. [39]. Solutionof 0. 0 1 mM DPPH trong metanol (95%) được chuẩn bị và 1,25 mL được thêm vào 0,25 mL dịch chiết đã pha loãng. RSA được xác định để đo độ hấp thụ ở bước sóng 517 nm bằng máy đo quang phổ UV-Viss (UV1650PC, Shimadzu, Kyoto, Nhật Bản) sau 20 phút ủ. Mẫu trắng được chuẩn bị bằng cách sử dụng nước cất và RSA được tính theo công thức bên dưới. (Công thức (2)):

RSA (phần trăm)={1 −Abs (mẫu) / Abs (kiểm soát)} × 100 (2)

3.5. Ức chế hoạt động tyrosinase (TAI)

TAI được thực hiện theo phương pháp sửa đổi sử dụng L-DOPA làm chất nền bởiJo et al. [40]. Các mẫu được trộn với 200 µL L-DOPA và 200 µL kali phosphatbuffer (pH 6,8) và 200 µLtyrosinase(125 U / mL) được thêm vào ống nghiệm và ủ ở 37 ◦C trong 20 phút. Độ hấp thụ của mẫu được đo ở bước sóng 475 nm bằng máy quang phổ UV-Vis và kết quả được so sánh với đối chứng. Đối với mỗi nồng độ, hoạt tính của enzym được tính theo phần trăm so với hoạt động của phân tích sử dụng chất đệm không có chất ức chế nào, và TAI được tính toán dựa trên biểu đồ sau. (Phương trình (3)):

TAI (phần trăm)={1 −Abs (kiểm soát) - Áp suất (mẫu) / Áp suất (kiểm soát)} × 100 (3)

trong đó Abs (kiểm soát) là độ hấp thụ của đệm cộng với collagenase; Abs (mẫu) là độ hấp thụ của đệm cộng với collagenase cộng với mẫu / chất chuẩn.

3.6. Ức chế hoạt động collagenase (CAI)

Việc đo CAI của các chất chiết được thực hiện bằng cách sửa đổi các phương pháp của Wünsch và Heindrich [41]. Chất nền, 4- phenylazobezyloxylcarbonyl-Pro-Leu-Gly Pro-Arg (FALGPA), được hòa tan trong 1 0 mL đệm đến 1,2 mg / mL và sau đó 125 µL dung dịch được thêm vào và ủ trong 60 phút ở 37 ◦C. Collagenase được hòa tan trong bộ đệm đến 0,4 mg / mL, và 75 µL dung dịch enzym được thêm vào dung dịch đệm. Hỗn hợp enzyme-cơ chất được ủ trong nồi cách thủy ở 37 ◦C trong 30 phút và quá trình phản ứng được dừng lại bằng cách thêm 75 µL axit xitric 20% (w / v). Sau khi thêm 1,5 mL etylaxetat, lớp etyl axetat được tách ra và đo độ hấp thụ ở bước sóng 320 nm. Phần trăm ức chế được tính theo công thức sau.

CAI (phần trăm)={1 - [Abs (kiểm soát) - Abs (mẫu)] / Abs (kiểm soát)} × 100 (4)

trong đó Abs (kiểm soát) là độ hấp thụ của đệm cộng với collagenase; Abs (mẫu) là độ hấp thụ ab của đệm cộng với collagenase cộng với mẫu / chất chuẩn.

3.7. Bảo trì và nuôi cấy các dòng tế bào

Tế bào hắc tố sản xuất hắc tố B 16- F 0 được lấy từ Ngân hàng Tế bào Hàn Quốc (KCLB, Chongno, Seoul, Hàn Quốc) và được nuôi cấy trong môi trường Eagle's sửa đổi của Dulbecco (DMEM, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) bổ sung huyết thanh bò thai (FBS, 10%, Welgene, Gyeongsan, Korea) và dung dịch kháng sinh penicillin-streptomycin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA). Trypsin-EDTA (Gibco, Grand Island, NY, USA) được sử dụng để thử nghiệm tế bào. Tất cả các vật liệu được sử dụng đều thuộc loại nuôi cấy tế bào.

3.8. Phản ứng chuỗi polymerase phiên mã ngược (RT-PCR)

RT-PCR được thực hiện để đo lường những thay đổi trong mức biểu hiện gen MMP -3 và TRP -1 được liên kết vớilàm trắngvà tác dụng chống nếp nhăn, tế bào B 16- F 0 được nuôi cấy trong đĩa 24- giếng được xử lý với các nồng độ khác nhau của chiết xuất vỏ đậu phộng trongDMEM không có huyết thanh và được ủ trong 24 giờ. Việc kiểm soát tế bào chưa được xử lý đã được duy trì trong các điều kiện tương tự như nhóm được thử nghiệm trong suốt quá trình thử nghiệm. Quá trình phân lập RNA từ tế bào được thực hiện bằng cách sử dụng Bộ tách chiết RNA đa năng AccuPrep® (Bioneer, Daejeon, Hàn Quốc). DNA bổ sung được tổng hợp bằng cách sử dụng tổng hợp AmfiRiert Platinum cDNA MasterMix (GenDEPOT, Barker, TX, USA). Phân tích RT-PCR được thực hiện bằng Hệ thống PCR cảm ứng CFX 96 (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) để xác định mức mRNA. Các đoạn mồi được sử dụng như sau: MMP -3 sense, {{1 0}} AGTTTGGTGTCGCGGAGCAC -30 và antisense, 50- TACATGAGCGCTTCCGGCAC -30; và TRP -1 sense, 50- GCTGCAGGAGCCTTCTTTCTC 30 và antisense, 50- AAGACGCTGCACTGCTGGTCT -30. Một bộ mồi thích hợp được đề cập ở trên được sử dụng để khuếch đại các gen tương ứng bằng cách sử dụng các điều kiện chu kỳ sau: 94 ◦C trong 5 phút, tiếp theo là 25 chu kỳ ở 95 ◦C trong 5 giây, 60 ◦C trong 30 giây (forMMP -3) và 60 ◦C trong 30 giây (đối với TRP -1) và 72 ◦C trong 30 giây kéo dài. Các sản phẩm PCR được điện hóa trên gel agarose 1%, nhuộm bằng ethidium bromide, và được hình ảnh hóa bằng cách sử dụng phần mềm Gel Doc TM XR plus System and Quantity One 2.0 (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Một protein giữ nhà, -actin, được sử dụng như một chất kiểm soát tải với giả định rằng mức độ biểu hiện của các protein này không đổi.

4.Kết luận

Trong nghiên cứu này, phương pháp bổ sung được sử dụng để thu hồi và sử dụng các chất có hoạt tính sinh học từ phụ phẩm nông nghiệp của vỏ đậu phộng để phát triển các thành phần có giá trị gia tăng với nhiều mục đích sử dụng. Trước hết, chúng tôi đã cố gắng tăng hiệu quả ngoại vi của các hợp chất hoạt tính sinh học với tác dụng chống oxy hóa, làm trắng da và chống nhăn bằng cách tối ưu hóa quy trình UAE. Do đó, nghiên cứu này đã sử dụng UAE để sản xuất hiệu quả các hợp chất hoạt tính sinh học vớiLàm trắng davà hiệu ứng chống nhăn vỏ băng giá và áp dụng tối ưu hóa dựa trên thống kê để tối đa hóa RSA, TAI và CAI đồng thời. Các điều kiện của UAE đã được tối ưu hóa bằng cách sử dụng CCD và nó đã được khẳng định rằng việc lựa chọn dung môi và nồng độ cần được xem xét trong quá trình chiết xuất các hợp chất có hoạt tính sinh học từ vỏ đậu phộng. Bằng cách chồng lên các bề mặt phản ứng, các đường cong của các biến phụ thuộc, thời gian chiết 31,2 phút, nhiệt độ chiết 36,6 ◦C, nồng độ andetanol 93,2% được xác định là các điều kiện tối ưu của UAE. Người ta đã xác nhận rằng RSA của chất chiết xuất từ ​​vỏ đậu phộng là rất cao và có thể được dự kiến ​​sẽ tăng lên ở TAI và CAI, là những chỉ số vềLàm trắng davà tác dụng chống nếp nhăn, tương ứng. Việc tối ưu hóa các điều kiện của UAE đã xác nhận sự gia tăng sản xuất các chất hoạt tính sinh học trong vỏ đậu phộng, và các hoạt động làm trắng và chống nhăn của chiết xuất vỏ đậu phộng thông quatyrosinasevà giảm điều chỉnh hoạt động collagenase. Dựa trên điều này, tác động của vỏ đậu phộng đối với mức độ biểu hiện của MMP và TRP được đánh giá để đánh giá xem chúng có tác dụng làm trắng và chống nếp nhăn ở cấp độ biểu hiện gen hay không. các biểu hiện mRNA cũng như sự ức chế các biểu hiện protein của MMP -3 và TRP -1. Do đó, chiết xuất vỏ đậu phộng đã được chứng minh là có hiệu quảlàm trắngvà cải thiện nếp nhăn ở mức độ biểu hiện protein và gen. Chiết xuất vỏ đậu phộng, sử dụng UAE, có hoạt tính chống oxy hóa cao và tác dụng làm trắng da và chống nhăn tuyệt vời, mang lại cho vỏ đậu phộng tiềm năng to lớn như một loại mỹ phẩm tự nhiên và thực phẩm. Hơn nữa, người ta tin rằng việc sản xuất các hợp chất hoạt tính sinh học bằng cách sử dụngUAE có thể được áp dụng cho quá trình thương mại hóa sản xuất mỹ phẩm, thực phẩm và dược liệu, do năng suất sản xuất cao hơn và giảm chi phí chế biến so với các quy trình thông thường.